王森 門琛 吳軍 許健 郭妍

心房顫動（atrial fibrillation，AF）簡稱房顫，是≥65 歲老年人臨床中最為常見的一種心律失常，≥80歲高齡老年人群AF的發(fā)病率高達10%［1］。AF最主要的危害是栓塞，與年輕AF 病人相比，老年AF 病人卒中和栓塞的風(fēng)險明顯增加［2-3］。且大多數(shù)老年AF持續(xù)時間較長，轉(zhuǎn)復(fù)可能性小，其最合理的治療是控制心室率和安全有效地預(yù)防血栓并發(fā)癥，因此，AF 的抗凝治療是老年AF治療的核心。

維生素K 拮抗劑華法林是經(jīng)典的口服抗凝藥物，也是目前臨床上應(yīng)用最多的抗凝藥物。盡管華法林有充足的預(yù)防卒中的證據(jù)，但臨床應(yīng)用仍然不足，這與其不可預(yù)知的藥效學(xué)、藥代動力學(xué)，狹窄的治療窗口以及劑量個體差異大等因素有關(guān)［4］。近年來，隨著藥物基因組學(xué)的深入研究和發(fā)展，發(fā)現(xiàn)華法林藥代動力學(xué)和藥效學(xué)通路上某些基因的遺傳變異可能是造成個體間華法林劑量差異的主要原因之一。華法林是R-華法林和S-華法林對映異構(gòu)物外消旋混合物，其中S-華法林的抗凝活性是R-華法林的3～5 倍，并主要經(jīng)細(xì)胞色素P450（CYP）2C9酶代謝［5］。在藥效學(xué)方面，華法林通過抑制維生素K環(huán)氧化物還原酶復(fù)合物1（VKORC1）的活性，阻礙維生素K由環(huán)氧化物轉(zhuǎn)化成氫醌，從而阻斷凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ及抗凝蛋白C和S 的活化達到抗凝的目的。近年來研究發(fā)現(xiàn)，CYP2C9及VKORC1的基因多態(tài)性是導(dǎo)致不同病人華法林給藥劑量差異的重要原因［6］。本研究通過檢測老年非瓣膜性房顫病人CYP2C9和VKORC1的基因多態(tài)性，分析不同基因型與華法林給藥劑量的關(guān)系。

1 資料和方法

1.1 研究對象 選取2016 年3 月至2018 年3 月南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院收治的40 例高齡非瓣膜性房顫且服用華法林的病人為研究對象。其中，男27 例，女13 例；年齡80～97 歲，平均（87.68±4.91）歲；BMI為16.33～31.89，平均23.07±3.58；合并基礎(chǔ)疾病：高血壓28 例，CHD 21 例，DM 11 例。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，病人均簽署知情同意書。

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）年齡≥80 歲；（2）CHADS2-VASC 評分≥2 分。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）已服用可達龍及抗PLT 藥物的病人；（2）合并嚴(yán)重感染、惡性腫瘤、血液疾病者；（3）對華法林過敏者；（4）活動性消化性潰瘍者；（5）有顱內(nèi)出血史。隨訪期間排除失訪、服藥依從性差、未定期監(jiān)測國際標(biāo)準(zhǔn)化比值（INR）、服用干擾對華法林療效判斷的藥物、發(fā)生入院治療事件、進行有創(chuàng)檢查、停用華法林等病人。

1.3 方法 根據(jù)我科前期研究［7］，對于年齡＞80 歲的人群，華法林抗凝INR值維持在1.5～2.0時安全性更好，定期監(jiān)測病人的INR。記錄病人的性別、年齡及華法林的穩(wěn)定給藥劑量。采用數(shù)字熒光分子雜交測序法檢測病人的CYP2C9 及VKORC1 基因型，并根據(jù)國際華法林藥物基因組聯(lián)合會（IWPC）公式計算出病人的華法林服用理論劑量。

