顧覺奮

（中國藥科大學生命科學與技術學院，南京 210009）

細菌耐藥性，是21世紀威脅人類健康最重要的元兇之一，也是全球關注的熱點。2016年WHO發(fā)布的全球耐藥菌報告中指出，耐藥細菌已蔓延至每一個國家，病原微生物對抗菌藥物耐藥的形勢越來越嚴峻，控制耐藥菌已經成為刻不容緩的公共衛(wèi)生問題[1]。連續(xù)多年的全國細菌耐藥監(jiān)測(CARSS)數據顯示，耐亞胺培南肺炎克雷伯菌(IMP-RKPN)、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)、耐萬古霉素屎腸球菌(VREFM)、多重耐藥的銅綠假單胞菌和廣泛乃至全耐藥的鮑曼不動桿菌的出現，且檢出率不斷增加，因其所致感染病死率高引起臨床廣泛關注[2]。人們著手研究病原微生物的耐藥性機制，已知的細菌耐藥的分子和生化機制包括微生物可以通過產生耐藥性酶類催化抗生素失活、靶位的改變、細胞膜通透性的改變、生物膜形成以及外排泵(efflux pumps，EPs)等將抗生素排出細胞外，是臨床上固有耐藥和獲得性多藥耐藥性(multidrug resistance，MDR)的主要機制[3]，尤其存在于耐藥革蘭陰性菌，如腸桿菌科，不動桿菌屬和假單胞菌屬中[4]。藥物學家們針對這些機制研制藥物，克拉維酸等β-內酰胺酶抑制劑已經成功應用到臨床上。近年來，以病原微生物細胞膜上的外排泵為靶點研制外排泵抑制劑(effl ux pump inhibitors，EPI)也受到了重視，本文從其作用機制、各類外排泵抑制劑、篩選方法等方面進行了綜述，及對三維結構的解析將有助于發(fā)現新的外排泵抑制劑。

1 外排泵

外排泵(efflux pumps)是指細菌將胞內的藥物或毒性物質排出胞外的蛋白轉運系統(tǒng)，在外排過程中需要進行質子交換或水解ATP提供能量。根據氨基酸序列同源性和底物特異性，一般將這些外排泵分為5大類[5]：多藥及毒性化合物外排分子家族(multiantimicrobial and toxic compound extrusion，MATE)；主要促進劑超家族(major facilitator superfamily，MFS)；小多重耐藥轉運分子家族(small multidrug resistance family，SMR)；耐藥性結節(jié)化細胞分化分子家族(resistance nodulation division family，RND)；以及ATP結合盒超家族(ATP-binding cassette superfamily，ABC)(圖1)[6]。所有的外排泵家族均由質?；蛉旧w編碼，具有不同的結構形態(tài)與底物特異性。在真菌和人體中，涉及藥物外排的大多數轉運蛋白屬于ABC家族外排泵，通常被稱為主要轉運蛋白，利用ATP水解的能量從細胞中泵出藥物。相應的，MFS和SMR，RND和MATE超家族被稱為次級多藥轉運蛋白，利用跨膜質子動力(PMF)或鈉/水合氫離子電化學梯度來促使藥物從細胞內泵出。

在這些外排泵中，RND家族研究得最為透徹。RND外排泵可以將大環(huán)內酯類、氯霉素、四環(huán)素類、喹諾酮類和β-內酰胺類藥物泵出細菌體外。革蘭陰性菌大腸埃希菌有7個不同的RND外排轉運蛋白(表1)。轉運蛋白可分為兩種不同的亞家族，為疏水性和兩親性外排RND(HAE-RND)和重金屬外排RND(HME-RND)[7]。

2 外排泵抑制劑作用機制

2.1 已知的5類外排泵的組成和一般作用機制

圖1 5類外排泵的簡單模式圖

(1)MATE家族具有12個穿膜結構域，面朝外的構象具有兩個向內膜外邊層開放的入口，有一個較寬的中心底物結合腔，其作用機制是由質子勢能和鈉離子濃度梯度共同提供能量將藥物泵出胞外[8-9]。例如奧美拉唑(omeprazole)、泮托拉唑(pantoprazoIe)和蘭索拉唑(lansoprazole)皆為質子泵(又稱H+.K+-ATP酶)抑制劑，它們能迅速穿過細胞膜破壞跨膜電化學梯度，阻斷外排泵的能量來源，從而避免藥物的外排[10]。

