何 英，陳雄豪，凌利芬，王 瓊，林廣城，張銀輝△

(1.中山大學(xué)附屬第八醫(yī)院檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)部，廣東深圳 518033；2.深圳市福田區(qū)婦幼保健院檢驗(yàn)科，廣東深圳518026；3.深圳市龍崗區(qū)第七人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣東深圳 518114)

葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(G6PD)缺乏癥是世界范圍內(nèi)最常見的一種遺傳性酶缺乏病，全球患者約有4億例，我國(guó)亦為G6PD缺乏癥的高發(fā)地區(qū)之一，特別是長(zhǎng)江以南的廣東、廣西、海南、云南及四川等地區(qū)人群患病率高[1-3]。G6PD缺乏癥屬典型的X連鎖不完全顯性遺傳紅細(xì)胞酶缺陷疾病，G6PD基因位于染色體Xq28，由13個(gè)外顯子和12個(gè)內(nèi)含子組成，參與515種氨基酸編碼，基因突變導(dǎo)致的氨基酸取代可引發(fā)蛋白變異，從而導(dǎo)致不同程度的酶活性水平改變，使紅細(xì)胞抗氧化應(yīng)急、損傷能力減弱或破壞[1]。世界各地已鑒定出200多種G6PD基因型突變，中國(guó)人群中發(fā)現(xiàn)的突變類型約35種，常見致病性變異有9種，占總變異的90.00%以上[2-4]。

雖然大多數(shù)G6PD缺乏癥人群可能終生無(wú)臨床癥狀，也不影響生活質(zhì)量，但在外源性藥物、食物及感染刺激下，可引發(fā)急性溶血，嚴(yán)重者未及時(shí)診斷、治療可引起肝、腎、或心功能衰竭，威脅患者的生命[1,5]。G6PD 缺乏癥是新生兒病理性黃疸的主要原因，嚴(yán)重者常并發(fā)膽紅素腦病，進(jìn)而導(dǎo)致新生兒智力遲鈍和死亡[1,3,6]。有研究發(fā)現(xiàn)，G6PD缺乏癥育齡夫婦，近期生育風(fēng)險(xiǎn)與遠(yuǎn)期相關(guān)疾病患病風(fēng)險(xiǎn)較健康群體高，給家庭造成精神和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，也給優(yōu)生優(yōu)育帶來(lái)挑戰(zhàn)[7]。對(duì)育齡夫婦進(jìn)行婚前或孕前篩查，可讓育齡夫婦提前知曉生育風(fēng)險(xiǎn)，更有針對(duì)性地進(jìn)行孕期檢查，提早對(duì)G6PD缺乏癥可能導(dǎo)致的新生兒黃疸進(jìn)行針對(duì)性干預(yù)，相較于新生兒篩查更為經(jīng)濟(jì)有效，更有臨床意義。本研究通過對(duì)婚檢人群進(jìn)行酶活性及G6PD基因突變檢測(cè)，分析基因突變檢測(cè)在婚前篩查中的價(jià)值，為制訂有效可行的人群G6PD缺乏癥預(yù)防方案提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般資料 2017年10月至2018年9月24 190例到深圳市某婦幼保健院進(jìn)行婚前檢查者納入研究，男1 295例，女1 295例；平均(29.07±4.26)歲，均為漢族。定量酶活性檢測(cè)異常人群進(jìn)行基因檢測(cè)，基因檢測(cè)陰性者進(jìn)一步進(jìn)行測(cè)序分析。在酶活性正常女性人群中，隨機(jī)選取428例進(jìn)行基因檢測(cè)。

1.2儀器與試劑 全自動(dòng)生化分析儀(日立7600型，日本)；基因擴(kuò)增儀(GeneAmp PCR System 9700，美國(guó))；凱普醫(yī)用核酸分子快速雜交儀(凱普生物科技股份有限公司，廣東)；基因測(cè)序儀(ABI 3500 DX，美國(guó))；G6PD定量檢測(cè)試劑盒(速率法，廣州科方生物技術(shù)股份有限公司，廣州)；G6PD缺乏癥基因檢測(cè)試劑盒(PCR+導(dǎo)流雜交法，凱普生物科技股份有限公司，廣東)；血液基因組DNA提取試劑盒(離心柱型，凱普生物科技股份有限公司，廣東)；擴(kuò)增產(chǎn)物純化試劑盒QiagenDyeEx 2.0 Spin Kit (Qiagen，美國(guó))；BigDye Terminator測(cè)序試劑盒(ABI，美國(guó))。

