封紀(jì)珍，賈立云，王熙，馬翠霞，封露露(石家莊市婦幼保健院遺傳科，石家莊050051)

遺傳代謝病(inherited metabolic disorders，IMD)是指由于基因突變引起維持機體正常代謝所必需的酶、受體或載體等發(fā)生缺陷而產(chǎn)生的疾病[1]。IMD病種繁多，常見的共900余種，包括氨基酸、有機酸和脂肪酸等代謝缺陷，多數(shù)為單基因遺傳病，遺傳方式以常染色體隱性遺傳為主，少數(shù)為常染色體顯性遺傳或X連鎖遺傳[2]。新生兒至成年期均可發(fā)病，發(fā)病初期無特異性，難以識別，死亡率高[3]。通過檢測代謝物質(zhì)的濃度水平，可實現(xiàn)新生兒期對部分氨基酸代謝病、有機酸血癥及脂肪酸氧化代謝病的檢測。串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)可根據(jù)每種物質(zhì)具有特征性的帶電離子，通過測定特征離子峰強度進行定量分析，一次實驗完成多種分析物的檢測，可檢出40余種IMD。串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)應(yīng)用于新生兒疾病篩查，可及早發(fā)現(xiàn)更多IMD患兒[4-5]。石家莊市新生兒疾病篩查診治中心于2014年1月在河北省內(nèi)開展新生兒IMD篩查工作，為了解石家莊市新生兒IMD患病率及基因突變情況，本研究對2014年1月至2018年5月出生的128 399例活產(chǎn)新生兒篩查情況進行了回顧性分析，報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 2014年1月至2018年5月在石家莊市15個縣區(qū)所轄的26個助產(chǎn)機構(gòu)、7個市區(qū)所轄的12個助產(chǎn)機構(gòu)分娩的128 399例活產(chǎn)新生兒(出生后3～20 d)，經(jīng)本篩查中心串聯(lián)質(zhì)譜篩查并確診的102例IMD患兒。篩查前家長均簽署知情同意書，本研究通過石家莊市婦幼保健院醫(yī)學(xué)倫理學(xué)委員會審核批準(zhǔn)(No.202019)。

1.2儀器與試劑 NextSeq 500高通量測序儀(美國Illumia公司)；Waters TQD串聯(lián)質(zhì)譜儀、Waters 2777C自動進樣器、Waters 1525μ高效液相色譜儀泵、MassLynxV4.1串聯(lián)質(zhì)譜篩查信息系統(tǒng)(美國Waters公司)；微孔板恒溫溫育震蕩儀(杭州奧盛儀器公司)；Nanodrop 2000超微量分光光度計(美國Thermo公司)?；蚪MDNA提取試劑盒(美國Qiagen公司);串聯(lián)質(zhì)譜—非衍生化多種氨基酸、?；鈮A及游離肉堿測定試劑盒(可檢測11種氨基酸、30種?；鈮A及游離肉堿，包含相應(yīng)穩(wěn)定同位素標(biāo)記的標(biāo)準(zhǔn)品，濟南英盛公司)；氨基酸內(nèi)標(biāo)分別為15N,2-13C-甘氨酸(15N,2-13C-Glycine，15N,2-13C-Gly)、2H4-丙氨酸(2H4-Alanine,2H4-Ala)、2H8-纈氨酸(2H8-Valine,2H8-Val)、2H2-鳥氨酸(2H2-Ornithine,2H2-Orn)、2H4,5-13C-精氨酸(2H4,5-13C -Arginine,2H4,5-13C-Arg)、2H3-亮氨酸(2H3-Leucine,2H3-Leu)、2H3-甲硫氨酸(2H3-Methionine,2H3-Met)、13C6-苯丙氨酸(13C6-Phenylalanine,13C6-Phe)、13C6-酪氨酸(13C6-Tyrosine,13C6-Tyr)、2H2-瓜氨酸(2H2-Citrulline,2H2-Cit)、13C5-脯氨酸(13C5-Proline,13C5-Pro)。游離肉堿和?；鈮A內(nèi)標(biāo)品分別為2H9-游離肉堿(2H9-carnitine,2H9-C0)、2H3-乙?；鈮A(2H3-acetylcarnitine,2H3-C2)、2H3-丙酰基肉堿(2H3-propionylcarnitine,2H3-C3)、2H3-丁?；鈮A(2H3-butyrylcarnitine,2H3-C4)、2H9-異戊?；鈮A(2H9-isovalerylcarintine,2H9-C5)、2H3-戊二?；鈮A(2H3-glutarylcarnitine,2H3-C5DC)、2H3-己?；鈮A(2H3-hexanoylcarnitine,2H3-C6)、2H3-辛?；鈮A(2H3-octanoylcarnitine,2H3-C8)、2H3-葵?；鈮A(2H3-decanoylcarnitine,2H3-C10)、2H3-月桂?；鈮A(2H3-lauroylcarnitine,2H3-C12)、2H9-肉豆蔻?；鈮A(2H9-myristoylcarnitine,2H9-C14)、2H3-棕櫚酰基肉堿(2H3-palmitoylcarnitine,2H3-C16)、2H3-十八碳?；鈮A(2H3-octadecanoylcarnitine,2H3-C18)。