(2)MFS家族由兩種不同的蛋白結構域構成，即12碳和14碳跨膜結構，14碳跨膜結構由12碳跨膜結構與輸水中央環(huán)組成。12碳跨膜蛋白是由一個編碼6碳跨膜結構的基因重復表達并在膜內外以軸對稱方式形成。兩個6碳穿膜α螺旋被稱為N、C蛋白結構域，結構域中的多個帶電荷氨基酸殘基能夠與質子結合，利用胞內外的質子濃度梯度提供的化學勢能為跨膜轉運供能，實現底物在胞內外的轉運，其作用機制實質上是一種交替通路機制。

(3)SMR家族轉運蛋白較小，只有4個跨膜區(qū)。是H+偶聯外排泵，即由質子驅動供能的轉運蛋白，EmrE是其代表成員之一。其作用機制是前三個跨膜區(qū)中保守的氨基酸殘基側鏈與底物疏水部位結合，藥物與帶電荷殘基的質子交換驅動藥物進出輸水通道，孔蛋白OmpW參與跨越外膜的EmrE特異性底物的流出[11]。阻斷位于外膜蛋白(outer membrane protein,OMP)上的通道分子(如Tolc，OprlvI)來抑制外排泵，是指通過一種納米 小分子能特異性地結合在外排通道的活性部位上，形成空間位阻，從而更有效地阻礙外排泵通道。

(4)RND家族由36個跨膜的α螺旋構成的三聚體結構，三個單體分別是內膜蛋白(inner membrane protein，IMP)、外膜蛋白(outer membrane protein，OMP)和周質膜融合蛋白(periplasmic membran fusion proteins，MFP)。其作用機制是因IMP決定了外排泵作用底物的廣泛性，OMP與IMP為物質轉運形成通道，二者與MFP相互作用，促使外排泵系統(tǒng)形成穩(wěn)定結構，通過進入、結合、外排三個步驟實現底物的轉運，藥物與活性部位的結合形成過渡態(tài)中間產物，降低反應的活化能，促進底物的外排。

表1 大腸埃希菌的RND外排泵

(5)ABC家族由兩個疏水跨膜結構域(TMD)及兩個親水細胞質ATP結合域(NBD)組成。其作用機制是NBD水解ATP為細胞跨膜轉運提供能量，TMD與底物特異性結合形成中間產物，通過構象的改變將底物轉運至膜外。

2.2 競爭性阻斷外排泵上的結合位點

有一類抑制劑與外排泵的活性部位具有較高的親和力，通過與抗生素競爭細菌外排泵的活性部位來減少藥物的外排，人們針對外排泵設計并合成了不同的抑制劑。這些藥物并不會直接作用于外排泵產生的多重耐藥菌株，而是以抗生素分子通過競爭性地在外排泵上的結合位點，以避免藥物的外排。例如，13-CPTC是四環(huán)素的一個結構類似物，能競爭性地與細菌B型四環(huán)素外排泵結合，阻斷外排泵對四環(huán)素類抗生素的外排作用，從而躲避細菌將其泵出胞外，胞內最終使?jié)舛冗_到有效值范圍而殺死細胞。

2.3 基因水平抑制外排泵的表達

反義核苷酸或小分子RNA選擇性的抑制編碼外排泵基因的表達。Liu等[12]報道了銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa，PA)外排泵MexAB-OprM的功能受到了siRNA抑制，分析認為銅綠假單胞菌中可能存在RNA誘導基因特異沉默現象。據此，龔鳳云等[13]針對銅綠假單胞菌外排泵MexAB-OprM設計兩條siRNA序列，合成了與兩條siRNA一致的DNA序列，通過分子生物學的方法將雙鏈DNA序列克隆到pGPU6／GFP／Neo-siRNA載體中，構建siRNA表達載體，采用電穿孔方法轉化PA01細胞，通過E-test檢測siRNA2干擾PA01，PA01對美羅培南(Meropenem)、頭孢他啶(Ceftazidime)、環(huán)丙沙星(Ciprofloxacin)的耐藥性都明顯降低，進一步RT-PCR方法證實siRNA2干擾PA01后外排泵MexAB-OprM中MexB基因的mRNA表達明顯下降，上述結果說明應用siRNA分子干擾銅綠假單胞菌外排泵MexAB-OprM的MexB基因，可以降低細菌對抗生素的耐藥性，提高銅綠假單胞菌對抗生素的敏感性。

