顧秀玉，梁煒(南京醫(yī)科大學附屬蘇州醫(yī)院&蘇州市立醫(yī)院北區(qū)檢驗科,江蘇蘇州 215008)

目前，臨床胃癌篩查主要為血清學標志物檢測(CEA、CA72-4和CA199等)，但這些標志物的敏感性和特異性均不理想[1]。近年來，非編碼RNA因其功能多樣性、相對穩(wěn)定性、易檢測性成為腫瘤生物學標志物研究的熱點。長鏈非編碼RNA(long noncoding RNA, lncRNA)在細胞增殖、分化、遷移、細胞周期、細胞凋亡及腫瘤微環(huán)境調控等方面均具有重要的調控作用，可作為腫瘤篩查、預后判斷以及治療的潛在靶點[2]。研究表明，Linc00462在肝癌組織中顯著上調，敲減Linc00462可導致腫瘤侵襲性降低[3]；在胰腺癌中Linc00462可以促進體內外腫瘤的生長和遷移[4]。但Linc00462在胃癌中的表達和生物學功能目前尚不明確。本研究旨在檢測Linc00462在胃癌患者組織及血清中的表達水平，并分析其與患者臨床病理參數及預后情況的相關性，以評估Linc00462作為胃癌篩查和預后判斷分子標志物的可行性。

1 材料和方法

1.1研究對象 收集2013年7月至2016年6月于南京醫(yī)科大學附屬蘇州醫(yī)院行胃癌切除手術的80例患者的組織及血清標本，其中男58例，女22例，年齡52～86歲，中位年齡68歲。另收集其中60例患者的術前血清標本。納入標準：(1)經組織切片病理檢查確認為原發(fā)性胃癌；(2)均未進行放療、化療、中醫(yī)治療及其他輔助治療。排除標準：(1)排除轉移性腫瘤、復發(fā)性腫瘤以及其他良惡性腫瘤；(2)胃良性疾病患者；(3)排除患原發(fā)性全身性疾病如急慢性心力衰竭、肝臟疾病、腎功能障礙、糖尿病、敗血癥等患者。收集同期該院體檢健康者22例的血清標本，其中男15例，女7例，年齡55～78歲，中位年齡70歲。本研究經南京醫(yī)科大學倫理委員會批準，患者及家屬知情同意。

1.2標本采集及預處理 術中取蠶豆大小的新鮮癌組織及癌旁組織(距離癌組織5 cm以上，且證實無癌細胞)標本，在冰上剪碎、研磨形成懸液，置于-80 ℃保存。用無抗凝劑的真空采血管采集其中43例胃癌患者入院時(未經治療)的空腹靜脈血2 mL，3 000×g離心5 min,分離血清，分裝于RNAse-free的離心管后,置于-80 ℃保存。

1.3細胞系、主要儀器及試劑 人胃癌細胞系MKN-45和HGC-27購自廣州賽庫生物技術公司。Micro溫控離心機、ABI 2720型普通PCR基因擴增儀、 NanoDrop 1000分光光度儀(美國Thermo公司)；LightCycler 480 Ⅱ熒光定量PCR儀(德國Roche公司)； SI-A256渦旋震蕩儀(美國Scientific Industries公司)；Nikon Ti-u熒光倒置顯微鏡(日本Nikon公司)。胎牛血清(FBS)、高糖DMEM培養(yǎng)基(美國Gibco公司)；RPMI 1640培養(yǎng)基(美國Invitrogen公司)；二甲亞砜(DMSO)、氯仿、異丙醇、無水乙醇(上?；瘜W試劑公司)；胰蛋白酶(美國Amresco公司)； RNA小提試劑盒、血清miRNA/血漿RNA提取試劑盒、miScript Ⅱ逆轉錄試劑盒(德國凱杰公司)；Trizol試劑(美國Gibco公司)；熒光定量PCR Mixture(UltraSYBR)、逆轉錄試劑盒(北京康為世紀公司)；LipoFiter(上海漢恒生物科技公司)。

1.4RNA提取及逆轉錄反應 分別按照RNA小提試劑盒及血清miRNA/血漿RNA提取試劑盒說明書提取組織(細胞)和血清標本總RNA。采用NanoDrop 1000分光光度儀檢測核酸濃度，選取吸光度比值(A260/280 nm)為1.8～2.0的樣本用于后續(xù)實驗。按照逆轉錄試劑盒說明書將RNA逆轉錄為cDNA，置于-20 ℃保存。