1.3標(biāo)本采集 新生兒出生72 h，充分哺乳6～8次后，由各接產(chǎn)醫(yī)院產(chǎn)科工作人員于足跟兩側(cè)采集3個直徑>8 mm、圓形均勻血斑于S&S903濾紙片，懸空自然晾干2～3 h，置于密封袋封口，最遲不超過5個工作日送至篩查中心，置于4 ℃保存待檢。

1.4實驗操作和質(zhì)量控制 用打孔器取直徑3 mm質(zhì)控樣本和待測樣本血斑，置于U型底96孔微孔板中。每孔加入90 μL萃取工作液，30 ℃、700 r/min震蕩溫育45 min。轉(zhuǎn)移75 μL上清液至V型底96孔板的對應(yīng)位置，覆上鋁箔紙以減少揮發(fā)。將V型板放入自動進樣器中，建立樣品列表，采用多反應(yīng)監(jiān)測模式進行檢測，采用MassLynxV4.1串聯(lián)質(zhì)譜篩查信息系統(tǒng)，通過比較分析物和內(nèi)標(biāo)分析物的信號積分面積進行計算，公式：C分析物=I分析物×V樣本×CIS/(IIS×VBS×RRF)，C分析物：目標(biāo)分析物濃度(μmol/L)；I分析物：目標(biāo)分析物質(zhì)譜響應(yīng)強度(計數(shù)每秒)；V樣本：樣本提取量(μL)；CIS：內(nèi)標(biāo)濃度(μmol/L)；IIS：內(nèi)標(biāo)質(zhì)譜響應(yīng)強度(每秒計數(shù))；VBS：1個DBS血斑所含血量(1個3 mm的DBS血斑在55%血細(xì)胞比容時相當(dāng)于3.2 μL血量)；RRF：相對響應(yīng)因子(提取效率)。檢測過程中將質(zhì)控品及樣品共同測定，質(zhì)控品的處理方法及上機檢測條件與樣本一致。高、低質(zhì)控品的檢測值在靶值±2s范圍內(nèi)，實現(xiàn)對檢測過程的質(zhì)量控制，以及每年參加國家衛(wèi)健委臨床檢驗中心的室間質(zhì)量評價并取得合格證書。

1.5結(jié)果分析及可疑陽性判讀 制定本實驗室的參考范圍，根據(jù)串聯(lián)質(zhì)譜檢測結(jié)果進行代謝分析，判斷代謝正?；虍惓?，按照篩查疾病的代謝特征進行代謝病診斷，得到篩查陰性或陽性結(jié)果。

