潘國剛，王春芳，黃春傳，梁麗娜，許桂丹，鄧益斌(右江民族醫(yī)學院附屬醫(yī)院檢驗科，廣西百色 533000)

鼻咽癌是常見的惡性腫瘤，具有明顯的區(qū)域分布特征[1]。我國是鼻咽癌的高發(fā)地區(qū)，發(fā)病率明顯高于世界平均水平[2]。因此，提高鼻咽癌早期篩查水平具有重要的意義。研究表明，長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，LncRNA)是腫瘤潛在的標志物和治療靶點，其異常表達與腫瘤進展密切相關[3]。結直腸腫瘤差異表達基因(colon rectal neoplasia differentially expressed，CRNDE)是近年來發(fā)現的LncRNA家族成員，其在非小細胞肺癌、結直腸癌、胃癌等多種腫瘤中呈高表達[4]，發(fā)揮類似促癌基因的作用。但CRNDE在鼻咽癌中的表達及其臨床意義尚不明確。本研究擬選取鼻咽癌患者作為研究對象，探討血清和組織中CRNDE的表達與鼻咽癌患者臨床病理參數的關系以及CRNDE促進鼻咽癌細胞增殖情況，以期為實現鼻咽癌早期篩查提供實驗依據。

1 資料與方法

1.1研究對象 選取2017年12月至2019年11月在右江民族醫(yī)學院附屬醫(yī)院住院的鼻咽癌患者78例，其中男51例，女27例，年齡(50.3±7.6)歲。納入標準：(1)均經臨床病理穿刺確診為鼻咽癌低分化鱗癌；(2)入組前未接受放化療；(3)年齡≥18歲。排除標準：(1)合并其他惡性腫瘤；(2)合并神經系統(tǒng)疾病等其他已知的可影響CRNDE表達的疾病；(3)患心、肝、腎等臟器功能障礙。TNM分期：Ⅰ～Ⅱ期30例，Ⅲ～Ⅳ期48例。選取同期于體檢中心體檢健康者78例作為健康人對照組，其中男48例，女30例，年齡(51.0±7.9)歲。兩組性別、年齡比較差異無統(tǒng)計學意義(χ2=90.35，P>0.05)。本研究經右江民族醫(yī)學院附屬醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準(No.YJFY-L-2019056)，各研究對象均知情同意。

1.2標本采集 采集鼻咽癌患者就診時(未經臨床治療)以及體檢健康者體檢時的清晨空腹靜脈血標本3 mL，3 000×g離心10 min，肝素抗凝劑處理，分離血清，置于-70 ℃保存。同時采集鼻咽癌患者癌組織及配對的癌旁組織(距離癌組織大于5 cm，且經病理組織學證實無癌細胞)標本，送病理科進行免疫組化染色檢測，置于-70 ℃保存。

1.3細胞系、主要儀器及試劑 鼻咽癌細胞系CNE-2Z(WT)、CNE-2Z(Cas9-CRNDE)購自上海斯信生物科技公司。mirVana PARIS試劑盒(美國Thermo Fisher Scientific公司)；逆轉錄試劑盒、CCK8試劑盒(日本TaKaRa公司)；SYBR PrimeScriptTMRT-PCR試劑盒(大連寶生物公司)。ABI 7500熒光定量PCR儀(美國Applied Biosystems公司)；UL2000超微量分光光度計、NanoDrop2000核酸濃度檢測儀(美國Thermo Fisher Scientific公司)。

1.4CRNDE檢測

1.4.1RNA提取及逆轉錄反應 按照mirVana PARIS試劑盒說明書提取各研究對象的血清總RNA；組織標本先進行組織研磨，再按照上述方法進行組織總RNA提取。UL2000超微量分光光度計檢測RNA的濃度和純度，取吸光度(A260/280 nm)為1.8～2.0的樣本，按照逆轉錄試劑盒說明書將RNA逆轉錄為cDNA，樣本置于-20 ℃保存。