1.3方法

1.3.1G6PD酶活性檢測(cè) 采用全自動(dòng)生化儀、G6PD定量檢測(cè)試劑盒(速率法)進(jìn)行酶活性檢測(cè)。采集靜脈血2 mL于EDTA抗凝采血管中，離心后，取20 μL紅細(xì)胞加入1 mL溶解液溶解2 min，樣品中G6PD催化G6P生成6PD，同時(shí)將氧化型輔酶Ⅱ(NADP)變成還原型輔酶Ⅱ(NADPH)，25 min內(nèi)通過生化儀檢測(cè)340 nm吸光度上升的速率，計(jì)算出標(biāo)本G6PD酶活性。G6PD酶活性<1 300 U/L判斷為G6PD酶活性降低。

1.3.2G6PD基因突變檢測(cè) 將酶活性檢測(cè)剩余全血標(biāo)本存于-20 ℃冰箱備用。采用血液基因組DNA提取試劑盒(離心柱型)、G6PD基因檢測(cè)試劑盒(PCR+導(dǎo)流雜交法)進(jìn)行核酸提取、PCR擴(kuò)增及導(dǎo)流雜交。用生物素標(biāo)記的引物分別對(duì)G6PD基因突變區(qū)域進(jìn)行特異度擴(kuò)增，將擴(kuò)增產(chǎn)物與固定在尼龍膜上的不同突變位點(diǎn)探針在導(dǎo)流雜交儀上進(jìn)行導(dǎo)流雜交，然后通過化學(xué)顯色對(duì)結(jié)果進(jìn)行判讀。嚴(yán)格按照試劑說明書進(jìn)行操作和結(jié)果判讀，正常樣本為生物素點(diǎn)及所有正常探針處出現(xiàn)藍(lán)紫色斑點(diǎn)；雜合突變?yōu)檎Ｌ结樇皩?duì)應(yīng)的突變探針位點(diǎn)都出現(xiàn)藍(lán)紫色斑點(diǎn)；純合突變?yōu)橥蛔兲结槼霈F(xiàn)藍(lán)紫色斑點(diǎn)，而對(duì)應(yīng)的正常探針位點(diǎn)沒有出現(xiàn)藍(lán)紫色斑點(diǎn)。方法試劑盒可檢測(cè)G6PD基因6個(gè)外顯子上14個(gè)中國(guó)人常見基因突變位點(diǎn)，分別為c.95 A>G、c.392 G>T、 c.493 A>G、c.487 G>A、c.592 C>T、c.1311 C>T、c.1360 C> T、c.1376 G>T、c.1381 G>A、c.871 G>A、c.1004 C>A、c.1024 C>T、c.1387 C>T、c.1388 G> A。

1.3.3G6PD基因測(cè)序 將要測(cè)序的樣本抽提DNA后，采用5對(duì)序列分析引物進(jìn)行2、5、6、9、11、12外顯子擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物用QiagenDyeEx 2.0 Spin測(cè)序試劑盒進(jìn)行純化后，進(jìn)一步用 BigDye Terminator測(cè)序試劑盒進(jìn)行測(cè)序PCR，最后采用ABI3500DX測(cè)序儀進(jìn)行分析。用DNAman進(jìn)行序列比對(duì)，確定測(cè)定的序列為目標(biāo)外顯子序列。共21個(gè)測(cè)序位點(diǎn)，包括上述14個(gè)基因突變檢測(cè)位點(diǎn)及c.383 T>C、c.517 T>C、c.519 C>T、c.563 C>T、c.1004 C>A和c.1340 G>T。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析。采用頻數(shù)分析方法對(duì)各種變異位點(diǎn)出現(xiàn)的頻率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析；率的比較采用χ2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。女性人群漏檢率通過篩查女性人群總數(shù)、酶活性篩查檢出率以及致病性基因突變檢出率進(jìn)行計(jì)算。

2 結(jié) 果

2.1酶活性檢測(cè)結(jié)果 24 190例婚檢人群中G6PD酶活性檢測(cè)陽(yáng)性者共571例，G6PD缺乏癥總體檢出率為2.36%(571/24 190)，其中男性、女性酶活性篩查陽(yáng)性人數(shù)分別為347例和224例，檢出率分別為2.87%(347/12 095)和1.85%(224/12 095)，經(jīng)χ2檢驗(yàn)，男性人群G6PD缺乏癥發(fā)生率明顯高于女性人群，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.2基因檢測(cè)結(jié)果 347例酶活性篩查陽(yáng)性男性人群，332例檢出基因突變，突變檢出率為95.68%；224例酶活性篩查陽(yáng)性女性，215例檢出基因突變，突變檢出率為95.98%；共有24例(男15例、女9例)未檢出試劑盒所包含的14種基因突變，對(duì)標(biāo)本進(jìn)一步測(cè)序分析發(fā)現(xiàn)4例男性存在基因突變，分別為c.1388 G>A突變2例，c.1360 C>T突變1例，c.517 T>C突變1例。

