徐鐘，李遠(yuǎn)遠(yuǎn)，王鋆坦，高瑞

(河南省科學(xué)院商業(yè)科學(xué)研究所，鄭州 45002)

在長(zhǎng)期的進(jìn)化過程中，人類與共生微生物形成互利共生的關(guān)系，共生微生物為人類提供營(yíng)養(yǎng)，免疫、協(xié)助代謝并抵抗病原和有害化合物的侵害[1]。腸道微生物是人體最主要的共生微生物，腸道微生物包含大約10類微生物5000個(gè)細(xì)菌種類，每個(gè)個(gè)體的腸道微生物組成多樣，其中大約90%的細(xì)菌屬于擬桿菌門和厚壁菌門，菌群失調(diào)會(huì)引起各種疾病的產(chǎn)生，并影響終止異常微生物感染的時(shí)間[1]。腸道益生菌產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物，例如乳酸、抗菌蛋白、多肽、短鏈脂肪酸和過氧化氫具有控制病菌和預(yù)防腸道疾病的作用，研究表明通過益生菌、益生元、抗生素、糞菌移植和飲食干預(yù)的方法改變腸道菌群，能夠解決肥胖等各種復(fù)雜的腸道疾病[1]。某些腸道微生物展現(xiàn)出天然的藥性，例如腸道菌群失調(diào)將引起肥胖和二型糖尿病等代謝性疾病，這類病人腸道中丁酸鹽產(chǎn)生菌的比例降低，而丁酸鹽產(chǎn)生菌嗜黏蛋白-艾克曼菌(Akkermansia muciniphilia)對(duì)糖尿病小鼠有良好的治療效果，因此，降糖藥物二甲雙胍可以通過影響腸道黏膜內(nèi)壁的嗜黏蛋白-艾克曼菌，達(dá)到治療肥胖和二型糖尿病的效果[2]。

1 細(xì)菌活體藥物

目前，小分子化學(xué)藥物和蛋白類大分子藥物在醫(yī)藥研發(fā)中占據(jù)主導(dǎo)地位。小分子化學(xué)藥物穩(wěn)定性及生命周期長(zhǎng)，便于儲(chǔ)存運(yùn)輸，但副作用明顯且會(huì)產(chǎn)生耐藥性；蛋白類大分子具有更高的靶點(diǎn)特異性和更小的副作用，但開發(fā)成本高，生命周期短。相對(duì)于小分子化學(xué)藥物和蛋白類抗體藥物，微生物具有操作簡(jiǎn)單且篩選便利的優(yōu)勢(shì)。通過基因改造可以將微生物變成能持續(xù)產(chǎn)生具有疾病治療效果的藥物，利用某些微生物能在特異組織和器官中富集的特性，增加藥物療效并減少副作用[3]。微生物活體藥物的設(shè)計(jì)中，底盤生物必須是具有較好的遺傳操作性的非致病菌，且在發(fā)揮療效的部位天然存在。目前，理想的底盤益生菌有乳酸菌、雙歧桿菌和E.coliNissle1917(EcN)等，盡管這些微生物本身的治療作用有限，但他們的安全性已經(jīng)被充分認(rèn)可[4]。因而，通過對(duì)這些益生菌進(jìn)行理性的基因工程設(shè)計(jì)，開發(fā)出能發(fā)揮各種有益性狀的菌株，賦予他們對(duì)抗疾病的性能，可以將腸道益生菌應(yīng)用到更廣的健康領(lǐng)域。

1.1 乳酸菌活體藥物

乳酸菌(lactic acid bacteria，LAB)是一類能利用葡萄糖或乳糖發(fā)酵產(chǎn)生乳酸的非致病性食品級(jí)微生物，與人共生的LAB具有降低潛在神經(jīng)毒性化合物(例如氨、胺和吲哚)的功效[5]，有助于抵抗陰道細(xì)菌感染和抵抗其它性傳播疾病(例如人乳頭瘤病毒和HIV病毒)感染。以LAB作為表達(dá)抗生素和抗體的宿主，用于治療性病傳播有以下優(yōu)勢(shì)：(1)乳酸菌在泌尿生殖器和腸道中天然存在，使用時(shí)不會(huì)在黏膜表面產(chǎn)生拮抗作用；(2)便于定植，能夠達(dá)到持久保護(hù)的效果。