1.4.2實時熒光定量PCR(qRT-PCR) 根據GenBank中CRNDE及GAPDH的序列號(分別為NM_001308963和NM_001115114)，由上海生工公司采用DNAClub引物設計軟件設計并合成引物。CRNDE上游引物序列：5′-GCGGAGGTTAAGTGT-3′，下游引物序列：5′-AACAGGTTTACCTCCTTATCTTCA

GAA-3′，退火溫度55 ℃，產物片段大小841 bp；GAPDH上游引物序列：5′-TGGCTTGGTGTCTTTCTTT

TCT-3′，下游引物序列：5′-GTGGCTGACAAGACTTA

ACTCAA-3′，退火溫度52 ℃，產物片段大小1 329 bp。以cDNA為模板，GAPDH為內參照，按照SYBR PrimeScriptTMRT-PCR試劑盒及ABI 7500熒光定量PCR儀說明書進行qRT-PCR檢測。PCR反應體系為10 μL，包括:primeSTAY 1 μL，2.5×dNTP MIX 4 μL，10 μmol/L上、下游引物各1 μL，RNase-free H2O 2 μL，cDNA樣本1 μL。循環(huán)參數：95 ℃預變性30 s；95 ℃ 5 s，65 ℃ 30 s，72 ℃ 5 s，共40個循環(huán)；4 ℃延伸10 min。使用StepOneTM軟件采集熒光信號并進行熔解曲線分析，CRNDE表達量用2-△△Ct法計算。ΔΔCt=(實驗組Ct目的基因-實驗組Ct內參基因)-(對照組Ct目的基因-對照組Ct內參基因)。每組設3個復孔，實驗重復3次。

1.5細胞培養(yǎng) 取鼻咽癌細胞系CNE-2Z(WT)和CNE-2Z(Cas9-CRNDE)，加入10% RPMI-1640培養(yǎng)基，置于5%CO2、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。隔日進行傳代培養(yǎng)，將細胞調至狀態(tài)最佳時，接種于96孔細胞培養(yǎng)板進行常規(guī)培養(yǎng)，用于后續(xù)試驗。

1.6CCK-8增殖試驗 分別收集實驗組[CNE-2Z(Cas9-CRNDE)]及相應的陰性對照組[CNE-2Z(WT)]培養(yǎng)48 h后的細胞，制成單細胞懸液，RPMI-1640培養(yǎng)基調整細胞密度至6×104/mL，接種于96孔細胞培養(yǎng)板，每組設置6個復孔。將細胞置于37 ℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，于轉染72 h后(根據前期預實驗選取的最佳時間點)，每孔加入100 μL混合液(CCK-8溶液與RPMI-1640培養(yǎng)基按1∶10體積比配制)，置于37 ℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中溫育3 h，酶聯儀檢測450 nm波長處各孔吸光度(A)值，取其均值進行計算。實驗重復3次。

2 結果

2.1血清及組織中CRNDE表達的差異 鼻咽癌患者血清CRNDE的表達水平(5.27±0.89)明顯高于健康人群(1.01±0.12)，差異具有統(tǒng)計學意義(t=18.245,P<0.05)。鼻咽癌患者癌組織中CRNDE的表達水平(1.82±0.21)明顯低于癌旁組織(4.56±0.38)，差異有統(tǒng)計學意義(t=3.056,P<0.05)。

2.2血清CRNDE表達與鼻咽癌患者臨床病理參數的關系CRNDE表達與鼻咽癌患者性別、年齡無關(P>0.05)；而與T分期、N分期、TNM分期、淋巴結轉移、侵犯頸動脈鞘、侵犯顱底與否有關(P<0.05)，見表1。

