胡彥婷，汪瑜，熊德建，黃歆，楊云戟，羅梅懿，張霞

作者單位：1成都市第七人民醫(yī)院，a骨科，b護(hù)理部，四川 成都610041；

2四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院、四川省人民醫(yī)院特需門診，四川 成都610072

股骨頭缺血性壞死（osteonecrosis of the femoral head，ONFH）是一種常見骨科疾病，致殘率極高。導(dǎo)致ONFH的病因較多，而激素性股骨頭缺血性壞死（SANFH）最為常見，占總發(fā)病率的57%［1］。SANFH與成骨細(xì)胞及破骨細(xì)胞的分化和凋亡密切相關(guān)，但具體機(jī)制仍不明確。近年來有研究發(fā)現(xiàn)，骨保護(hù)蛋白/核因子-κB受體活化因子配基/核因子-κB受體活化因子（OPG/RANKL/RANK）信號(hào)通路能夠調(diào)控破骨細(xì)胞的分化、增殖和凋亡，在SANFH中發(fā)揮重要作用［2］。

阿托伐他汀是傳統(tǒng)降脂藥［3］。有研究發(fā)現(xiàn)阿托伐他汀能夠通過調(diào)控基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）/基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制劑（TIMPs）系統(tǒng)，改善醋酸潑尼松龍誘導(dǎo)的大鼠激素性股骨頭壞死［4］。葛根素是從中藥葛根中提取分離的一種單體，具有提高免疫、保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞、抗腫瘤和抗氧化等多種藥理活性，被廣泛應(yīng)用于臨床［5］。本研究于2018年8—10月通過探究阿托伐他汀聯(lián)合葛根素對SANFH模型大鼠的治療效果及可能的作用機(jī)制，為臨床治療SANFH提供新方法和新思路。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 50只SD雄性大鼠，12周齡，體質(zhì)量范圍為400～450 g，購于成都達(dá)碩生物科技有限公司，醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào)：20190078，使用許可證號(hào)：SYXK（川）2018-119。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。本研究符合一般動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理學(xué)原則。

1.1.2主要試劑及藥物 總RNA提取試劑盒，購于索萊寶生物公司（中國）；PrimeScriptTMRT reagent Kit和SYBR Premix Ex TaqTMII試劑盒購于TaKaRa公司（中國）；RANK、RANKL、OPG和腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6（TRAF-6）抗體及對應(yīng)二抗購于Abcam公司（美國）；大鼠酶聯(lián)免疫吸附劑測定（ELISA）試劑盒購于上海鑫樂生物科技有限公司（中國）；RANK、RANKL和β-肌動(dòng)蛋白（β-actin）引物由上海生物工程股份有限公司合成。葛根素和脂多糖購于Sigma公司（美國）；阿托伐他汀和甲強(qiáng)龍，購于輝瑞公司（美國）；DNA斷裂的原位末端標(biāo)記（TUNEL）凋亡試劑盒購于碧云天生物公司（中國）。

1.1.3主要儀器 臺(tái)式低速離心機(jī)（TDZ4-WS）購于長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司（中國）；酶標(biāo)儀購于賽默飛世爾儀器有限公司（中國）；實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）儀購于Thermo Fisher公司（美國）；全自動(dòng)組織脫水機(jī)（TSJ-Ⅱ）購于常州中威電子儀器有限公司（中國）。

1.2方法

1.2.1SANFH模型的建立 50只SD雄性大鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法分為五組，分別為空白組、模型組、阿托伐他汀組、葛根素組、聯(lián)合用藥組，每組10只。模型組及藥物組大鼠腹腔注射20 μg/kg脂多糖2次，兩側(cè)臀肌注射40 mg/kg甲強(qiáng)龍3次，所有藥物每次間隔24 h。脂多糖末次注射結(jié)束后，將葛根素（400 mg/kg）和阿托伐他?。?0 mg/kg）灌胃給予相應(yīng)組別大鼠，每天1次，連續(xù)8周。

1.2.2ELISA檢測血清中堿性磷酸酶（ALP）和轉(zhuǎn)化生長因子β1（TGF-β1） 給藥結(jié)束后，采集各組大鼠血液，3 000 r/min離心收集血清，參照ELISA試劑盒說明書檢測各組ALP和TGF-β1的含量。

1.2.3組織病理學(xué)檢測 給藥結(jié)束后，取各組大鼠股骨頭組織，部分固定于多聚甲醛，部分保存于液氮中。多聚甲醛固定7 d后進(jìn)行脫水脫鈣處理，二甲苯透明，常規(guī)石蠟包埋和切片。部分切片用蘇木精-伊紅（HE）進(jìn)行染色，觀察股骨頭組織病理變化。