疫苗類藥物不能在黏膜組織誘導(dǎo)出足夠的免疫反應(yīng)，對(duì)黏膜感染的治療效果差。采用LAB作為載體，通過口服既能避免被腸道消化又能將具有免疫調(diào)節(jié)作用的因子遞送到炎癥部位，達(dá)到治療的目的[6-7]。此外，LAB還可以通過抑制病原菌在宿主腸細(xì)胞上的附著，預(yù)防微生物感染性疾病[6-7]。2000年Steidler等[8-9]采用乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)表達(dá)人源的抗炎癥性細(xì)胞因子白介素IL-10治療克羅恩病(Crohn'sdisease)，這是最早的活體微生物工程藥物，已經(jīng)通過了I期的臨床試驗(yàn)。隨后有多種基于LAB的生物工程菌株被開發(fā)，并在動(dòng)物模型和人的臨床試驗(yàn)中被證實(shí)能起到改善病癥的效果(表1)。

1.2 大腸埃希菌EcN活體藥物

大腸埃希菌EcN是德國(guó)細(xì)菌學(xué)家Nissle在20世紀(jì)20年代從志賀菌痢疾爆發(fā)的健康士兵的糞便中分離出來(lái)的，具有治療腹瀉的功效，是目前被廣泛應(yīng)用的益生菌[24]。大腸埃希菌具有遺傳操作上的優(yōu)勢(shì)，Synlogic公司以EcN為底盤生物，開發(fā)各種用于治療炎癥性腸道病、癌癥以及代謝缺陷性疾病的微生物工程藥物[25-26]，例如：用表達(dá)線蟲半胱氨酸蛋白酶抑制因子的EcN治療炎癥性腸道疾病[25]；用表達(dá)乙?；字Ｒ掖及返腅cN和表達(dá)瘦素的EcN長(zhǎng)效預(yù)防肥胖病[26]。此外，具有特殊功能的腸道益生菌能輔助疾病治療，例如，由于尿毒癥患者腸壁通透性增強(qiáng)，外排功能減弱，腸道微生物產(chǎn)生的毒素(例如硫酸吲哚酚、馬尿酸和苯乙酸)加劇毒素的積累[27]，通過口服表達(dá)脲酶的EcN，降解毒素，減輕尿毒癥癥狀，該療法已經(jīng)在小鼠模型中得到證實(shí)[28]。

表1 用于疾病治療的LAB基因工程菌株

在病原菌防治方面，EcN工程菌株也能發(fā)揮重要作用，例如：利用銅綠假單胞菌群落感應(yīng)因子誘導(dǎo)表達(dá)的抗菌肽microcin S和核酸酶DNaseI的EcN，定向殺滅致病菌[29-30]，以減少抗生素使用和細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生；利用EcN表達(dá)分泌型的HIVgp41-hemolysisn阻止HIV與細(xì)胞的結(jié)合，幫助宿主抵抗HIV感染，在小鼠模型中被證實(shí)能發(fā)揮抗HIV功效[31]；采用EcN表達(dá)霍亂自誘導(dǎo)分子CAI-1，能顯著降低霍亂的致病性[32]。