1.5實時熒光定量PCR(qRT-PCR) 參照文獻[5]，用Primer Premier 5.0軟件設計引物，并由美國Invitrogen公司合成。Linc00462(NR_051983)上游引物序列(F)：5′-ACTAGGTCCTTCTGGTGTT-3′，下游引物序列(R)：5′-GTAAAACTTGCTGCTGATG-3′，退火溫度55 ℃，產物片段大小110 bp。內參U6(NC_015438.2)上游引物序列(F)：5′-CTCGCTTCG

GCAGCACA-3′，下游引物序列(R)：5′- AACGCTTC

ACGAATTTGCGT-3′，退火溫度55 ℃，產物片段大小94 bp。采用UltraSYBR Mixture熒光定量試劑盒及LightCycler 480 Ⅱ熒光定量PCR儀進行實時熒光定量PCR反應。PCR體系總反應體系為20 μL，包括2×SYBR Mixture 10 μL，10 μmol/L上、下游引物各0.5 μL，模板cDNA 1.5 μL， RNA free ddH2O補足體積至20 μL。PCR循環(huán)參數：95 ℃預變性10 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共40次循環(huán)；72 ℃ 5 min；4 ℃保存。于72 ℃時用熒光定量PCR儀配套LC480軟件采集熒光信號并進行熔解曲線分析，組織和血清樣本中的Linc00462的表達水平用-ΔΔCt法表示，細胞中的Linc00462表達水平用2-ΔΔCt法表示。

1.6細胞培養(yǎng)及轉染 取生長狀態(tài)良好的人胃癌細胞系MKN-45和HGC-27，用含100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素和10%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)液，置于37 ℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。調整細胞密度至2×105/孔，接種至6孔細胞培養(yǎng)板繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，按LipoFiter試劑說明書進行轉染，實驗分為3組(ctrl、sh-linc00642-1、sh-linc00642-2)，參照參考文獻[6]，將ctrl、sh-linc00642-1、sh-linc00642-2分別瞬時轉染入細胞，轉染終濃度為0.4 nmol/L，陰性對照轉染終濃度為0.4 nmol/L。

1.7生長曲線檢測 取上述1.5轉染后的3組細胞，置于37 ℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36 h，PBS洗滌2次，2.5 g/L胰蛋白酶消化并計數，經600×g離心5 min，PBS重懸后調整細胞濃度，以1×104/孔的細胞密度接種于24孔細胞培養(yǎng)板中。每隔24 h用2.5 g/L胰蛋白酶消化并計數1孔細胞，連續(xù)6 d，每2天換液1次，繪制生長曲線。實驗重復3次。

1.8平板克隆形成試驗 取上述轉染后的3組細胞，調整細胞濃度為1×104/孔，接種于6孔細胞培養(yǎng)板中。每3天換液1次，培養(yǎng)7 d后經4%多聚甲醛固定，結晶紫染色，光學顯微鏡下計數各組超過50個細胞的集落數量。實驗重復3次。

1.9Transwell遷移試驗 取上述1.5轉染后的3組細胞，用無血清RPMI-1640培養(yǎng)基調整細胞濃度為1×105/mL，取200 μL接種于Transwell遷移小室的上室中，下室加入600 μL含10%FBS的完全培養(yǎng)基，置于37 ℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，用4%多聚甲醛固定，結晶紫染色，光學顯微鏡下計數遷移的細胞數量。實驗重復3次。

1.10基質膠侵襲試驗 于實驗前3 h在Transwell遷移小室的上室中加入40 μL經1∶5稀釋的基質膠，置于37 ℃培養(yǎng)箱中凝固。取上述轉染后的3組細胞，PBS洗滌2次，2.5 g/L胰蛋白酶消化后計數，經600×g離心5 min，加入無血清RPMI-1640培養(yǎng)基調整細胞濃度為5×105/mL，取200 μL接種于上室中，下室加入600 μL含10%FBS RPMI-1640培養(yǎng)基，置于37 ℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，用4%多聚甲醛固定，結晶紫染色，光學顯微鏡下計數侵襲的細胞數量。實驗重復3次。

1.11統(tǒng)計學分析 采用SPSS 22.0統(tǒng)計學軟件進行分析。兩組間比較用兩樣本參數的t檢驗，率的比較采用χ2檢驗，采用GrapgPad Prism 5.0軟件繪制ROC曲線并作圖。生存時間分析采用Kaplan-Meier檢驗和對數秩檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1Linc00462在組織及血清中的表達 qRT-PCR檢測結果表明，胃癌組織中Linc00462的表達水平(-5.86±2.43)較配對癌旁組織(-7.01±3.02)顯著升高(t=4.008,P<0.001)；此外，胃癌患者血清中Linc00462的表達水平(-8.60±3.08)較體檢健康者(-10.97±2.68)顯著升高(t=3.280,P<0.01)。