1.2.4細(xì)胞凋亡染色觀察 取部分切片用TUNEL凋亡試劑盒進(jìn)行染色。細(xì)胞核為棕黃色即是陽性。

1.2.5qPCR檢測 使用總RNA提取試劑提取大鼠股骨頭組織總RNA，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScript?RT reagent Kit進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，制備互補(bǔ)DNA（cDNA），各cDNA樣品分別用相應(yīng)引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，引物序列見表1。反應(yīng)體系12.5 μL：SYBR Premix Ex TaqTMII 6.25 μL、正向引物0.5 μL、反向引物0.5 μL、雙蒸水4.25 μL、cDNA 1 μL。反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性 3 min；95℃變性10 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，25個(gè)循環(huán)。以β-actin mRNA水平作為內(nèi)參。以2-ΔΔCt法計(jì)算股骨頭組織RANK和RANKL mRNA表達(dá)情況。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）反應(yīng)引物序列

1.2.6蛋白質(zhì)印跡法（Western Blot）檢測 取同側(cè)股骨頭低溫研磨，用RIPA裂解液低溫提取總蛋白，BCA法測定總蛋白量。每4微升蛋白質(zhì)樣品加入1 μL十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）蛋白上樣緩沖液（5×）的比例，混合蛋白質(zhì)樣品和緩沖液，煮沸5 min，樣品于-20°C保存?zhèn)溆?。使用等量蛋白質(zhì)上樣，選擇10%的SDS-PAGE進(jìn)行分離，分離后的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜（PVDF膜）上，用5%的脫脂奶粉封閉1 h，封閉結(jié)束后結(jié)合一抗（OPG、RANK、RANKL、TRAF-6和β-actin均按1∶400稀釋），4℃孵育過夜后等滲緩沖鹽溶液（TBST）清洗，然后二抗IgG（稀釋比例均為1∶5 000）室溫孵育1 h，TBST清洗，化學(xué)發(fā)光試劑ECL暗室顯色。顯色后的蛋白使用Bio-Rad全功能成像系統(tǒng)采集圖像，Image-ProPlus分析光密度，以β-actin為內(nèi)參，計(jì)算大鼠股骨頭組織中OPG、RANK、RANKL、TRAF-6蛋白相對表達(dá)量。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法用SPSS 20.0分析，結(jié)果以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1大鼠血清中ALP和TGF-β1比較結(jié)果與空白組比較，模型組大鼠血清中ALP含量升高（P＜0.01），TGF-β1含量降低（P＜0.01）；與模型組比較，三個(gè)藥物組大鼠血清中ALP均降低，其中阿托伐他汀組和聯(lián)合用藥組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；三個(gè)藥物組TGF-β1均增加，其中聯(lián)合用藥組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見表2。

2.2組織病理觀察結(jié)果各組大鼠股骨頭HE染色結(jié)果如圖1所示。空白組可見骨膜光滑，軟骨細(xì)胞排列整齊，骨小梁完整，骨小梁中的骨細(xì)胞清晰，骨髓中造血細(xì)胞豐富，脂肪細(xì)胞相對較少，形態(tài)正常；模型組骨小梁、骨細(xì)胞、軟骨下血管、造血細(xì)胞數(shù)量均減少，脂肪細(xì)胞體積增大，血管減少；阿托伐汀組、葛根素組與聯(lián)合用藥組均有明顯改善，其中，聯(lián)合用藥組的軟骨細(xì)胞排列整齊，骨小梁致密，骨細(xì)胞排列整齊均勻，骨髓腔內(nèi)有大量造血細(xì)胞，脂肪細(xì)胞分布均勻，血管較多。

表2 各組大鼠血清中的相關(guān)因子/±s

表2 各組大鼠血清中的相關(guān)因子/±s

注：ALP為堿性磷酸酶，TGF-β1為轉(zhuǎn)化生長因子β1。與空白組比較，aP＜0.01；與模型組比較，bP＜0.01

TGF-β1/（ng/mL）47.12±2.41 37.74±2.68a 39.84±2.98 39.23±3.47 44.12±2.42b 19.030＜0.001組別空白組模型組阿托伐他汀組葛根素組聯(lián)合用藥組F值P值鼠數(shù)10 10 10 10 10 ALP/（IU/L）25.23±1.24 31.86±1.23a 29.09±1.37b 30.75±2.07 26.96±1.54b 31.827＜0.001

2.3TUNEL法檢測細(xì)胞凋亡情況TUNEL法染色結(jié)果如圖2所示，空白組骨小梁和骨髓中凋亡率為（1.06±0.14）%；模型組骨小梁和髓腔內(nèi)均可見大量陽性細(xì)胞，凋亡率為（22.37±3.71）%，阿托伐他汀組、葛根素組和聯(lián)合用藥組骨小梁和骨髓中也可見陽性細(xì)胞，但均明顯少于模型組，凋亡率分別為（8.22±1.41）%、（11.41±1.72）%和（4.01±0.68）%（F＝88.434，P＜0.001）。與空白組相比，模型組大鼠的細(xì)胞凋亡指數(shù)明顯升高；與模型組相比，三個(gè)藥物組的細(xì)胞凋亡指數(shù)均降低（均P＜0.001），其中聯(lián)合用藥組的凋亡指數(shù)變化最明顯。