3 外排泵抑制劑

3.1 化學合成來源EPIs(Effl ux Pumps Inhibitors)

3.1.1 化合物Tariquidar

Tariquidar[14]是目前為止第三代MDR調節(jié)物中最具前景的代表性藥物。它是在篩選哺乳動物ABC族外排泵抑制劑時發(fā)現的，特別對P-糖蛋白(P-gp)和哺乳動物乳癌細胞耐藥蛋白(BCRP，ABCG2)有很好 的抑制作用。最新報道，第三代P-糖蛋白抑制劑Tariquidar對細菌多重耐藥性的抑制作用，將金黃色葡萄球菌29213(SA29213)和1199B(SA1199B，NorA過表達)、銅綠假單胞菌27853、嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌BAA-85分別置于環(huán)丙沙星+Tariquidar及無抑制劑條件下，來評估其P-糖蛋白抑制劑的作用。Tariquidar的活性效果在SA1199B中最明顯，通過加入tariquidar使環(huán)丙沙星的MIC值降低了10倍。Tariquidar本身不是P-糖蛋白的底物，它與P-糖蛋白的結合是特異性的，非競爭性的，它結合在P-糖蛋白的ATP結合位點上，通過抑制ATP酶活性起作用。臨床試驗表明，聯合本品可使多柔比星、紫杉醇、長春瑞濱的IC由2.57，27.4和15.5mmol/L分別降到1.67，20.6和9.5mmol/L，其優(yōu)點在于其不影響CYP3/A4的代謝。已開發(fā)到Ⅱ/Ⅲ臨床研究階段，能恢復癌細胞對化療制劑的敏感性。

3.1.2 維拉帕米(Verapami，VER)及其類似物

維拉帕米(Verapami，VER)是鈣通道阻斷劑，近年來用于治療高血壓、心絞痛、心律失常等，研究證明，維拉帕米阻斷結核分枝桿菌(M.tuberculosis)的外排泵，能夠降低各種抗分枝桿菌藥物的最小抑制濃度(MIC)[15]。維拉帕米的原核外排泵抑制機制尚未完全闡明，一些研究認為維拉帕米在生理pH下是質子化的兩親性分子(pKa 9.68)，使維拉帕米能溶解在脂質雙分子層中，其蓄積可增加細菌膜通透性并干擾膜蛋白的功能。Chen等[16]就維拉帕米與抗結核分枝桿菌藥物的協(xié)同作用證實了這一研究機制。與一些膜活性劑類似，VER破壞膜功能并誘導膜應激反應，從而與抗結核桿菌藥物如利福平或貝達喹啉產生協(xié)同作用，為此人們仍將維拉帕米作為開發(fā)可用的EPI先導化合物。進一步研究表明R-Verapamil和去甲維拉帕米(Norverapamil，圖2)與Verapamil對于降低感染巨噬細胞模型中巨噬細胞誘導的藥物耐受性同樣有效，在機制層面上也說明了逆轉耐藥性的機制與維拉帕米類似物的哺乳動物鈣通道活性并無直接關系。隨后合成了一系列維拉帕米類似物并計算了抑制濃度指數(FICI)，對接研究發(fā)現其中的化合物7d(圖2)顯示出最好的協(xié)同活性(FICI=0.3)，對照組維拉帕米的 FICI為0.5。