2.2胃癌組織中Linc00462的表達水平與患者臨床病理參數的相關性 以中位數0.63為界，將患者分為Linc00462高表達組和Linc00462低表達組[6]。胃癌組織Linc00462的表達水平與患者的腫瘤大小(χ2=9.785,P=0.037)、分化程度(χ2=4.467,P=0.037)、脈管癌栓(χ2=13.745,P=0.004)及神經侵犯(χ2=7.355,P=0.005)相關。見表1。

表1 胃癌組織Linc00462表達水平與患者臨床病理參數的相關性分析

參數例數表達量χ2P性別0.0190.631 男581.30±2.77 女220.97±2.81年齡(歲)0.0320.130 <60150.23±1.98 ≥60651.43±2.88腫瘤大小(cm)9.7850.037 <5350.48±2.37 ≥5451.78±2.94分化程度4.4670.037 較差701.45±2.83 較好10-0.49±1.41淋巴結轉移0.7510.354 無290.83±2.65 有511.43±2.83脈管癌栓13.7450.004 無27-0.03±2.03 有531.84±2.89神經侵犯7.3550.005 無20-0.26±2.35 有601.70±2.74浸潤深度2.0420.464 全層311.52±3.40 非全層491.01±2.30組織分型0.8330.690 腺癌741.28±2.85 印戒細胞癌3-0.03±0.13 其他30.69±1.43腫瘤位置1.3740.399 賁門321.47±2.90 胃竇 220.51±2.24 胃體191.14±2.51 其他72.40±4.12

2.3ROC曲線分析Linc00462篩查胃癌的效能 以胃癌患者作為實驗組，體檢健康者作為對照組，用ROC曲線評估血清Linc00462篩查胃癌的效能，結果表明其ROC曲線下面積(AUCROC)為0.77，95%可信區(qū)間(confidence interval,CI)為0.65～0.99，當cut-off值為-7.030時，其敏感性為0.58，特異性為0.89。見圖1。

圖1 ROC曲線評估胃癌患者血清Linc00462的篩查效能

2.4血清Linc00462表達水平與胃癌患者臨床病理參數的相關性 血清Linc00462表達水平與胃癌患者的腫瘤大小(χ2=16.099,P=0.008)和分化程度(χ2=16.335,P=0.006)相關。見表2。

表2 血清Linc00462表達水平與胃癌患者臨床病理參數的相關性分析

參數例數表達量χ2P性別1.3620.866 男35-8.92±2.66 女8-9.11±3.83年齡(歲)1.2710.082 <607-7.24±2.88 ≥6036-9.29±2.77腫瘤大小(cm)16.0990.008 <521-10.10±3.00 ≥522-7.86±2.28分化程度16.3350.006 較差32-8.27±2.73 較好11-10.95±2.33淋巴結轉移0.2830.527 無16-9.32±3.21 有27-8.74±2.67脈管癌栓1.0440.355 無26-9.28±2.90 有17-8.45±2.80神經侵犯0.5730.236 無21-9.49±2.74 有22-8.45±2.94浸潤深度0.9730.608 全層20-8.71±2.67 非全層23-9.17±3.06組織分型0.2910.416 腺癌41-8.88±2.88 其他2-10.58±2.35腫瘤位置6.0790.070 賁門20-10.10±2.23 胃竇 4-8.26±2.65 胃體12-8.36±3.26 其他7-7.11±3.03

2.5Linc00462表達水平與胃癌患者預后情況的相關性 Linc00462高表達組的生存時間較Linc00462低表達組(中位生存時間：26.5個月vs 37個月)顯著縮短(χ2=6.005,P=0.014)。見圖2。

圖2 Linc00462高表達組和低表達組的生存率比較

2.6敲減Linc000462對胃癌細胞的增殖、遷移及侵襲能力的影響 生長曲線和平板克隆試驗表明，敲減Linc00462后，胃癌細胞系MKN-45和HGC-27中 sh-linc00642-1組及sh-linc00642-2組的增殖能力顯著低于ctrl組(P均<0.01)。在Linc00462敲減后，各組間細胞遷移數差異有統(tǒng)計學意義(P均<0.01)。與ctrl組相比，linc00642-1組和linc00642-2組的胃癌細胞遷移能力明顯降低(P均<0.01)。Linc00462敲減后，各組間細胞侵襲的數量差異有統(tǒng)計學意義(P均<0.01)。與ctrl組相比，linc00642-1組和linc00642-2組的胃癌細胞侵襲能力明顯降低(P均<0.01)。見圖3。

