楊少鋒　朱立國　李兆勇　李碩夫　郭彥濤　聶穎　張晨陽

〔摘要〕 目的 研究miR-483/CREB1軸在桃葉珊瑚苷（aucubin， AU）抑制人退行性髓核（nucleus pulposus， NP）細胞胞外基質（extracellular matrix， ECM）降解中的功能作用。方法 AU處理人退行性NP細胞后，檢測細胞活性、ECM相關蛋白及cAMP反應元件結合蛋白1（cAMP responsive element binding protein 1， CREB1）的表達。實時熒光定量PCR（quantitative real-time PCR， qPCR）和Western blot檢測miR-483表達變化對CREB1豐度的影響;雙熒光素酶報告實驗（luciferase， LUC）檢測miR-483和CREB1-3'-UTR的靶向結合;CREB1過表達載體和（或）miR-483 mimics共轉染后，AU處理，檢測CREB1及ECM相關蛋白的表達。結果 AU可顯著增強NP細胞活性（P=0.000 4），抑制ECM降解酶基質金屬蛋白酶-3（matrix metalloproteinase-3， MMP-3）、血小板反應蛋白解整合素金屬肽酶-5（a disintegrin and metalloproteinase domain with thrombospondin motif-5， ADAMTS-5）與CREB1的表達，促進膠原蛋白Ⅱ型膠原α1（collagen type II alpha 1 chain， COL2A1）和miR-483的表達（P<0.001）。miR-483過表達可抑制CREB1的表達（P<0.000 1），LUC實驗表明miR-483可與CREB1-3'-UTR靶向結合。功能實驗結果表明CREB1可削弱AU對NP細胞ECM的降解的抑制作用，而miR-483可部分逆轉CREB1對AU的抑制作用。結論 AU誘導NP細胞表達miR-483，進而抑制CREB1的表達，增強NP細胞的活性，抑制ECM的降解。

〔關鍵詞〕 桃葉珊瑚苷;髓核細胞;胞外基質;cAMP反應元件結合蛋白;微小RNA

〔中圖分類號〕R285.5;R681.5? ? ? ?〔文獻標志碼〕A? ? ? ?〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2020.05.008

〔Abstract〕 Objective To study the functional role of miR-483/CREB1 axis in the inhibition of extracellular matrix （ECM） degradation in human degenerative nucleus pulposus （NP） cells by aucubin （AU）. Methods After treatment of human degenerative NP cells with AU， cell viability， ECM-related protein and cAMP responsive element binding protein 1 （CREB1） expression were measured. Quantitative real-time PCR （QPCR） and western blot were used to detect the effect of miR-483 expression on CREB1 abundance; dual luciferase reporter assay （LUC） was used to detect the targeted binding relationship between miR-483 and CREB1-3-TUR; The CREB1 overexpression vector and/or miR-483 mimics were co-transfected into NP cells， and the expression of CREB1 and ECM-related proteins was detected after AU treatment. Results AU significantly enhanced the activity of NP cells （P=0.000 4）， inhibited the expression of EMP degrading enzyme matrix metalloproteinase-3 （MMP-3） （P=0.000 3）， a disintegrin and metalloproteinase domain with thrombospondin motif-5 （ADAMTS-5） and CREB1 （P<0.000 1）， and promoted the expression of collagen type II alpha 1 chain （COL2A1） （P<0.000 1） and miR-483 （P=0.000 6）. Overexpression of miR-483 inhibited the expression of CREB1 （P<0.000 1）. LUC experiments indicated that miR-483 can bind to the CREB1-3'-UTR. Functional experiment showed that CREB1 can attenuate the inhibitory effect of AU on the degradation of ECM in NP cells， while miR-483 partially reverses the inhibitory effect of CREB1 on AU. Conclusion AU induces the expression of miR-483 in NP cells， thereby inhibiting the expression of CREB1， ultimately enhancing the activity of NP cells and inhibiting the degradation of ECM.

〔Keywords〕 aucubin; nucleus pulposus cells; extracellular matrix; cAMP responsive element binding protein 1; miRNA

椎間盤退行性病變（intervertebral disc degeneration，IDD）是椎間盤突出、下腰痛、脊柱穩(wěn)定性下降等脊柱病變的病理基礎，由此導致患者因為嚴重腰痛而勞動能力下降甚至完全喪失[1]。當前有關IDD的發(fā)病機制研究顯示，椎間盤中髓核（nucleus pulposus， NP）細胞凋亡以及胞外基質（extracellular matrix， ECM）的過度降解是導致IDD發(fā)生的主要原因[2]。