571例酶活性檢測(cè)陽(yáng)性G6PD缺乏癥人群，共檢出10種致病性基因突變和1種多態(tài)性位點(diǎn)，鑒定出55種基因型。最常見3種基因突變?yōu)閏.1388 G>A、c.1376 G>T和c.95 A>G，合計(jì)占比為70.40%，其次為c.392 G>T，c.871 G>A和 c.1024 C>T，占比分別為5.95%、5.95%和4.73%。酶活性篩查陽(yáng)性人群中，合計(jì)65例檢測(cè)到c.1311 C>T多態(tài)性位點(diǎn)，比例為11.38% (65/571)，其中11例僅檢測(cè)到c.1311 C>T突變，未同時(shí)檢測(cè)到致病性基因突變。40例標(biāo)本(男22例，女18例) 包含c.871 G>A突變的人群，均伴隨著c.1311 C>T多態(tài)性位點(diǎn)突變。各種基因突變比例詳見表1。

428例酶活性篩查陰性女性，96例檢出基因突變，含雜合子突變87例，純合子突變9例，基因突變檢出率為22.43%，致病性基因突變檢出率為4.20% (18/428)，與致病性無(wú)關(guān)的多態(tài)性位點(diǎn)c.1311 C>T突變78例，比例為18.22% (78/428)。共檢測(cè)出6種基因突變類型，致病性基因突變類型為c.1388 G> A、c.1376 G>T和 c.95 A>G，詳見表2。

表1 571例酶活性篩查陽(yáng)性人群基因突變分布情況

注：*共4例測(cè)序結(jié)果，其中2例 c.1388 G>A，1例c.1360 C>T，1例c.517 T>G 突變?yōu)闇y(cè)序結(jié)果。

表2 428例酶活性篩查陰性女性基因突變分布

注：*5例伴隨c.1311 C>T多態(tài)性位點(diǎn)突變，其中c.1388 G>A突變中3例，c.95 A>G突變中2例。

3 討 論

廣東省是G6PD缺乏癥的高發(fā)區(qū)之一。本研究發(fā)現(xiàn)深圳婚檢人群G6PD缺乏癥檢出率為2.36%，低于早前報(bào)道范圍。近年報(bào)道鄰近深圳的東莞、廣州地區(qū)G6PD缺乏癥發(fā)生率分別為4.08%和3.40%[8-9]。雖然，影響G6PD缺乏癥流行病學(xué)的因素很多，如納入人群特點(diǎn)、檢測(cè)方法等，但人口流動(dòng)可明顯影響G6PD缺乏癥的分布[1,10-11]，深圳地區(qū)G6PD缺乏癥檢出率低可能與深圳人口來(lái)源特點(diǎn)關(guān)聯(lián)密切[1]，G6PD缺乏癥在我國(guó)的分布具有明顯的地域差異性，呈現(xiàn)南高北低的趨勢(shì)[5]，深圳雖地處G6PD缺乏癥高發(fā)區(qū)，但非廣東地區(qū)外來(lái)人口越來(lái)越多，特別是低G6PD缺乏癥省市人口的流入將明顯影響篩查結(jié)果。G6PD缺乏癥為X染色體連鎖遺傳，且存在X染色體隨機(jī)失活現(xiàn)象，因此，基于酶活性檢測(cè)時(shí)男性檢出率明顯高于女性，本研究男性人群檢出率為2.87%，女性人群檢出率為1.85%，前者明顯高于后者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),與其他研究報(bào)道相同[1,5,9-11]。