3.1.3 化合物PAβN

很多EPI的重要先導化合物，P-糖蛋白抑制劑像利血平和維拉帕米等，金黃色葡萄球菌等革蘭陽性菌的外排泵抑制劑而被廣泛研究，能減少阿霉素，嘌呤霉素等的泵出。MexB和AcrB革蘭陰性菌RND泵具有最廣泛的底物特異性，既可泵出中性化合物(如氯霉素)又可泵出酸性化合物(如β-內酰胺類)。Opperman等[17]報道PAβN(MC-207 110，苯丙氨酸-精氨酸β-萘酰胺，Phenylalanyl arginyl β-naphthylamide)作為廣譜抑制劑，可抑制銅綠假單胞菌中3種主要RND泵：MexAB-OprM，MexCD-OprJ和MexEFOprN，能有效減少氟喹諾酮等的外排，也可抑制大腸埃希菌的AcrAB-TolC泵。濃度為20μg/mL的PAβN存在時，各種抗生素對MexAB-OprM過量表達的銅綠假單胞菌菌株的MIC均有不同程度的下降，例如氯霉素和司帕沙星的MIC降低128倍，紅霉素和左氧氟沙星的MIC降低32倍。其抑制作用可能是運輸過程中與藥物競爭結合位點的結果。Lamers[18]雖曾報道了PAβN外膜透化活性的理論，隨后Misra等[19]最終認為：PAβN的主要作用機制是抑制外排泵活性，而后延長PAβN溫育時間，才體現較弱的膜去穩(wěn)定作用，可能在未充分表達外排泵的細胞中，PAβN的細胞壁透化作用才會被放大。盡管對PAβN結構進行修飾，試圖改善活性、血清穩(wěn)定性，將其急性毒性降低至可耐受的水平，但其結構中固有的兩種陽離子基團，導致在組織中長時間的積聚而無法重復給藥，以致引起嚴重的腎毒性，因此，一系列的結構改造均沒有取得實質性進展。

3.1.4 化合物SILA421

圖2 維拉帕米及其衍生物結構

最早由Martins等[20]發(fā)現一種對多藥耐藥、廣泛耐藥結核(MDR/XDR-TB)有殺滅作用的化合物SILA421，試驗了體內外抗XDR-TB活性，發(fā)現SILA 421(MIC＜3.5mg/L)使非殺傷巨噬細胞轉變?yōu)橛行淌杉毦鷼⑹?，它不僅抑制敏感結核菌和XDR-TB菌，還抑制腫瘤細胞的外排泵活性，使得吞噬體內鉀離子和鈣離子濃度過高而增加肺巨噬細胞的殺菌效果，且未對人體細胞顯示出任何毒性，展現出有潛力成為一種新型抗耐藥結核藥物。

四年后，Simons等[21]報道，體外單獨使用時，SILA-421顯示出濃度依賴性和時間依賴性的殺菌活性，能增強異煙肼(Isoniazid，INH)和利福平(Rifampicin，RIF)的對耐多藥結核病的療效，且與INH有良好的協(xié)同作用，可防止出現INH暴露后的INH抵抗。然而SILA-421并不能增強莫西沙星(Moxifloxacin，MXF)或阿米卡星(Amikacin，AMK)的效果。此外，SILA-421還可增強RIF對抗RIF菌株的活性，并能夠完全清除抗RIF分枝桿菌。遺憾的是，在基因型菌株誘導的結核病小鼠中，異煙肼-利福平-吡嗪酰胺治療方案中添加SILA-421，13周后并沒有觀察到增強的療效[22]。