3 討論

近年研究表明,lncRNA在包括胃癌在內的惡性腫瘤中異常表達，且在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中起重要的作用[7-9]。Li等[10]發(fā)現胃癌組織中MIR100HG的表達水平與胃癌患者的臨床分期、腫瘤浸潤、淋巴結轉移和遠處轉移呈正相關，且MIR100HG高表達與胃癌患者的不良預后相關(P<0.05)。本研究發(fā)現Linc00462在胃癌組織及血清標本中的表達水平異常升高，可能作為潛在的胃癌篩查生物學標志物。Linc00462位于13號染色體上，由1 023個核苷酸組成。有學者發(fā)現，肝細胞癌患者腫瘤組織中Linc00462的表達顯著上調，敲減Linc00462引起腫瘤細胞增殖和遷移能力減弱[2]。本研究結果表明，在胃癌組織和血清中高表達的Linc00462與患者腫瘤大小、分化程度、脈管癌栓及神經侵犯相關；敲減Linc00462引起胃癌細胞增殖減緩，細胞遷移和侵襲能力減弱，與上述文獻報道相符。Linc00462在肝細胞癌中的功能可能與PI3K/AKT信號通路的活化有關。Wang等[11]發(fā)現在高糖誘導的糖尿病腎病中敲減Linc00462可以通過激活AKT途徑減輕腎小管上皮細胞的氧化應激和凋亡作用。以上研究表明，Linc00462的生物學功能與AKT信號通路密切相關，但Linc00462在胃癌進展中的作用是否依賴AKT信號通路調控仍需進一步實驗證明。此外，有學者還發(fā)現Linc00462在胰腺癌組織中的表達水平也顯著上調，且與患者腫瘤大小、分化、TNM分期和有無遠處轉移相關。其進一步研究表明，Linc00462/miR-665/TGFBR1-TGFBR2/SMAD2/3通路可促進胰腺癌細胞增殖和轉移[3]。本實驗結果證實，Linc00462在胃癌中具有類似于其在肝細胞癌及胰腺癌中的促進腫瘤細胞增殖和遷移的功能，但Linc00462在胃癌中的作用機制目前尚不明確。

注：A，qRT-PCR檢測胃癌細胞系MKN-45和HGC-27中敲減Linc00462后Linc00462的表達水平，***,與sh-ctrl組比較，P<0.001；B，生長曲線檢測胃癌細胞系MKN-45和HGC-27中敲減Linc00462后細胞增殖能力，***,與sh-ctrl組比較，P<0.001；C，平板克隆試驗檢測胃癌細胞系MKN-45和HGC-27中敲減Linc00462后細胞克隆形成能力；D，Transwell遷移試驗檢測胃癌細胞系MKN-45和HGC-27中敲減Linc00462后細胞遷移能力(×100，標尺=100 μm) ，與sh-ctrl組比較，**,P<0.01，***,P<0.001；E，基質膠侵襲試驗檢測胃癌細胞系MKN-45和HGC-27中敲減Linc00462后細胞侵襲能力(×100，標尺=100 μm)，**,與sh-ctrl組比較，P<0.01。

圖3 Linc00462敲減后檢測胃癌細胞的增殖、遷移和侵襲能力

本研究通過ROC曲線分析發(fā)現血清Linc00462檢測胃癌的AUCROC為0.77，優(yōu)于胃癌組織標本的直接檢測，并優(yōu)于經典的胃癌篩查標志物CEA、CA72-4和CA199(數據末羅列)，且Linc00462的表達水平與患者預后相關，可能作為新的胃癌篩查及預后判斷的生物學標志物。本研究目前仍存在以下不足之處：首先，本研究并未進行術前和術后以及是否復發(fā)的患者血清Linc00462的對比檢測，對Linc00462在胃癌中的篩查價值評估不夠全面；其次，本研究缺乏體內實驗，無法驗證Linc00462的體內作用；第三，對Linc00462促進胃癌細胞增殖、遷移及侵襲的作用機制仍不明確。在后續(xù)研究中，我們將繼續(xù)探究Linc00462在胃癌中的作用機制，以期為胃癌臨床篩查、預后判斷以及惡性進展機制的研究提供新的思路。