研究顯示，c.1388 G>A、c.1376 G>T和c.95 A>G 3種基因突變類型在深圳人群中占據(jù)主導(dǎo)地位，其次依次為c.392 G>T、c.871 G>A和c.1024 C>T，這種基因突變分布特點(diǎn)與廣東省內(nèi)外漢族人群相關(guān)研究結(jié)果一致[3,4,8-9,12]。c.592 C>T 、c.1360 C>T和c.517 T>G突變較少在中國(guó)人群中報(bào)道[13]，本研究分別檢出3、7、1例，表明深圳既具有中國(guó)人群G6PD基因突變的普遍代表性，又顯示出特定的地域基因突變異質(zhì)性。G6PD突變大多為單堿基取代突變，從而導(dǎo)致氨基酸取代、蛋白質(zhì)變異及酶活性水平改變[1]。根據(jù)突變類型分類，本研究在酶活性篩查陽(yáng)性人群共檢測(cè)到10種突變類型和1種多態(tài)性位點(diǎn)突變，致病性突變以單堿基取代突變?yōu)橹鳎壤秊?1.24%，檢測(cè)到多重致病性突變30例，共計(jì)11種多重突變基因型，與文獻(xiàn)報(bào)道一致[1,4,11-13]。數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，40例染色體含c.871 G>A突變的人群，無(wú)論是男性還是女性，抑或單個(gè)堿基還是多重突變，均檢測(cè)到多態(tài)性c.1311 C>T突變，c.871 G>A和c.1311 C>T間的連鎖不平衡現(xiàn)象在其他中國(guó)人群G6PD基因突變研究中也有觀察到[8,14]。事實(shí)上，在亞洲人群以及歐洲人群中，也觀察到c.1311 C>T與c.871 G>A或其他致病性突變的連鎖不平衡現(xiàn)象[15]。

位于11內(nèi)含子的c.1311 C>T被認(rèn)為是一種多態(tài)性的同義突變，不會(huì)導(dǎo)致氨基酸取代，在國(guó)內(nèi)外各種族人群中普遍存在，無(wú)論G6PD缺乏人群，還是G6PD正常人群均可檢測(cè)到c.1311 C突變的存在，但各種族人群檢出率差異明顯(13.00%～45.00%)[16-18]。本研究中酶活性異常人群c.1311 C>T檢出率為11.30%，酶活性正常女性人群檢出率為18.23%。在65例酶活性異常且檢出c.1311 C>T人群中，83.08%(54/65)檢出致病性G6PD基因突變，但在96例檢出基因突變的正常女性人群中，81.25%(78/96)僅檢測(cè)到c.1311 C>T突變，暗示1311位點(diǎn)突變可能是G6PD基因的一個(gè)多態(tài)性標(biāo)志物，可獨(dú)立于G6PD缺乏癥存在[17]。一般認(rèn)為c.1311 C>T突變不會(huì)影響酶活性，但是，在酶活性篩查陽(yáng)性人群中，觀察到11例單純c.1311 C>T突變，包括5例男性半合子，6例女性雜合子，可能原因包括試劑盒基因覆蓋不全、酶活性檢測(cè)假陽(yáng)性[18]。研究發(fā)現(xiàn)，c.1311 C>T復(fù)合11內(nèi)含子93T→C突變?cè)谌巳褐谐Ｒ?，且可?dǎo)致酶活性降低，機(jī)制尚未明確[19-21]。

G6PD缺乏癥的X連鎖不完全顯性遺傳方式導(dǎo)致女性雜合子總體G6PD酶活性具有極大異質(zhì)性，可以表現(xiàn)正常、中度缺乏或顯著缺乏，這種表型與基因型之間的明顯不一致，使得基于酶活性的表型檢測(cè)方法，對(duì)于篩查、確診女性雜合子人群存在困難[1-4]。本研究中428例酶活性檢測(cè)正常女性，18例檢出致病性基因突變，比例為4.20%，根據(jù)本研究女性人群基數(shù)以及酶活性篩查檢出率和基因檢測(cè)檢出率評(píng)估，漏檢率高達(dá)68.63%。JIANG等[22]研究報(bào)道，78.50%的女性雜合子人群G6PD酶活性正常；YAN等[23]研究評(píng)估女性雜合子人群采用酶活性檢測(cè)法的漏檢率為40.70%。根據(jù)G6PD遺傳特點(diǎn)，女性雜合子漏檢率總體而言應(yīng)在50.00%左右[1]，充分表明酶活性檢測(cè)不足以用于女性雜合子診斷。G6PD缺乏癥育齡夫婦，近期生育風(fēng)險(xiǎn)與遠(yuǎn)期相關(guān)疾病患病風(fēng)險(xiǎn)較正常群體高，采用酶活性及基因檢測(cè)相結(jié)合的檢測(cè)方式可充分有效檢測(cè)女性雜合子人群。

4 結(jié) 論

c.1388 G>A、c.1376 G>T、c.95 A>G、c.392 G>T、c.871 G>A和 c.1024 C>T是深圳地區(qū)常為常見的6種G6PD基因突變類型，G6PD缺乏癥表型檢測(cè)方法漏檢率高，采用表型檢測(cè)和分子檢測(cè)相結(jié)合的篩查、確診方式有助于女性婚檢人群G6PD缺乏癥婚前遺傳咨詢。