3.1.5 吡喃并吡啶化合物(MBX2319)及其類似物D13-9001

近二十年來，人們不斷嘗試開發(fā)可用于臨床的RND外排泵抑制劑。最早的是擬肽EPI家族，包括化合物PAβN。革蘭陰性菌EPIs開發(fā)的第二個重要的里程碑便是一系列吡啶并嘧啶EPIs，其代表是D13-9001，作為先導化合物已進入臨床前開發(fā)階段。吡啶并嘧啶EPIs對于銅綠假單胞菌的MexAB外排泵具有較強的特異性，對MexXY泵沒有活性，這可能是導致其在2007年發(fā)展停滯的一個主要原因[23]。MBX2319不具有膜破壞性或內在的抗菌活性，還可增強AcrB底物抗生素的活性，包括氟喹諾酮類，β-內酰胺類，紅霉素，氯霉素以及利奈唑胺等，而且對肺炎克雷伯菌、腸炎沙門菌、陰溝腸桿菌和弗氏志賀菌等其抑制活性譜全部涵蓋。MBX2319在大腸埃希菌中的主要靶標是完整的膜轉運蛋白AcrB。為了深入了解MBX2319抑制的分子機制，Vargiu等[24]利用分子動力學模擬確定MBX2319在AcrB底物結合口袋中的結合位點，并預測MBX2319同D13-9001一樣，與AcrB結合在“疏水阱”。不久，Sjuts(法蘭克福歌德大學) [25]獲取了與AcrBper(一種工程蛋白，由可溶形式的AcrB周質“搬運工”結構域組成)結合的MBX2319的晶體復合物結構，發(fā)現MBX2319與T原體的疏水阱結合，在疏水阱中，與深層結合口袋和疏水阱內部的疏水殘基相互作用。

3.1.6 Timcodar(VX-853)

Grossman 等[26]關于P-糖蛋白抑制劑Timcodar(VX-853)的研究歷久彌新，在體外研究中，當Timcodar單獨使用時，對肉湯培養(yǎng)的耐多藥結核分枝桿菌(MTB)有著較弱的抑制作用(MIC=19μg/mL)；同樣條件下，Timcodar與利福平(RIF)，貝達喹啉(Bedaquiline)和氯法齊明(Clofazimine)合用，則顯示出良好的協(xié)同作用；而以巨噬細胞為宿主培養(yǎng)結核桿菌時，Timcodar與RIF，莫西沙星或Bedaquiline聯合使用，對耐多藥結核病抑制作用 更是提高了約10倍(50%抑制濃度為1.9μg/mL)。Timcodar在小鼠模型中可增強RIF和異煙肼(INH)的作用，減少肺部Mtb負荷，并降低慢性感染的復發(fā)率，G rossman等認為，這種增強作用可能是由Timcodar自身的抗菌活性和宿主靶向機制相結合的結果。然而，De等[27]使用時間-殺菌動力學測定法，卻發(fā)現維拉帕米和Timcodar均不能提高莫西沙星+利奈唑胺抗結核感染的活性。

3.2 微生物代謝來源EPIs

3.2.1 米爾貝霉素(Milbemycins)

米爾貝霉素(Milbemycins)是由幾種鏈霉菌產生的一種十六員大環(huán)內酯類抗生素，具有強烈的殺蟲和殺螨等生物學活性。ATP結合盒(ABC)多藥外排轉運蛋白的過表達是對唑類抗真菌劑的臨床抗性的重要原因，Niimi等[28]證實米爾貝霉素是真菌多藥耐藥外排泵潛在的廣譜有效抑制劑，他們報道了識別和表征米爾貝霉素抗白念珠菌和光滑念珠菌的多藥耐藥外排泵，選定釀酒酵母菌株表達，使用了CaCdr1p、CaCdr2p、CgCdr1p、CgPdh1p和ScPdr5p等，每個轉運蛋白回應以獨特的方式進行了試驗。發(fā)現細胞過度CaCdr1p抑制突變體(10株)或CaCdr2p (4株)對Milbemycin alpha25呈抗性，每個CaCdr1p抑制突變對其他3個外排泵抑制劑(他克莫司、恩鐮孢菌素、白僵菌素)導致不同的反應，也影響了其底物特異性。說明了米爾貝霉素alpha25是通過穩(wěn)定這些轉運蛋白的開放構象來抑制CaCdr1p和CaCdr2p泵的功能。