中藥杜仲（Eucommia Ulmoides Oliv.）可增強骨密度、調節(jié)骨代謝[3]，相關研究也證明其可用于治療IDD、骨質疏松癥和其他骨科疾病[4]。杜仲主要活性成分為桃葉珊瑚苷（aucubin， AU）。AU常用于治療骨關節(jié)炎[5]，并具有保護肝臟、抗炎、促進血管生成、抗氧化、促進神經(jīng)干細胞分化等多種功能[6-7]，但AU在IDD中的功能和作用機制還未見相關報道。

隨著近年來對非編碼RNA研究的日益深入，miRNA介導的轉錄后調控也被發(fā)現(xiàn)參與IDD發(fā)病過程[8]。miRNA是一種長度約22～25個核苷酸的內源性非編碼單鏈RNA，可通過與靶基因mRNA的3-UTR區(qū)互補配對形成RNA誘導沉默復合體而抑制靶基因轉錄或誘使靶mRNA降解，從而調控靶基因表達[9]。本課題組研究發(fā)現(xiàn)，以杜仲為主藥的補腎活血方可通過影響NP細胞中miR-483的表達促進NP細胞增殖和ECM重塑[10]。結合位點預測工具targetscan（www.targetscan.org/vert_72/）預測發(fā)現(xiàn)轉錄調控因子——cAMP反應元件結合蛋白1（cAMP responsive element binding protein 1， CREB1）可能是miR-483的結合靶點，因此，本項目擬進一步研究AU對NP細胞ECM重塑的影響及miR-483/CREB1軸在其中的功能作用。

1 材料與方法

1.1? 實驗材料

實驗采用的退行性NP細胞分離自湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院收治的IDD患者椎間盤組織[7]。細胞使用含有10%胎牛血清（GIBCO， USA）、鏈霉素和青霉素（Solarbio， 北京）的DMEM培養(yǎng)基（GIBCO， USA）培養(yǎng)。

miR-483 mimics/inhibitor、實時熒光定量PCR（quantitative real-time PCR， qPCR）引物及試劑均購自上海吉瑪制藥技術有限公司;基質金屬蛋白酶-3（matrixmetalloproteinase-3， MMP-3）抗體（貨號：ab52915）、血小板反應蛋白解整合素金屬肽酶-5（a disintegrin and metalloproteinase domain with thrombospondinmotif-5， ADAMTS-5）抗體（貨號：ab41037）、CREB1抗體（貨號：ab32096）、Ⅱ型膠原α1（collagen type II alpha 1 chain， COL2A1）抗體（貨號：ab34712）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase， GAPDH）抗體（貨號：ab8245）、HRP標記的羊抗兔（貨號：ab205718）或羊抗小鼠（貨號：ab205719）二抗均購自美國Abcam公司;98%AU標準品由江萊生物提供;MTT檢測試劑盒購自生工生物工程（上海）股份有限公司;雙熒光素酶報告實驗（dual luciferase reporter gene assay， LUC）試劑盒、細胞培養(yǎng)和Western blot相關試劑購自上海碧云天生物技術有限公司。

1.2? 實驗方法

1.2.1? 細胞培養(yǎng)及轉染? 將DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)的NP細胞置于37 ℃、5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。轉染時，取對數(shù)生長期的NP細胞接種至6孔細胞培養(yǎng)板，繼續(xù)培養(yǎng)至60%～70%的細胞密度，遵照Lipofectamine 2000的使用說明書，轉染miR-483 mimics。

1.2.2? MTT實驗? 使用磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline， PBS）溶解AU標準品以制備1 mmol/L的母液，再用PBS稀釋AU母液制備不同濃度的工作液。收集對數(shù)期細胞，向96孔細胞培養(yǎng)板中加入細胞懸液，并保證每孔的細胞數(shù)約為1×104個。細胞單層鋪滿孔底后加入不同濃度的AU工作液，對照組則使用等體積的PBS，孵育24～72 h，倒置顯微鏡下觀察，之后，每孔加入20 μL MTT溶液，培養(yǎng)4 h，并使用PBS漂洗。二甲基亞砜溶解后測定490 nm處的吸光值。

1.2.3? Western blot實驗? 分別使用AU（終濃度為16 μmol/L）和等體積的PBS（作為對照組）處理NP細胞，其后提取兩組細胞中的總蛋白，BCA法測定MMP-3、ADAMTS-5、CREB1、COL2A1等蛋白的濃度，其后進行SDS-PAGE、轉膜、封閉、洗膜，加入相應的蛋白一抗，4 ℃孵育12 h后洗膜，繼而加入二抗，ECL顯色，不同組別之間使用GAPDH作為內源性對照。

