李晗，趙枰，曹興建，陳相(南通市第一人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，江蘇南通 226001)

免疫功能低下可能是腫瘤發(fā)生關(guān)鍵的內(nèi)因，而機(jī)體的細(xì)胞免疫功能狀態(tài)發(fā)揮了重要作用。CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cell，Treg)是近年來研究較多的具有免疫抑制功能的T細(xì)胞亞群，能抑制T細(xì)胞對自身抗原的免疫應(yīng)答，在腫瘤的免疫逃逸中發(fā)揮著重要的作用[1-2]。多項(xiàng)研究顯示，在包括卵巢上皮性癌在內(nèi)的多種腫瘤患者外周血和腫瘤組織中Treg細(xì)胞的比例顯著升高[3-4]。本研究通過檢測卵巢癌患者外周血標(biāo)本中免疫細(xì)胞亞群與Treg細(xì)胞的變化，并結(jié)合患者的臨床病理參數(shù)進(jìn)行分析，以期探討其臨床應(yīng)用價值。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2017年6月至2019年3月于南通市第一人民醫(yī)院婦產(chǎn)科門診就診的卵巢癌初治患者48例，年齡47～72歲，中位年齡56歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)所有病例均經(jīng)本院2位高年資病理醫(yī)師依據(jù)2104年WHO卵巢癌組織學(xué)分類標(biāo)準(zhǔn)診斷為乳腺癌；(2)所有病例均無感染、血液病、免疫系統(tǒng)疾病、婦科其他疾病及其他系統(tǒng)惡性腫瘤；(3)既往無卵巢相關(guān)手術(shù)史及半年內(nèi)未接受過其他手術(shù)治療；(4)均可查閱到完整的臨床資料。其中漿液性腺癌29例、黏液性腺癌16例、其他上皮性卵巢癌3例；FIGO臨床分期：Ⅰ～Ⅱ期17例，Ⅲ～Ⅳ期31例；分化程度：低分化29例，中分化11例，高分化8例。選取同期就診的體檢健康者30例作為健康人對照組，年齡44～70歲，中位年齡56歲。兩組間年齡差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

1.2儀器與試劑 CD3-FITC/CD16+CD56-PE/CD45-PerCP/CD19-APC、CD3-FITC/CD8-PE/CD45-PerCP/CD4-APC(北京同生時代生物公司)；CD4-FITC、CD25-PE、IgG1-FITC、IgG1-PE及FACS Calibur流式細(xì)胞儀(美國BD公司)；電化學(xué)發(fā)光全自動免疫分析系統(tǒng)Cobas e601及其CA125配套試劑(瑞士Roche公司)；Ficoll淋巴細(xì)胞分離液(天津?yàn)笕A科生物科技公司)。

1.3方法

1.3.1標(biāo)本采集 所有患者于手術(shù)前采集空腹靜脈血5 mL，其中2 mL經(jīng)EDTA-K2抗凝，混勻，1 h內(nèi)進(jìn)行淋巴細(xì)胞亞群檢測；其余3 mL經(jīng)3 000×g離心10 min，收集血清標(biāo)本，2 h內(nèi)送檢。

1.3.2淋巴細(xì)胞亞群檢測 取2個流式管，分別加入50 μL全血標(biāo)本，再加入20 μL相應(yīng)熒光素標(biāo)記抗體試劑(CD3-FITC/CD16+CD56-PE/CD45-PerCP/CD19-AP和CD3-FITC/CD8-PE/CD45-PerCP/CD4-APC)，渦旋混勻3 s，室溫避光反應(yīng)15 min，加入1 mL溶血劑，渦旋混勻10 s，室溫避光溫育10 min，加入4 mL細(xì)胞染色緩沖液洗滌，500×g離心5 min，棄去上清液(剩余200 μL)，渦旋混勻3 s，重復(fù)洗滌1次，加入200 μL細(xì)胞染色緩沖液重懸，上流式細(xì)胞儀檢測，采用Multiset軟件獲取數(shù)據(jù)并自動分析。

1.3.3Treg細(xì)胞檢測 采集患者術(shù)前外周血4 mL，肝素抗凝，混勻備用。按照Ficoll淋巴細(xì)胞分離液說明書提取單個核細(xì)胞，加入溶血劑200 μL以溶解紅細(xì)胞，混勻10 s，室溫避光溫育10 min，500×g離心5 min，棄上清液，加入4 mL PBS洗滌，500×g離心5 min，棄上清液，加入200 μL PBS，渦旋混勻3 s，取100 μL加至流式管底，分別加入CD4-FITC、CD25-PE單克隆抗體(1∶50稀釋)各20 μL，同型對照IgG1-FITC、IgG1-PE(1∶100稀釋)各20 μL，渦旋混勻3 s，室溫避光反應(yīng)25～30 min，500×g離心5 min，棄上清液，加入4 mL細(xì)胞染色緩沖液洗滌，500×g離心5 min，棄上清液，加入400 μL細(xì)胞染色緩沖液重懸，上機(jī)檢測。

1.3.4血清CA125檢測 取上述患者血清500 μL，按照電化學(xué)發(fā)光全自動免疫分析系統(tǒng)Cobas e601及其CA125配套試劑說明書檢測血清CA125的表達(dá)水平。CA125參考范圍：0～35 U/mL。

2 結(jié)果

2.1各組淋巴細(xì)胞亞群及Treg細(xì)胞的表達(dá) 與健康人對照組相比, 卵巢癌患者外周血Treg細(xì)胞占CD4+T淋巴細(xì)胞的比率明顯升高(P<0.01)，且CD3+、CD4+T淋巴細(xì)胞及CD4+/CD8+比值均升高(P均<0.01)，而CD16+CD56+NK細(xì)胞表達(dá)水平顯著降低(P<0.01)，見表1。