3.2.2 大觀霉素類似物

大觀霉素(Spectinomycin)是鏈霉菌產生的一種氨基糖苷類的抗生素，具有較強的細菌核糖體親和力，與傳統(tǒng)氨基糖苷類抗生素類似，能選擇性結合細菌核糖體亞基，從而抑制蛋白質的合成。出乎意料的是，大觀霉素抗結核分枝桿菌的活性遠不如氨基糖苷類，這可能歸因于外排泵Rv1258c對大觀霉素大量外排。Lee等[29]通過用各種酰胺羰基連接的官能團取代糖上的酮基，設計了一系列大觀霉素類似物(Spectinamides)，企圖避免細菌的主動外排，其中吡咯和哌啶環(huán)，特別是鹵素取代的哌啶類似物表現出最好的抗分枝桿菌和抑制外排泵的活性。后續(xù)研究獲得了酰胺衍生物1599(Spectinamide1599)，能夠大幅降低各種抗分枝桿菌抗生素(包括克拉霉素，多西環(huán)素和克林霉素)的MIC，然而酰胺衍生物1599并不能增強大觀霉素的活性，這表明Spectinamide1599并不是通過抑制Rv1258c的外排功能來規(guī)避其介導的耐藥性[30]。

3.3 天然產物來源EPIs

3.3.1 利血平(Reserpine，RES)

利血平(RES)是被廣泛用于治療輕度或中度高血壓且伴有鎮(zhèn)靜作用的吲哚生物堿。早期的研究表明，RES可以抑制耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)的四環(huán)素外排泵Tet(K)，并使四環(huán)素對MRSA的MIC從128μg/mL降低至32μg/mL，針對多藥耐藥性革蘭陽性菌，利血平顯示的EPI活性涵蓋了ATP結合盒(ABC多藥外排)超家族和主要促進劑超家族(MFS)。隨后，一些學者認為RES可能通過抑制MmpL7，IniA和P27-P55外排泵來逆轉MTB對INH和溴乙錠(EtBr)的耐藥性。Sun等[31]的研究也證實RES能夠降低甚至逆轉廣泛耐藥(XDR)MTB、多藥耐藥(MDR)MTB對氧氟沙星的耐藥性。

3.3.2 粉防己堿(Tetrandrine)

粉防己堿是來源于植物粉防己塊根中提煉的治療支氣管哮喘的雙芐基異喹啉類生物堿。與維拉帕米類似，粉防己堿是L-型鈣通道和P-糖蛋白抑制劑，因此，很可能與維拉帕米相似的機制調節(jié)結核分枝桿菌外排泵的活性[32]。Zhang等[33]發(fā)現粉防己堿可降低異煙肼(INH)和乙胺丁醇(EMB)對多重耐藥MTB的MIC，有效率高達82%，認為將INH或EMB與粉防己堿聯合使用不僅提高抗TB效果，且有助于減少藥物劑量和副作用。也有報道粉防己堿能提高銅綠假單胞菌對氧氟沙星的敏感性。

3.3.3 小檗堿(Berberine)

小檗堿與胡椒堿在結構上很相似，具有微弱的抗微生物活性，是廣泛存在于小檗屬植物中的兩親性異喹啉生物堿，也是目前公認的外排泵底物。與抗生素聯用時，小檗堿的細胞內濃度增加，抗菌效果增強。由于競爭性抑制外排泵，抗生素效應也有所增強[34]。晶體學研究證實，小檗堿可以通過結合NorA和RamR外排泵，從而抑制多藥耐藥金黃色葡萄球菌甚至MTB細菌的生長[35]。然而，小檗堿的口服生物利用度明顯較低，口服給藥后由于胃腸道吸收差，加之嚴重的首過代謝及P-糖蛋白介導的外排而導致血漿水平低下，因此對小檗堿進行結構改造引起了不少研究人員的重視。

3.3.4 辣椒素和胡椒酚乙酸酯(Capsaicin acetoxychavicol acetates,ACA)

Kalia等[36]用辣椒素(8-甲基-N-香草基-6-壬烯酰胺)與環(huán)丙沙星聯合測試對金黃色葡萄球菌SA-1199B(NorA過表達)，SA-1199(野生型)和SAK1758(NorA敲除)的活性。發(fā)現辣椒素顯著降低環(huán)丙沙星對金黃色葡萄球菌SA-1199和SA-1199B的MIC。此外，辣椒素在MIC濃度下也延長了環(huán)丙沙星的抗生素后效應1.1h。證明一種新型的EPI—辣椒素，可以抑制金葡菌的NorA外排泵。