1.6確診試驗 對于篩查陽性患兒，進一步采用尿氣相色譜質(zhì)譜進行生化確診試驗。抽取部分患兒及父母外周靜脈血各4 mL，2%乙二胺四乙酸二鈉抗凝，按照基因組DNA提取試劑盒說明書對樣本進行核酸提取，使用Nanodrop 2000超微量分光光度計對DNA進行質(zhì)檢，檢測合格后進行基因組文庫構(gòu)建。用生物素標(biāo)記的探針與文庫DNA進行雜交，用鏈霉親合素修飾的磁珠共價結(jié)合生物素標(biāo)記的探針抓取目的基因，磁力架吸附攜帶目的基因的磁珠，洗脫純化，富集目的基因。采用NextSeq 500高通量測序儀測序。所有數(shù)據(jù)應(yīng)用SOAPsnp程序進行單核苷酸序列多態(tài)分析，對于檢測到的變異位點嚴(yán)格按照ACMG指南[6]進行致病性分析。對于未報道新發(fā)突變，使用生物信息學(xué)蛋白質(zhì)功能預(yù)測軟件SIFT、PolyPhen_2、MutationTaster、GERP++、REVEL對致病性進行預(yù)測。對發(fā)現(xiàn)的致病突變在其所在片段上、下游設(shè)計引物進行PCR擴增及Sanger測序，從而驗證高通量測序的結(jié)果。對患兒父母采用Sanger法進行目標(biāo)基因突變驗證。以上基因檢測由北京邁基諾醫(yī)學(xué)檢驗所完成。

2 結(jié)果

2.1患病率及陽性預(yù)測值 共計篩查128 399例新生兒，初篩可疑陽性3 811例，可疑陽性率為2.97%；召回3 620例，確診102例，陽性預(yù)測值為2.8%(102/3 620)，未發(fā)現(xiàn)漏診病例。氨基酸代謝類患病率較高的為苯丙酮尿癥，患病率為1/3 669；有機酸患病率較高的為甲基丙二酸血癥，患病率為1/3 776；脂肪酸代謝障礙患病率較高的為原發(fā)性肉堿缺乏癥，患病率為1/14 267，見表1。

2.2確診陽性患兒的篩查結(jié)果 對102例確診患兒的串聯(lián)質(zhì)譜初篩及復(fù)查結(jié)果進行分類統(tǒng)計，結(jié)果見表2。目前采用的參考范圍是根據(jù)本篩查中心篩查的近10萬例健康新生兒制定的適合本實驗室的參考范圍(百分位數(shù)法，上限值采用99.5百分位，下限值采用0.5百分位)。

表1 石家莊市新生兒遺傳代謝病串聯(lián)質(zhì)譜篩查整體情況

表2 102例患兒特異性標(biāo)志物及相關(guān)比值篩查結(jié)果(μmol/L)

2.3PAH基因突變譜 35例苯丙酮尿癥患兒中有6例未進行基因檢測，其余29例患兒基因檢測結(jié)果均為PAH基因雜合或復(fù)合雜合突變，其中雜合突變4例；復(fù)合雜合突變25例，共檢出23種突變位點，依據(jù)ACMG遺傳變異分類標(biāo)準(zhǔn)與指南[6]中的致病情況分別為致病性12個位點、可能致病性10個位點，意義不明確1個位點。本研究檢出的4例雜合突變患兒血苯丙氨酸濃度均持續(xù)≥116 μmol/L，基因測序僅檢測到1個突變位點。此外，突變來源除1例未知，其余均來自父親或母親。檢出的23種突變中3種未見報道，分別為.912+5G>T、c.61-1G>A和c.630T>G。突變頻率較高是c.158G>A，為0.167%(9/54);其次為c.728G>A，為0.130%(7/54);再次為c.1068 C>A，為0.093%(5/54)和c.611A>G，為0.074%(4/54)。其余位點c.1238G>C和c.1197A>T突變頻率為0.056%(3/54)；c.739G>C、c.320A>G、c.721C>T、c.1071 C>A、c.442-1G>A和c.1301C>A突變頻率為0.037%(2/54)；c.740G>T、c.1315+6T>A、c.331C>T、c.1123C>G、c.913-7A>G、c.482T>C、c.1252A>C、c.975C>G、c.912+5G>T、c.61-1G>A和c.630T>G突變頻率為0.019%(1/54)。除外顯子1、外顯子4和外顯子13，其他外顯子均有分布，具體突變外顯子位置見圖1。