表1 血清CRNDE表達與鼻咽癌患者臨床病理參數的關系

2.3敲除CRNDE對鼻咽癌細胞增殖的影響 CCK-8增殖試驗結果顯示，轉染72 h后轉染組與其陰性對照組的細胞增殖能力比較，差異有統(tǒng)計學意義(2.42±0.13 vs 5.81±0.48,t=3.142,P<0.05)。

2.4血清CRNDE在鼻咽癌早期篩查中的臨床價值 以30例Ⅰ～Ⅱ期鼻咽癌患者作為實驗組，78例體檢健康者作為對照組，ROC曲線分析血清CRNDE篩查早期鼻咽癌的臨床價值，結果表明，其ROC曲線下面積(AUCROC)為0.835(95%CI：0.598～0.984)，當cut-off值為11.25時，敏感性和特異性分別為93.1%和81.7%，見圖1。

圖1 血清CRNDE篩查早期鼻咽癌的ROC曲線分析

3 討論

CRNDE最初被發(fā)現于結直腸癌組織中，被認為是結直腸癌差異表達的LncRNA，隨后發(fā)現在多種惡性腫瘤中也異常表達。Yang等[5]研究發(fā)現，CRNDE在宮頸癌組織和細胞系中均表達上調，其高表達與FIGO分期及淋巴結轉移呈正相關，且CRNDE高表達者的總生存率明顯降低。這與本研究結果較為一致。Cheng等[6]研究結果表明，膀胱癌組織中CRNDE的表達較癌旁組織顯著升高，且其表達水平與TNM分期呈正相關；其進一步研究證實，轉染CRNDE后可明顯提高膀胱癌細胞的遷移和增殖能力，并抑制細胞凋亡。本研究采用CCK8增殖試驗也發(fā)現了類似的結果，進一步證實CRNDE具有促癌基因的作用。此外，本研究通過對比鼻咽癌患者及健康人群血清CRNDE的表達差異，發(fā)現鼻咽癌患者血清中CRNDE的表達水平均顯著高于健康人群(P<0.05)，與CRNDE在結直腸癌等腫瘤中的表達情況相類似[7]，這表明CRNDE高表達可能是誘發(fā)鼻咽癌的主要因素之一。本研究進一步分析血清CRNDE表達與鼻咽癌患者臨床病理參數的相關性，結果發(fā)現TNM分期越高者，其血清CRNDE的表達水平越高(P<0.05)，表明CRNDE可能具有促鼻咽癌作用[8]；此外，合并淋巴結轉移、侵犯頸動脈鞘及侵犯顱底者的血清CRNDE表達水平明顯高于未合并者(P<0.05)，提示CRNDE可以促進鼻咽癌侵襲及遷移[9]。而不同性別、年齡的鼻咽癌患者血清CRNDE的表達水平差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，提示血清CRNDE不易受鼻咽癌患者個體因素的影響。另外，本研究選取了鼻咽癌患者癌組織和配對的癌旁組織進行CRNDE表達水平的對比，發(fā)現癌組織中CRNDE的表達水平較癌旁組織明顯升高(P<0.05)，這與血清學實驗結果相一致。為了進一步探索CRNDE對于鼻咽癌細胞系的作用，我們選取鼻咽癌細胞[CNE-2Z(WT)]及其敲除CRNDE基因的細胞系 [CNE-2Z(Cas9-CRNDE)]進行CCK8增殖試驗分析，結果發(fā)現敲除CRNDE基因的鼻咽癌細胞系的細胞增殖能力明顯降低(P<0.05)，證實了CRNDE基因可以促進鼻咽癌細胞的增殖。本研究利用ROC曲線分析血清CRNDE對早期鼻咽癌篩查的效能，結果表明其AUCROC為0.835(95%CI：0.598～0.984)，敏感性和特異性分別為93.1%和81.7%，提示血清CRNDE在鼻咽癌早期篩查方面具有良好的臨床應用價值。然而，本研究所納入病例的隨訪時間較短，且尚未分析CRNDE與鼻咽癌預后的關系，是本實驗的不足之處。