1.2.4? qPCR實驗? 使用TRIZOL試劑提取處于對數(shù)生長期的NP細胞中的總RNA，然后使用U6-R與miR-483-RT引物（見表1）分別進行反轉錄以獲得qPCR檢測模板。再按照程序進行qPCR反應，最后使用2-ΔΔCT的方法計算miR-483的表達水平。

1.2.5? 熒光素酶報告質粒的構建? 通過PCR擴增含有miR-483與CREB1結合位點上下游800 bp序列的CREB1基因片段到Renilla psiCHECK-2載體下游，并命名為wtCREB1熒光素酶報告質粒。其后在此基礎上設計相應的引物對結合位點進行突變（見表1），得到mutCREB1熒光素酶報告質粒。

1.2.6? LUC實驗? 取對數(shù)生長期的NP細胞接種于24孔細胞培養(yǎng)板，培養(yǎng)12 h后，轉染wt/mut CREB1熒光素酶報告質粒，同時分別轉染miR-483 mimics及mimics NC，再培養(yǎng)48 h后，使用LUC檢測試劑盒測定各組細胞中的熒光素酶相對活性。

1.3? 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

本實驗所有數(shù)據(jù)均由統(tǒng)計軟件SPSS 20.0分析處理，最終數(shù)據(jù)為3次平行重復實驗的x±s，格拉布斯準則去除逸出值后，兩兩比較，先進行方差齊性Levene檢驗，若方差齊，采用LSD-t檢驗，不齊則采用t檢驗;多組間比較采用單因素方差分析，若方差齊，使用單因素方差分析進行總均值比較，而后采用SNK法進行兩兩比較，若方差不齊，改用Welch檢驗進行總體均值比較，而后采用Dunnett T3檢驗進行兩兩比較，P<0.05則認為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1? AU最佳處理時間和濃度的選擇

分別使用0、2、8、16、32 μmol/L的AU處理退行性NP細胞24、48、72 h，其后MTT實驗檢測細胞活性。結果發(fā)現(xiàn)NP細胞的活性隨著處理時間的延長和AU濃度的增高而增強，表明AU可提高NP細胞活性。此外，對照組和不同濃度的AU處理組在48 h時，OD490值分別為0.406±0.017、0.432±0.010、0.477±0.014、0.523±0.005、0.546±0.015。統(tǒng)計分析結果顯示，48 h時16 μmol/L處理組與對照組之間存在極顯著差異（P=0.000 4，見圖1），因此選擇16 μmol/L、處理48 h為后續(xù)實驗中AU干預條件。

2.2? AU處理對NP細胞ECM降解的影響

通過Western blot實驗檢測了ECM降解酶MMP-3、ADAMTS-5和膠原蛋白COL2A1的表達變化情況，結果使用AU處理之后，MMP-3的相對表達水平從0.994±0.084下降為0.617±0.104（P=0.0003），ADAMTS-5的相對表達水平從1.037±0.099下降為0.349±0.061（P<0.000 1），COL2A1的相對表達水平從1.023±0.028增加為1.532±0.120（P<0.000 1，如圖2A、圖2B）。以上結果表明AU處理可抑制NP細胞的ECM降解過程。

2.3? AU處理對miR-483和CREB1表達的影響

其后檢測AU處理對NP細胞中miR-483和CREB1的豐度影響，結果顯示，AU處理后miR-483的表達水平發(fā)生顯著上調（P=0.000 6，如圖2C），而CREB1蛋白的表達水平發(fā)生顯著下調（P<0.000 1，如圖2A和2B）。以上結果表明miR-483和CREB1可能在AU功能行使過程中發(fā)揮著某些作用。

2.4? NP細胞中miR-483和CREB1的靶向調控關系驗證

qPCR結果顯示，轉染該mimics后，miR-483的表達上調近40倍（如圖3A）;其后通過qPCR和Western blot分別檢測轉染miR-483 mimics后NP細胞中CREB1的mRNA和蛋白水平，結果顯示，CREB1的mRNA和蛋白水平均發(fā)生極顯著下調（如圖3B和3C），表明細胞中miR-483的表達變化可影響CREB1的轉錄和翻譯。

其后通過權威在線工具targetscan預測miR-483與CREB1 mRNA之間的結合位點（如圖3D所示），并構建含有結合位點上下游800 bp的CREB1基因片段的野生型熒光報告重組載體（wt-CREB1），并在此基礎上合成和構建結合位點發(fā)生突變的突變型熒光報告重組載體（mut-CREB1）。將重組載體與miR-483 mimics共轉染進NP細胞后，發(fā)現(xiàn)miR-483 mimics可顯著抑制轉染wt-CREB1細胞的相對熒光素酶活性（P<0.000 1），而對轉染有mut-CREB1細胞的相對熒光素酶活性無影響（見圖3E）。