圖1 PAH基因突變譜

2.4高脯氨酸血癥及高甲硫氨酸血癥患兒基因檢測結(jié)果 氨基酸代謝障礙中5例高甲硫氨酸血癥患兒均為單純型，不伴有同型半胱氨酸升高；基因檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)MAT1A基因復(fù)合雜合突變患兒1例，MAT1A基因雜合突變患兒4例。MAT1A基因遺傳方式為常顯/常隱，因此，單純雜合突變可致病。5例患兒隨訪發(fā)現(xiàn)除1例存在肝損傷，基因型為c.1086-3C>G*/c.712G>A*/c.188G>T*外，其余4例患兒無明顯臨床表型。此外，3例高脯氨酸血癥患兒基因檢測發(fā)現(xiàn)，PRODH基因復(fù)合雜合突變患兒有2例，另1例患兒經(jīng)二代測序基因缺失重復(fù)分析發(fā)現(xiàn)PRODH基因整體雜合缺失，且均為高脯氨酸血癥Ⅰ型，3例患兒未給予治療，現(xiàn)發(fā)育正常。具體突變位點及變異來源見表3。

表3 高脯氨酸及高甲硫氨酸血癥患兒基因檢測結(jié)果

注：*，未報道基因突變；fs*7，由于基因突變造成移碼突變，編碼7個氨基酸后終止。

2.5甲基丙二酸患兒基因檢測結(jié)果 對34例甲基丙二酸血癥患兒中的10例進行了基因突變檢測，發(fā)現(xiàn)2例MUT型患兒，均為MUT基因復(fù)合雜合突變，變異來源于父母；8例合并型患兒，其中純合突變患兒3例，分別為c.609G>A純合突變1例和c.482G>A純合突變2例；雜合突變1例，為HCFC1基因c.4442C>T雜合突變；另有1例同時檢測到MMACHC基因c.599G>A、c.656_658delAGA雜合突變及HCFC1基因c.4535A>T雜合突變；其余均為MMACHC基因復(fù)合雜合突變，見表4。

表4 10例有機酸代謝異常患兒基因診斷結(jié)果

注：*，未報道基因突變。

2.6甲基丙二酸血癥患兒基因型與表型關(guān)系 34例甲基丙二酸患兒中3例為MUT型，其中1例對維生素B12治療有效，基因型為c.788G>T/c.724A>T，其余2例無效；31例合并型患兒中1例于新生兒早期夭折，基因型為c.656_658delAGA/ c.440_441delGT，其余30例患兒均為維生素B12有效型。甲基丙二酸患兒預(yù)后根據(jù)攜帶基因突變位點不同，其預(yù)后情況不同；8例合并型患兒中基因型為c.656_658delAGA/C.440_441dellGT的患兒于出生后10 d夭折；基因型分別為C.239A>G/ C.666C>A、C.4442C>T雜合突變的2例患兒未用藥，定期觀察；5例接受維生素B12、左卡尼汀、甜菜堿、亞葉酸鈣治療患兒中，3例發(fā)育遲緩，基因型分別為C.599G>A/C.656_658delAGA/C.4535A>T、C.609G>A/C.609G>A、C.80A>G/C.394C>T；其余2例C.482G>A/C.482G>A純合突變患兒無異常表現(xiàn)。