1.3 其它活體細(xì)菌藥物

一些具有特殊生理功能的細(xì)菌也能作為疾病治療的藥物，例如通過基因工程的方法讓能在腫瘤中聚集的細(xì)菌(例如梭狀芽孢桿菌、鼠傷寒沙門菌)攜帶腫瘤治療藥物，進(jìn)行靶向用藥，以提高治療效果，同時(shí)減少由于藥物對(duì)健康細(xì)胞的毒害作用引起的不良反應(yīng)[33]。利用細(xì)菌的腫瘤趨向性和向細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)DNA的能力，在細(xì)菌中表達(dá)具有腫瘤殺滅作用的蛋白，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的配體，小分子干擾RNA(RNAi)或產(chǎn)生有毒化合物的生物酶(胞嘧啶脫氨酶和HSV-tk)，治療癌癥，例如根據(jù)李斯特菌對(duì)免疫系統(tǒng)敏感，只能在免疫抑制的腫瘤組織中存活的特性，通過在抗李斯特菌的抗體上加上放射性的錸元素，用于檢測(cè)和殺滅癌細(xì)胞[34]。

此外，一些肉食性細(xì)菌也能夠通過吞噬特定病原菌，起到噬菌體類似的治療效果，具有活體藥物開發(fā)潛力，例如以革蘭陰性菌為食的食菌蛭弧菌Bdellovibrio bacteriovorus和Micavibrioaeru ginosavorus，具有治療肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)的效果[35]。

2 效應(yīng)物表達(dá)調(diào)控及微生物封存技術(shù)

2.1 效應(yīng)物分子的表達(dá)調(diào)控

在疑難雜癥，例如癌癥和代謝疾病的治療中，傳統(tǒng)的治療方案往往受限，因?yàn)椴煌∪说牟r不同并隨時(shí)變化，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)提倡根據(jù)病人的遺傳信息制訂個(gè)性化的治療方案。微生物工程菌可以將診斷和治療過程整合到一個(gè)系統(tǒng)中，在疾病發(fā)生時(shí)，在病灶部位實(shí)現(xiàn)體內(nèi)藥物分子的合成和運(yùn)輸。該系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)：①由于藥物分子只出現(xiàn)在病灶組織附近，實(shí)現(xiàn)用藥量的最小化，減少藥物的副作用；②藥物分子能夠在病灶部位持續(xù)產(chǎn)生，延長(zhǎng)藥物的半衰期，達(dá)到最優(yōu)的治療效果；③通過在該系統(tǒng)中加入只在病灶組織中表達(dá)報(bào)告基因，能夠?qū)崟r(shí)監(jiān)控病情發(fā)展。利用微生物的轉(zhuǎn)移、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、合成和分泌等自然能力，開發(fā)用于疾病治療的工程菌株，需要對(duì)微生物的這些功能元件有充足的認(rèn)識(shí)。目前的生物學(xué)研究，已發(fā)現(xiàn)大量的對(duì)細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞外特定外界刺激起應(yīng)答反應(yīng)的生物傳感元件[36]，通過這些元件組裝出能夠精確調(diào)控效應(yīng)分子表達(dá)的工程菌株，對(duì)開發(fā)新型的體內(nèi)生物治療方法具有重要意義。

2.2 工程菌株的封存

在用微生物進(jìn)行疾病治療中，安全性是最重要的考慮因素，盡管益生菌在疾病治療中有多方面的優(yōu)勢(shì)，但是針對(duì)不同人群也可能產(chǎn)生一些副作用，例如，過激的免疫應(yīng)答反應(yīng)、有害的次級(jí)代謝產(chǎn)物、基因突變以及引起腸胃疾病等[37-38]。與用于生產(chǎn)的工程菌不同，用于疾病治療的工程菌在臨床的開放環(huán)境中，可能會(huì)對(duì)正常的個(gè)體產(chǎn)生影響，因此這類菌株的設(shè)計(jì)需要考慮多方面因素，例如不攜帶多余的抗性基因，效應(yīng)物分子的表達(dá)可控，菌株的生存環(huán)境可控?；蚋脑斓奈⑸镌谡故炯膊≈委煗摿Φ耐瑫r(shí)，也會(huì)在人群中傳播，出現(xiàn)生物污染問題，因此，基因工程菌株的設(shè)計(jì)必須具有預(yù)防生物逃脫的應(yīng)用機(jī)制。