組別健康人對照組 卵巢癌組tP值CD3+66.10±9.2880.10±11.89?-5.4880.000CD4+32.70±5.7148.94±11.70?-8.1780.000CD8+33.23±8.1432.50±11.540.3040.762CD4+/CD8+1.04±0.291.76±0.83?-5.4440.000CD16+CD56+NK21.27±10.189.08±4.82?6.1390.000CD19+12.63±4.4310.81±12.180.7850.435Treg9.92±3.0613.10±5.19?-3.4000.001

注：*，與健康人對照組比較，P<0.05。

2.2Treg細(xì)胞/CD4+T淋巴細(xì)胞含量與卵巢癌患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系 卵巢癌患者外周血中Treg細(xì)胞占CD4+T淋巴細(xì)胞的比率與患者年齡、組織類型、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與否及是否合并CA125升高均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而與患者FIGO分期、細(xì)胞分化及是否存在腹水差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

參數(shù)nTreg細(xì)胞t/FP值年齡(歲)-1.5300.133 <55 1911.70±3.91 ≥552914.01±5.75CA125-1.0720.289 正常1111.62±4.87 升高3713.53±5.26腫瘤大小(cm3)-1.1640.260 <120 3412.42±4.23 ≥120 1414.74±6.92細(xì)胞分化5.6010.007 高89.60±3.76 中1110.81±3.02 低2914.93±5.42?組織類型1.0600.355 漿液性2913.80±5.53 黏液性1611.58±4.62 其他314.46±3.97FIGO分期-2.7520.008 Ⅰ+Ⅱ期1710.47±3.36 Ⅲ+Ⅳ期3114.52±5.49淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移1.2990.200 有3213.78±5.52 無1611.73±4.28腹水2.5890.013 有3514.21±5.31 無1310.10±3.46

注：*，與高、中分化比較，P<0.05。

3 討論

Treg細(xì)胞是Sakaguchi等[5]在1995年發(fā)現(xiàn)的，是T淋巴細(xì)胞群體中的一種特殊類型。區(qū)別于TH1、TH2以及其他具有免疫調(diào)節(jié)功能的T淋巴細(xì)胞群體，Treg細(xì)胞具有免疫調(diào)控、免疫自穩(wěn)及免疫抑制功能，并參與多種疾病的發(fā)生、發(fā)展過程[6]。在介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞免疫逃逸的過程中，Treg細(xì)胞在維持對自身成分(腫瘤抗原)耐受的同時，能夠有效阻止機(jī)體對腫瘤細(xì)胞的免疫應(yīng)答。Treg細(xì)胞主要通過細(xì)胞接觸依賴性機(jī)制、分泌抑制性細(xì)胞因子以及干擾細(xì)胞代謝影響效應(yīng)細(xì)胞的功能等機(jī)制發(fā)揮免疫作用[7-10]。

本研究發(fā)現(xiàn)，卵巢癌患者外周血CD16+CD56+NK細(xì)胞比率明顯降低，提示患者免疫細(xì)胞中自然殺傷腫瘤細(xì)胞的功能低下；而CD4+T淋巴細(xì)胞比率較健康人對照組明顯升高，這一結(jié)果與趙艷勛等[11]研究結(jié)果存在較大的差異。分析原因可能與趙艷勛等[11]在其實(shí)驗(yàn)中僅考慮T淋巴細(xì)胞亞群的比率有關(guān),柯星等[12]的研究結(jié)果亦證實(shí)卵巢癌患者外周血中Treg細(xì)胞占CD4+的細(xì)胞比率明顯升高，即CD4+T細(xì)胞中具有免疫抑制性的Treg細(xì)胞增多，可抑制其他細(xì)胞亞群的活化和功能發(fā)揮，參與自身免疫耐受和腫瘤細(xì)胞免疫逃逸等過程。

本研究通過分析Treg細(xì)胞占CD4+T淋巴細(xì)胞比率與卵巢癌患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系發(fā)現(xiàn)顯示，Treg細(xì)胞/CD4+T淋巴細(xì)胞比率含量與卵巢癌患者的年齡、腫瘤大小、組織類型、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與否以及是否合并血清CA125升高等無明顯相關(guān)性，而和患者的腫瘤細(xì)胞分化程度、FIGO臨床分期以及是否合并腹水密切相關(guān),提示卵巢癌外周血Treg細(xì)胞與腫瘤進(jìn)展相關(guān)，這與戴然等[2]的研究結(jié)果相一致。Treg細(xì)胞與卵巢癌的病程進(jìn)展相關(guān)，隨著腫瘤細(xì)胞生長活躍，可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生的Treg細(xì)胞比率升高，機(jī)體發(fā)揮抗腫瘤的免疫效應(yīng)細(xì)胞活性被抑制，免疫應(yīng)答減弱，有利于腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸。然而，本研究并未分析Treg細(xì)胞在腫瘤進(jìn)展過程中的具體作用機(jī)制，今后需要進(jìn)一步研究證實(shí)。

綜上所述，檢測外周血淋巴細(xì)胞亞群有助于了解腫瘤患者的機(jī)體細(xì)胞免疫狀況，監(jiān)測外周血Treg細(xì)胞有利于評估卵巢癌患者的病情進(jìn)展。對Treg細(xì)胞的功能特征及調(diào)節(jié)機(jī)制的進(jìn)一步研究可能為卵巢癌免疫治療提供有效的治療靶點(diǎn)。