1.3.1 CYP2C9及VKORC1基因型檢測：抽取病人靜脈血3～5 mL，置于EDTA 抗凝管中，3000 r/min 離心5 min，棄上清，再加入1 mL 生理鹽水重懸白細(xì)胞，3000 r/min 離心5 min，棄上清，沉淀加入30～50 μL 核酸純化試劑（耀金保），吹打混勻，室溫靜置30 min，此白細(xì)胞混懸液即可直接用于DNA 分析。取1.5 μL 耀金保處理過的白細(xì)胞混懸液，加到1 支基因測序通用試劑中（耀金分），蓋緊管蓋，充分混勻并短暫離心，裝入熒光檢測儀，啟動儀器，完成CYP2C9和VKORC1基因自動測序。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 22.0 軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，計數(shù)資料以例數(shù)（n）表示。數(shù)據(jù)呈正態(tài)分布且方差齊時，采用獨立樣本t 檢驗或ANOVA；否則采用秩和檢驗或Kruskal-Wallis H檢驗。P ＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1CYP2C9 和 VKORC1 基因型分布情況CYP2C9-1075 A/C 基因型中，野生純合子AA 型者占85%，突變雜合子CA 型者占17.5%，未發(fā)現(xiàn)突變純合子CC 型者。VKORC1-1639 A/G 基因型中，突變純合子AA 型者占82.5%，雜合子GA 型者占17.5%，未發(fā)現(xiàn)野生純合子GG型者，見表1。

表1 病人的CYP2C9和VKORC1基因多態(tài)性分布（n）

2.2 性別與華法林劑量的關(guān)系 40 例病人中，女性病人的華法林日均劑量為（2.00±0.47）mg，男性病人的華法林日均劑量為（2.16±0.75）mg，兩者比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P ＞0.05）。

2.3 CYP2C9 基因多態(tài)性與華法林劑量的關(guān)系CYP2C9-1075 AA 基因型病人的華法林理論劑量明顯高于CYP2C9-1075 CA 基因型病人，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.01）；但兩者的實際用量差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.601）。兩基因型的理論劑量與實際用量比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P ＞0.05）。見表2。

表2 CYP2C9基因型的華法林理論劑量和實際用量比較（±s，mg/d）

表2 CYP2C9基因型的華法林理論劑量和實際用量比較（±s，mg/d）

注：與CYP2C9-1075 AA型比較，**P ＜0.01

實際用量2.15±0.64 1.93±0.79 CYP2C9-1075 AA型（n=33）CA型（n=7）理論劑量2.34±0.36 1.62±0.42**

2.4 VKORC1 基因多態(tài)性與華法林劑量的關(guān)系VKORC1-1639 GA基因型病人的華法林理論劑量和實際用量均明顯高于VKORC1-1639 AA基因型病人，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.05）。兩基因型的理論劑量與實際用量比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P ＞0.05）。見表3。

2.5 CYP2C9 和VKORC1 基因組的華法林實際用量比較 CYP2C9-1075 AA＆VKORC1-1639 GA 基因型病人的華法林實際用量明顯高于CYP2C99-1075 CA＆VKORC1-1639 AA 基因型病人，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.05）；但其他組合基因型病人的華法林實際用量差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P ＞0.05），見表4。

表3 VKORC1基因型的華法林理論劑量和實際用量比較（±s，mg/d）

表3 VKORC1基因型的華法林理論劑量和實際用量比較（±s，mg/d）

注：與VKORC1-1639 AA型比較，*P ＜0.05

實際用量2.00±0.67 2.63±0.38*VKORC1-1639 AA型（n=33）GA型（n=7）理論劑量2.13±0.41 2.58±0.57*

表4 CYP2C9和VKORC1基因組的華法林實際用量比較（±s，mg/d）

表4 CYP2C9和VKORC1基因組的華法林實際用量比較（±s，mg/d）

注：與CA＆AA型比較，*P ＜0.05

實際用量2.06±0.65 1.65±0.72 2.63±0.38*2.63±0.53 CYP2C9-1075＆VKORC1-1639 AA＆AA（n=28）CA＆AA（n=5）AA＆GA（n=5）CA＆GA（n=2）