Roy等[37]發(fā)現分離自高良姜莖塊的苯丙素類調制因子也可以作為恥垢分枝桿菌的外排泵抑制劑。其中1′-S-1′-乙酰氧基胡椒酚乙酸酯(1′-S-1′-acetoxychavicol acetate)，反式-對-香豆醇酯(transp-coumaryl diacetate)和1′-S-1′-乙酰氧丁香酚乙酸酯(1′-S-1′-acetoxyeugenol acetate)被認為是強效調節(jié)劑，其濃度分別為2.5，6.25和5.0mg/L時，能使溴化乙錠的MIC降低64倍。

3.3.5 錐絲堿(Conessine)

止瀉木(Holarrhena antidysenterica)是用作治療痢疾、發(fā)熱和細菌感染的傳統(tǒng)中草藥，其主要活性成分均具有抗腹瀉和抗瘧原蟲的活性。Siriyong等[38]對止瀉木的提取物錐絲堿(Conessine)研究發(fā)現，本品能夠提高廣泛耐藥鮑曼不動桿菌對抗生素的敏感性，進一步的實驗證實MexAB-OprM外排泵參與該機制。在MexAB-OprM過表達的菌株中，Conessine使抗生素的MIC降低至少8倍，對頭孢噻肟，左氧氟沙星和四環(huán)素的敏感性甚至達到野生型菌株的水平。而在MexB缺陷型菌株中觀察到的Conessine與抗生素之間的協(xié)同作用則表明，Conessine很可能會抑制銅綠假單胞菌中存在的其他外排系統(tǒng)。

另外，復方清熱顆粒能抑制鮑曼不動桿菌的外排泵[39]、穿心蓮內酯具有抑制銅綠假單胞菌外排泵MexAB OprM的作用[40]、連翹酯苷B可抑制肺炎克雷伯菌外排泵的活性[41]等都被發(fā)現具有外排泵作用。

4 EPIs的篩選方法

隨著蛋白質的三維晶體結構的深入研究，人們根據藥物與外排泵蛋白的相互作用設計一些外排泵抑制劑(EPI)。經過眾多課題組的努力已經完成了一些多藥耐藥外排泵的X射線蛋白質晶體結構解析工作，為這一領域的研究做出很好的貢獻和鋪墊。

大腸埃希菌的多藥外排泵AcrAB-TolC系統(tǒng)是目前研究比較清楚的一種細菌外排泵。Du等[42]報道AcrAB-TolC系統(tǒng)主要有3個部分組成：膜融合蛋白(AcrA)、外排轉運蛋白(AcrB)和外膜通道蛋白(TolC)如圖3所示。

4.1 基于藥效團數據庫的虛擬篩選EPIs

從研究得最透徹的RND(Resistance Nodulation Division)家族出發(fā)，RND蛋白超家族多藥耐藥外排泵的過度表達其中主要原因是微生物耐藥性。了解這個過程的分子基礎是現代生物醫(yī)學研究的主要挑戰(zhàn)之一，涉及到范圍廣泛的實驗和計算技術。首先可利用藥效團模型篩選針對AcrB和MexB外排泵的抑制劑，Ruggerone等[43]報道了用分子動力學計算機模擬RND多藥耐藥外排泵研究狀態(tài)，以獲得大腸埃希菌和銅綠假單胞菌耐藥介導的外排泵功能機制。Aparna等[44]采用基于藥效團數據庫的虛擬篩選，努力識別對銅綠假單胞菌MexB蛋白(圖4)有活性的化合物。根據已知的抑制劑MC-207,110(圖5)創(chuàng)建了藥效團假說，用藥效團模型從數據庫篩選了392個天然化合物和195000個合成化合物，根據軟件的評分顯示出入圍的化合物與活性位點的相互作用(圖6)，使用Glide_XP將入圍的化合物與靶蛋白銅綠假單胞菌的MexB對接。

圖3 AcrAB-TolC復合物的模型

Aparna團隊[45]使用高通量虛擬篩選技術，利用藥效團模型篩選針對AcrB和MexB外排泵的抑制劑，最終確定兩種對大腸埃希菌和銅綠假單胞菌中AcrB和MexB蛋白有較好抑制活性的天然產物—毛花苷C(lanatoside C)和大豆苷元(Diadzein)。Astolfi等[46]也通過開發(fā)兩種新型3D藥效團模型，篩選出了3個有效抑制金黃色葡萄球菌中NorA外排泵的化合物。當然，模擬篩選出的物質還要用實驗進行驗證。