2.7脂肪酸β氧化障礙患兒基因檢測結(jié)果 9例原發(fā)性肉堿缺乏癥患兒中，4例進行了SLC22A5基因檢測，其中復(fù)合雜合1例、純合1例、雜合2例。2例雜合患兒血游離肉堿和?；鈮A水平持續(xù)下降，排除母源性，基因檢測僅發(fā)現(xiàn)1個突變，推測存在其他突變，檢測未發(fā)現(xiàn)。確診的4例短鏈酰基輔酶A脫氫酶缺乏癥患兒中，2例進行了基因突變檢測，均為ACADS基因復(fù)合雜合突變，見表5。

表5 6例脂肪酸氧化障礙患兒基因檢測結(jié)果

注：*，未報道基因突變。

3 討論

串聯(lián)質(zhì)譜篩查技術(shù)已經(jīng)成為新生兒疾病篩查的首選技術(shù)[7]。石家莊市新生兒疾病篩查診治中心自2014年開展此項技術(shù)，128 399例新生兒中共檢出102例陽性患兒，總體患病率為1/1 259，高于常州市楊宇奇等[7]報道的1/2 503，泰安市尹峰[8]所報道的1/3 434以及上海市田國力等[9]所報道的1/4 869，表明IMD患病率在不同地區(qū)存在差異，具有地域性。

本研究檢出苯丙酮尿癥患兒35例，在氨基酸代謝障礙中的患病率最高。苯丙酮尿癥由于PAH基因突變引起，該基因定位于12q23.2，由13個外顯子和12個內(nèi)含子組成[10]。文獻已報道500多種突變類型，分布于所有外顯子、內(nèi)含子和上下游的非翻譯區(qū)[11]。進行基因檢測的29例苯丙酮尿癥患兒中發(fā)現(xiàn)23種突變位點，3種尚未見報道，分別為c.912+5G>T、c.61-1G>A和c.630T>G。突變頻率較高的位點是c.158G>A(0.167)，除外顯子1、4和13外，其他均有分布，隨著篩查例數(shù)的增加，突變頻率及分布可能會有變化。

原發(fā)性肉堿缺乏癥是由于SLC22A5基因突變引起肉堿轉(zhuǎn)運蛋白功能缺陷所致的一種脂肪酸β氧化代謝病，屬于常染色體隱性遺傳[12]。此病可于任何年齡發(fā)病，是潛在致死性疾病[13]。國內(nèi)外報道患病率為1/21 089～120 000[9,14]。本研究發(fā)現(xiàn)9例患兒，患病率為1/14 267，與林壹明等[15]報道的1/11 073接近，在脂肪酸代謝障礙中的患病率最高。

短鏈?；o酶A脫氫酶缺乏癥是?；o酶A脫氫酶編碼基因ACADS缺陷引起線粒體脂肪酸氧化代謝障礙的一種常染色體隱性遺傳病，患病率為1/33 000～1/118 543[16]。本研究發(fā)現(xiàn)4例患兒，患病率為1/32 100。測序結(jié)果發(fā)現(xiàn)1例患兒為c.625 G>A/c.1130 C>T復(fù)合雜合突變；1例患兒為c.625 G>A/c.625 G>A/c.1157G>A復(fù)合雜合突變。其中c.1130 C>T、c. 1157G>A未見報道，經(jīng)生物信息學(xué)軟件分析可能致病。此外，檢出中鏈?；o酶A脫氫酶缺乏癥2例，患病率為1/64 200；檢出極長鏈?；o酶A脫氫酶缺乏癥1例，患病率為1/128 399，兩者患病率均較低。

本研究初步明確了石家莊市新生兒IMD總體、單病種患病率及基因突變情況；初步構(gòu)建了苯丙酮尿癥患兒基因突變譜；探討了甲基丙二酸血癥患兒基因型與臨床表型的關(guān)系；發(fā)現(xiàn)了多個未報道的基因突變，豐富了數(shù)據(jù)庫。但本研究有191例(5.01%)可疑患兒未能召回，同時部分患兒未進行基因檢測以明確病因。因此，今后應(yīng)該加大IMD篩查及基因檢測宣傳力度，提高篩查率及基因檢測率，降低出生缺陷發(fā)生率，并對家庭再生育提供指導(dǎo)。