3 討論

華法林的治療窗窄、個體差異大，臨床需根據(jù)病人INR 調(diào)整劑量，反復(fù)檢測和長期劑量調(diào)整會影響病人依從性。華法林個體差異的原因包括遺傳因素和非遺傳因素（身高、體質(zhì)量和飲食等），遺傳基因多態(tài)性是華法林存在個體差異的主要因素。目前認(rèn)為，CYP2C9及VKORC1的基因多態(tài)性是導(dǎo)致不同病人華法林給藥劑量差異的重要原因［8］。

CYP2C9 基因包括3 種基因型，分別稱為野生型CYP2C9*1/*1，以及CYP2C9*2 和CYP2C9*3 兩種突變類型。在這里面*2型突變表現(xiàn)為430C→T，*3型突變表現(xiàn)為1075A→C，這兩種類型均能降低藥酶活性［9］。多項研究表明，中國人群中，未發(fā)現(xiàn)CYP2C9*2突變型者［10-11］，故本課題主要研究1075位點突變的*3型。已有研究表明，CYP2C9 突變型病人的華法林用量明顯少于野生型病人，建議對CYP2C9 突變的病人減少華法林用量［12］。本研究結(jié)果顯示，CYP2C9-1075 突變雜合子CA 型者的華法林理論劑量明顯低于野生純合子AA型者（P ＜0.01），但兩者的實際華法林用量差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.601），與既往研究結(jié)果稍有差異。這可能與本研究對象例數(shù)較少以及高齡老人華法林服用劑量的波動范圍和華法林穩(wěn)定給藥劑量遠小于普通人群有關(guān)。

VKORC1 是維生素K 代謝循環(huán)中的限速酶，其基因的多態(tài)性與華法林臨床應(yīng)用劑量個體化有關(guān)。其中VKORC1-1639 G/A位于啟動子區(qū)，其基因多態(tài)性是影響華法林給藥劑量的主要因素［13］。不同民族間VKORC1-1639 A/G 基因多態(tài)性存在著顯著的差異。本研究結(jié)果顯示，40例高齡老年病人中，82.5%的病人攜帶VKORC1-1639 AA 基因型，17.5%的病人攜帶VKORC1-1639 GA基因型，未檢測到VKORC1-1639 GG型者?？梢娢覈鳹KORC1-1639 基因中AA 型者較多，與既往研究相似［14］。VKORC1-1639 AA 是純合子突變基因型，與雜合子基因型相比，攜帶純合子突變基因型的病人需要的華法林劑量更低一些。本研究結(jié)果顯示，VKORC1-1639 GA 基因型病人的華法林理論劑量及穩(wěn)定給藥劑量均明顯高于VKORC1-1639 AA基因型病人，與既往文獻報道一致［11］。

Zhu等［15］研究結(jié)果顯示，CYP2C9和VKORC1基因多態(tài)性加上性別、年齡及體質(zhì)量等因素對華法林的影響可以解釋約50.4%～64.1%的個體用藥差異，其中單純VKORC1基因的影響可達25%。本次研究結(jié)果顯示，CYP2C9-1075 AA+VKORC1-1639 GA 基因型病人的華法林穩(wěn)定給藥劑量明顯高于CYP2C9-1075 CA+VKORC1-1639 AA 基因型病人，而其他組合基因型的華法林穩(wěn)定給藥劑量差異均無統(tǒng)計學(xué)意義，且男性病人與女性病人的華法林穩(wěn)定給藥劑量差異也無統(tǒng)計學(xué)意義。說明VKORC1-1639 G ＞A 基因突變是影響本次研究對象華法林劑量的主要因素。

綜上所述，高齡老人為了獲得最佳的治療效果并承受最低的治療風(fēng)險，有必要進行藥物基因檢測，尤其是接受VKORC1基因多態(tài)性的檢測，并將其作為華法林維持劑量的指導(dǎo)依據(jù)。本研究的不足在于樣本量較小，故下一步還需擴大樣本量，并將基因型、體質(zhì)量、年齡、身高等因素綜合考慮，為高齡老人的華法林個體化治療提供更多依據(jù)。