2.5? miR-483/CREB1軸在AU抑制NP細胞ECM降解中的作用驗證

構建CREB1過表達載體并轉染入NP細胞中進行過表達效率驗證，發(fā)現(xiàn)該載體可顯著增強細胞中CREB1mRNA豐度（如圖4A）。使用CREB1過表達載體和mimics NC共轉染NP細胞，其后使用AU處理，Western blot檢測發(fā)現(xiàn)CREB1蛋白的表達顯著增強，并且細胞中ECM降解酶MMP-3、ADAMTS-5的表達上調，而膠原蛋白COL2A1的表達發(fā)生下調;使用CREB1過表達載體和miR-483 mimics NC共轉染NP細胞，AU處理后，細胞中CREB1和ECM降解酶MMP-3、ADAMTS-5的表達發(fā)生降低，而COL2A1的表達則出現(xiàn)上調。表明CREB1可削弱AU對NP細胞ECM的降解的抑制作用，而miR-483可部分逆轉CREB1對AU的抑制作用。

3 討論

由IDD導致的各類疾病已發(fā)展為嚴重影響人們生活質量、威脅人類身體健康的世紀難題。其發(fā)病機制和治療方法一直是研究的焦點領域，雖然當前基因治療、干細胞移植、生物工程治療等均取得了一定的進展，但多數(shù)仍止步于動物實驗，其臨床有效性和安全性還需進一步評估[11]。近年來，廣大中醫(yī)學者在前人對IDD病因的相關論述基礎上，結合大量臨床實踐發(fā)現(xiàn)中醫(yī)藥可作用于IDD發(fā)生發(fā)展的多個環(huán)節(jié)或靶點，延緩IDD進程[12]。

IDD在中醫(yī)學中歸屬于“痹癥”“腰痛”范疇，中醫(yī)藥治療多從腎虛、氣虛、督脈阻滯等著手[13]，而中藥杜仲性溫，具強筋壯骨、滋養(yǎng)肝腎的作用，因此本項目進一步對杜仲在IDD治療中的功能進行研究，結果發(fā)現(xiàn)杜仲的活性成分AU可顯著增強退行性NP細胞的活性，并且增強的幅度與AU的濃度和處理時間相關。Western blot實驗顯示AU處理后NP細胞中ECM降解酶MMP-3、ADAMTS-5的表達降低，而COL2A1的表達則出現(xiàn)上調，表明AU可抑制NP細胞的ECM降解。大量研究表明，表達失調的miRNA如miR-143[14]、miR-222[15]等可直接調控其靶基因的表達，影響椎間盤組織中細胞的增殖、凋亡和ECM降解過程，參與IDD發(fā)生和演進過程。中藥如補腎壯督方（全方由海馬、鹿角膠、黃芪、熟地黃、細辛組成）可上調大鼠退變椎間盤組織和血漿中的miR-125a水平，延緩IDD發(fā)展[16];本課題組前期也報道了補腎活血方可影響NP細胞中miR-483的表達，促進NP細胞增殖和ECM重塑[10]。

對AU抑制ECM降解的分子機制研究發(fā)現(xiàn)，AU處理可顯著增強NP細胞中miR-483的表達、抑制CREB1的表達。QPCR和LUC實驗表明，miR-483可靶向抑制細胞中CREB1表達，提示miR-483/CREB1軸在AU功能發(fā)揮過程中可能具有重要作用。最后通過驗證實驗表明，CREB1過表達可顯著增強細胞中ECM降解酶、抑制膠原蛋白的表達，而miR-483可逆轉CREB1對AU功效的抑制作用。CREB1是一種被廣泛研究的轉錄因子，可作為轉錄激活因子與啟動子上的cAMP反應元件相結合，促進多種基因轉錄，參與細胞代謝、細胞周期、DNA修復和生存[17]。并且CREB1可調控IL-2、IL-6、IL-10和TNF-α的表達參與炎癥進程[18]，而NP細胞可通過分泌炎性因子誘導MMPs和ADAMTSs等ECM降解酶表達、加速IDD疾病進程[19]。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)，中藥杜仲的主要活性成分AU可作用于miR-483/C，REB1軸，抑制NP細胞ECM降解，延緩IDD的發(fā)展進程。通過明確和完善AU治療IDD的具體分子機制，可為傳統(tǒng)中醫(yī)藥防治IDD提供實驗依據(jù)，并提供新的技術方法和研究思路。

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（本文編輯? 楊? 瑛）