4.2 基于定量構效關系(QSAR)的計算機輔助藥物設計

分子機制和定量構效關系(quantitative structureactivity relationship，QSAR)的研究對于理性設計、合理修飾，是對先導化合物的結構改造、優(yōu)化其活性的重要方法。以革蘭陰性菌嚴重耐藥的RND外排泵為例，最具臨床研究價值的抑制劑是以MBX2319為代表吡喃并吡啶化合物，基于定量構效關系的研究，Nguyen等[47]合成了一系列MBX2319衍生物，并證實化合物22d～f，22i和22k在增強左氧氟沙星和哌拉西林抗大腸埃希菌活性方面比原藥更有效。隨后該課題組繪制了MBX2319骨架結構的分子活性圖譜，鑒別出對外排泵抑制活性至關重要的結構中心，以及可以被修飾以提高活性、代謝穩(wěn)定性和溶解度結構域，新獲得的幾個衍生物結構，在原有活性的基礎上，具有更優(yōu)的藥代動力學性質[48]。然而，除了吡喃并吡啶類EPIs，由于毒性等因素停滯在臨床前或者體外實驗的眾多EPIs，都需要進一步的結構改進，以獲得溶解度更好、清除機制較慢的新化合物以達到體內活性的優(yōu)化。定量構效關系(QSAR)模型已被證明對預測化合物的活性具有良好的預測能力。

圖4 銅綠假單胞菌MexB蛋白質的結構

5 結語

病原菌的多藥耐藥性是目前臨床感染中非常棘手的問題，其中常見的原因之一是細菌的外排泵系統(tǒng)對多種藥物的 外排作用。多藥耐藥外排泵廣泛存在于各種病原菌中，對于細菌來說，外排基因占所有轉運蛋白基因的6%～18%，如外排系統(tǒng)的過度表達主導革蘭陰性菌銅綠假單胞菌耐藥性發(fā)生，尤其MexAB-OprM在耐藥形成中起最主要作用，所以外排基因編碼的外排泵是導致其多重耐藥的重要機制。大量針對大腸埃希菌的多藥外排泵RND型AcrAB-TolC和Mex泵的研究，金黃色葡萄球菌的NorA外排蛋白等，有益于加深人們對細菌多藥耐藥性機制的認識，揭開了MDR泵的耐藥機制的結構與生化基礎，更好地理解外排泵之間以及與其他耐藥機制之間的協(xié)同相互作用，可以為藥物的發(fā)現提供更多的靶點，對三維結構的解析將有助于發(fā)現活性更好的新型外排泵抑制劑。開發(fā)安全有效的外排泵抑制劑對提高抗菌藥物的抗菌活性和改善臨床治療細菌感染疾病的現狀具有重要的意義。

圖5 MexB-OprM外排泵抑制劑MC-207,110的結構

圖6 對接顯示MexB的活性殘基與MC-207,110的相互作用

已經報道的這些來源于化學合成、微生物代謝以及天然產物的各類第三代外排泵抑制劑，有的甚至是廣譜外排泵抑制劑(如PAβN)，具有逆轉廣泛耐藥性，有的已開發(fā)到Ⅱ/Ⅲ臨床研究階段(如Tariquidar)，還通過基于藥效團數據庫的虛擬篩選、基于定量構效關系(QSAR)的計算機輔助藥物設計等，來尋找新型外排泵抑制劑。但多數還處于臨床前階段或體外試驗，開發(fā)能夠規(guī)避MDR的新型抗生素或臨床有效的外排泵抑制劑時，我們仍要接受著無數的挑戰(zhàn)，鑒于許多外排泵具有廣泛的底物特異性，而臨床分離菌株在治療期間出現的EP快速選擇性過表達，我們必須再一次強調優(yōu)化抗菌藥物聯合使用和減少抗生素濫用的重要性。