2.4qPCR檢測結(jié)果與空白組相比，模型組、阿托伐他汀組和葛根素組大鼠的RANKL mRNA表達(dá)量均升高（P＜0.01），RANK mRNA表達(dá)量降低（P＜0.01或P＜0.05）。與模型組相比，聯(lián)合用藥組大鼠的 RANKL mRNA表達(dá)量降低（P＜0.01），RANK mRNA表達(dá)量升高（P＜0.05），見表3。

表3 各組大鼠股骨頭組織中相關(guān)基因的表達(dá)量/± s

表3 各組大鼠股骨頭組織中相關(guān)基因的表達(dá)量/± s

注：RANKL為核因子-κB受體活化因子配基，RANK為核因子-κB受體活化因子。與空白組比較，aP＜0.01，cP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.01，dP＜0.05

RANK 1.00±0.08 0.53±0.03a 0.63±0.07a 0.66±0.27c 0.78±0.08d 5.552 0.013組別空白組模型組阿托伐他汀組葛根素組聯(lián)合用藥組F值P值鼠數(shù)10 10 10 10 10 RANKL 1.00±0.08 1.92±0.34a 1.70±0.11a 1.65±0.20a 1.20±0.14b 11.336＜0.001

2.5蛋白質(zhì)印跡法檢測結(jié)果蛋白質(zhì)印跡法檢測結(jié)果如圖3和表4所示，與空白組相比，模型組、阿托伐他汀組、葛根素組和聯(lián)合用藥組大鼠股骨組織中OPG表達(dá)量均降低（P＜0.01）；模型組、阿托伐他汀組、葛根素組大鼠股骨組織RANK表達(dá)量均降低（P＜0.01），而RANKL表達(dá)量和TRAF-6蛋白表達(dá)量均升高（P＜0.01）；同模型組相比，三個(gè)藥物組大鼠股骨組織中OPG和RANK含量升高（P＜0.01），RANKL和TRAF-6降低，且聯(lián)合用藥組變化最明顯。

圖3 各組大鼠股骨頭中相關(guān)蛋白表達(dá)情況（蛋白質(zhì)印跡法）：A為空白組，B為模型組，C為阿托伐他汀組，D為葛根素組，E為聯(lián)合用藥組

表4 各組大鼠股骨頭組織中相關(guān)蛋白含量/±s

表4 各組大鼠股骨頭組織中相關(guān)蛋白含量/±s

注：OPG為骨保護(hù)蛋白，RANK為核因子-κB受體活化因子，RANKL為核因子-κB受體活化因子配基，TRAF-6為腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6。與空白組比較，aP＜0.01；與模型組比較，bP＜0.05，cP＜0.01

TRAF-6 1.00±0.04 1.82±0.05a 1.67±0.05a 1.59±0.24ab 1.14±0.10c 25.096＜0.001組別空白組模型組阿托伐他汀組葛根素組聯(lián)合用藥組F值P值鼠數(shù)10 10 10 10 10 OPG 0.95±0.06 0.54±0.02a 0.64±0.04ab 0.64±0.02ab 0.84±0.05ac 55.969＜0.001 RANK 0.99±0.04 0.56±0.08a 0.71±0.02ac 0.75±0.05ac 0.92±0.06c 29.214＜0.001 RANKL 1.04±0.07 1.64±0.05a 1.42±0.07ac 1.41±0.05ac 1.18±0.13c 25.269＜0.001

3 討論

脂肪代謝紊亂、血管內(nèi)凝血、骨質(zhì)疏松等多種因素都會(huì)導(dǎo)致SANFH。近些年來隨著糖皮質(zhì)等激素治療在臨床上多種疾病中的廣泛應(yīng)用，SANFH發(fā)病率大增，已居非創(chuàng)傷性股骨頭壞死首位。關(guān)節(jié)置換技術(shù)往往導(dǎo)致病人產(chǎn)生較大的痛苦，加之費(fèi)用昂貴，因此，采用藥物干預(yù)進(jìn)行保股骨頭的治療方法依然是治療SANFH的首選。