在開放環(huán)境中，需要阻止用于工程微生物的意外進(jìn)化，水平基因轉(zhuǎn)移和向環(huán)境中擴(kuò)散。為此，科研人員開發(fā)出了幾種基于營(yíng)養(yǎng)缺陷型的微生物封存技術(shù)。第一種封存技術(shù)采用來(lái)自施氏假單胞菌WM88的亞磷酸轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)HtxBCDE，該轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)能轉(zhuǎn)運(yùn)亞磷酸而不能轉(zhuǎn)運(yùn)磷酸，通過敲除工程菌株的總磷酸和有機(jī)磷酸轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)，并表達(dá)HtxBCDE和亞磷酸脫氫酶，讓亞磷酸作為該菌株能夠利用的唯一磷源，而環(huán)境中的亞磷酸不足以維持細(xì)菌生長(zhǎng)，因此，該工程菌株只能在補(bǔ)充亞磷酸的條件下生存[39]。第二種封存技術(shù)采用人工設(shè)計(jì)的氨酰t-RNA合成酶(BipARS)改變工程菌株的密碼子讀取，讓UAG密碼子加載非天然氨基酸NSAA L-4,49-biphenylalanine(BipA)，當(dāng)沒有BipA底物時(shí)，工程菌株生存的必需基因無(wú)法表達(dá)，所以不能存活[40]。第三種封存技術(shù)采用宿主細(xì)胞的功能元件，彌補(bǔ)工程菌株的基因缺陷，使工程菌株只能在特定宿主細(xì)胞中存活，例如敲除牛痘病毒的胸苷激酶合成基因，胸苷激酶為病毒DNA復(fù)制提供核苷酸，胸苷激酶在正常細(xì)胞的特定細(xì)胞周期表達(dá)，而在許多癌癥細(xì)胞中成型表達(dá)，因此敲除胸苷激酶合成基因的牛痘病毒能選擇性地在腫瘤細(xì)胞中高效復(fù)制[41]。

3 結(jié)論與展望

近年來(lái)的研究表明，腸道益生菌與人體的營(yíng)養(yǎng)代謝、機(jī)體發(fā)育、免疫力和多種疾病的發(fā)生密切相關(guān)，這些益生菌通過輔助消化，產(chǎn)生各種代謝產(chǎn)物，以及直接與人體腸道細(xì)胞的接觸方式發(fā)揮作用[42]。基于腸道益生菌與人體穩(wěn)定共生，能在特異組織(腫瘤)或器官中富集，以及具有可遺傳操作的特性，對(duì)益生菌進(jìn)行基因工程改造，將生物藥物的合成基因?qū)胩囟ǖ囊嫔?，并?duì)其效應(yīng)物分子的表達(dá)和菌株的生存進(jìn)行精細(xì)的調(diào)控，構(gòu)建的益生菌基因工程菌株將具有持續(xù)的疾病治療、預(yù)防以及監(jiān)測(cè)的效果(圖1)，極大的降低了一些慢性疾病的治療費(fèi)。

圖1 細(xì)菌工程藥物設(shè)計(jì)流程

利用活體微生物預(yù)防和治療疾病已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了臨床應(yīng)用并使部分病人受益，但是一些治療效果不理想，個(gè)體差異導(dǎo)致的治療不確定性，還需要進(jìn)一步研究闡明原因，特別是目前還沒有這類藥物的使用標(biāo)準(zhǔn)和療效評(píng)價(jià)體系。出于抗耐藥病原菌新藥和個(gè)性化治療藥物的需要，微生物活體藥物具有巨大的市場(chǎng)價(jià)值和應(yīng)用前景。選擇何種效應(yīng)物分子、運(yùn)載效應(yīng)物分子的活體微生物、用藥方式、效應(yīng)物分子的表達(dá)調(diào)控以及工程菌株的封存，是活體微生物藥物研究的需要考慮的問題。目前成功的噬菌體、細(xì)菌和病毒活體工程藥物研究，為進(jìn)一步推動(dòng)更多活體微生物藥物進(jìn)入臨床治療奠定了基礎(chǔ)。