阿托伐他汀是三羥基三甲基輔酶A（HMG-CoA）還原酶抑制劑，因具有較好的降脂和抗凝效果被廣泛應(yīng)用于臨床［6］。葛根素是一種黃酮類藥物。鄧銀栓等［7］研究發(fā)現(xiàn)，葛根素能夠刺激成骨細(xì)胞的增殖，提高成骨細(xì)胞的分化早期標(biāo)志物ALP的活性。阿托伐他汀和葛根素分別單獨(dú)使用都具有治療SANFH的作用，兩種藥物聯(lián)合使用也被用于治療糖尿病腎病、不穩(wěn)定性心絞痛、冠心病和頸動(dòng)脈粥樣硬化等疾病，但阿托伐他汀聯(lián)合葛根素能否增強(qiáng)其對SANFH的治療效果，目前還沒有被報(bào)道。

ALP能夠水解有機(jī)磷酸酯，破壞鈣化抑制劑，參與了調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞的增殖、分化及遷移，是成骨細(xì)胞早期分化的標(biāo)記基因［8］。TGF-β1是一種多功能蛋白多肽類生長因子，能刺激成骨細(xì)胞增殖、分化，促進(jìn)骨形成，并且可抑制骨吸收，是參與骨代謝過程中最重要的細(xì)胞因子［9］。本研究首先用脂多糖聯(lián)合甲強(qiáng)龍建立了大鼠SANFH模型，并分別用阿托伐他汀和葛根素進(jìn)行單獨(dú)和聯(lián)合治療，發(fā)現(xiàn)模型組大鼠血清中ALP明顯升高，TGF-β1降低。HE染色發(fā)現(xiàn)模型組大鼠骨小梁、軟骨細(xì)胞和軟骨下血管均減少，脂肪細(xì)胞體積增大。TUNEL法染色發(fā)現(xiàn)模型組骨小梁和髓腔內(nèi)可見大量凋亡細(xì)胞，表明成功建立了SANFH大鼠模型。阿托伐他汀和葛根素分別單獨(dú)用藥治療結(jié)果與彭小明等［10-11］報(bào)道的相一致。與模型組相比，聯(lián)合用藥組ALP、TGF-β1及凋亡指數(shù)均有變化，HE染色結(jié)果顯示大鼠軟骨細(xì)胞排列整齊，骨小梁致密，骨髓腔內(nèi)有大量造血細(xì)胞，脂肪細(xì)胞大小及分布較正常，表明阿托伐他汀聯(lián)合葛根素組治療效果最好，可以用于臨床SANFH的治療。

OPG/RANKL/RANK通路與骨質(zhì)疏松等骨科疾病聯(lián)系緊密，能直接影響破骨細(xì)胞的增殖、分化及其功能［12-14］。OPG能夠抑制破骨及其前體細(xì)胞的增殖和活化，減少骨吸收，誘導(dǎo)破骨細(xì)胞凋亡。RANKL具有誘導(dǎo)破骨細(xì)胞分化、發(fā)育、發(fā)揮功能的因子。RANK是RANKL的唯一受體［14-15］。OPG和RANK競爭性結(jié)合RANKL。RNAK的尾端上有腫瘤壞死因子受體（TNFR）相關(guān)因子（TNF receptor associated factors，TRAFs）結(jié)合位點(diǎn)，其中以TRAF-6為主。當(dāng)RANKL-RANK配體受體結(jié)合后，TRAF-6與RANKL尾部結(jié)合，進(jìn)而促進(jìn)破骨細(xì)胞的增殖、分化、成熟及激活骨細(xì)胞活性［16-19］。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)與空白組相比，模型組大鼠OPG和RANK升高，RANKL和TRAF-6降低，進(jìn)一步證明了OPG/RANKL/RANK信號(hào)通路在SANFH中被調(diào)控。阿托伐他汀和葛根素能夠下調(diào)大鼠股骨組織中OPG和RANK的表達(dá)，上調(diào)RANKL和TRAF-6的表達(dá)。且聯(lián)合用藥組變化最明顯，與模型組相比，均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明阿托伐他汀聯(lián)合葛根素可能是通過調(diào)控OPG/RANKL/RANK信號(hào)通路治療大鼠股骨頭壞死。

綜上，阿托伐他汀聯(lián)合葛根素對SANFH模型大鼠有治療作用，治療效果強(qiáng)于兩種藥物單獨(dú)使用時(shí)的效果，其作用機(jī)制可能是通過調(diào)控SANFH模型大鼠OPG/RANKL/RANK信號(hào)通路而實(shí)現(xiàn)的。

（本文圖1，2見插圖6-1）

圖1 各組大鼠股骨頭HE（蘇木精-伊紅）染色結(jié)果（×100）：A為空白組；B為模型組；C為阿托伐汀組；D為葛根素組；E為聯(lián)合用藥組

圖2 各組大鼠股骨頭TUNEL法（DNA斷裂的原位末端標(biāo)記法）染色結(jié)果（×400）：A為空白組；B為模型組；C為阿托伐汀組；D為葛根素組；E為聯(lián)合用藥組