楊培峰，單婉婉，張琳琳，于海洋，聶付芳，趙嵐嵐(鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院.產(chǎn)科,.檢驗(yàn)科, 鄭州450052)

在妊娠早期進(jìn)行頸項(xiàng)透明層(nuchal translucency，NT)的篩查，可以盡早發(fā)現(xiàn)染色體及結(jié)構(gòu)異常的NT增厚胎兒[1]。染色體微陣列(chromosomal microarray，CMA)檢測技術(shù)相比于常規(guī)核型分析具有更多的優(yōu)勢，如其可以檢測<1×105bp的基因組拷貝數(shù)變異(copy number variations，CNVs)，發(fā)現(xiàn)某些用染色體核型分析無法檢測出的微缺失或微重復(fù)，故而被公認(rèn)為是臨床上首選的產(chǎn)前胎兒結(jié)構(gòu)異常檢測方法[2]。本研究回顧性分析我院2018年NT增厚胎兒的CMA檢測結(jié)果，并探討NT增厚胎兒在合并有其他超聲異常時(shí)染色體異常發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)及其臨床應(yīng)用價(jià)值，以期為臨床咨詢提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 對象與方法

1.1研究對象 回顧性分析2018年1月至12月就診于鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院且經(jīng)孕11～13+6周超聲篩查診斷為胎兒NT增厚的孕婦305例，孕婦年齡(29.9±5.0)歲，孕周11～24周，其中單胎300例，雙胎中1胎NT增厚5例。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)NT≥2.5 mm；(2)伴或不伴有其他超聲結(jié)構(gòu)的異常；(3)進(jìn)行介入性產(chǎn)前診斷CMA檢測。胎兒NT范圍為2.5～12.8 mm,其中262例為單純NT增厚，43例伴有其他異常(包括34例淋巴水囊瘤，3例單臍動(dòng)脈，3例脈絡(luò)叢囊腫，3例鼻骨缺失)。本研究經(jīng)鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理學(xué)委員會(huì)批準(zhǔn)，孕婦及其家屬均知情同意。

1.2主要儀器與試劑 Voluson E8 三維彩色多普勒超聲診斷儀及腹部三維超聲容積探頭(4～8 MHz)購自美國GE公司；Nanodrop分光光度計(jì)(美國Themo Fisher Scientific公司)。高分辨率全基因組CytoScan HD芯片(美國Affymetric公司)；Gentra Puregene Cell Kit_DNA提取試劑盒(美國Qiagen公司)。

1.3超聲檢查 超聲檢查由超聲科醫(yī)師采用Voluson E8三維彩色多普勒超聲診斷儀及腹部三維超聲容積探頭(4～8 MHz)檢測，檢查孕周為孕11～13+6周，嚴(yán)格按照國際婦產(chǎn)科超聲協(xié)會(huì)(International Society of Ultrasound in Obstetrics and Gynecology，ISUOG)發(fā)布的妊娠早期胎兒超聲檢查指南[3]中的NT值質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行結(jié)果判讀，以NT≥2.5 mm診斷為NT增厚。

1.4介入性產(chǎn)前診斷 305例孕婦中，有177例孕婦于11～13+6孕周接受經(jīng)腹絨毛穿刺取材術(shù)，抽取絨毛組織4～8 mg；另外128例孕婦于18～24孕周接受羊膜腔穿刺術(shù)，采集羊水20～30 mL。所有穿刺均在超聲引導(dǎo)下由具有產(chǎn)前診斷資質(zhì)的醫(yī)師操作。

1.5實(shí)驗(yàn)室檢查

1.5.1實(shí)驗(yàn)分組 根據(jù)NT厚度的不同分為2.5～2.9 mm、3.0～3.4 mm、3.5～3.9 mm、4.0～4.9 mm、≥5 mm 5組，采用常規(guī)的染色體核型分析及CMA檢測技術(shù)分別比較不同組間胎兒染色體數(shù)目異常及拷貝數(shù)異常發(fā)生情況。根據(jù)是否合并其他超聲異常(如淋巴水囊瘤、單臍動(dòng)脈、脈絡(luò)叢囊腫、鼻骨缺失等)，分為合并超聲異常組(43例)和單純組(262例)，進(jìn)一步比較兩組染色體異常發(fā)生情況。

1.5.2DNA提取 按照Gentra Puregene Cell Kit_DNA提取試劑盒說明書提取羊水、絨毛或臍帶組織基因組DNA。采用Nanodrop分光光度計(jì)檢測DNA質(zhì)量及濃度，取吸光度(A260/280 nm)為1.8～2.0的樣本，置-20 ℃保存。

1.5.3CMA檢測及結(jié)果判讀 采用短串聯(lián)重復(fù)序列(STR)位點(diǎn)比對法進(jìn)行母血污染鑒定[3]，確認(rèn)無母血污染后進(jìn)行CMA檢測。按照高分辨率全基因組CytoScan 750芯片說明書對孕婦的絨毛或羊水標(biāo)本進(jìn)行檢測。結(jié)果參照國際在線公開數(shù)據(jù)庫(包括DGV數(shù)據(jù)庫、Decipher數(shù)據(jù)庫、OMIM數(shù)據(jù)庫等)比對后，CNV判讀為3種類型：致病性、良性以及臨床意義不明的CNV(variants of unknown significance, VOUS)。CNVs致病性判讀參照美國醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)與基因組學(xué)學(xué)會(huì)(ACMG)判讀指南[4]進(jìn)行。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)數(shù)資料用頻數(shù)及百分率表示，兩組二分類資料及多組二分類變量資料的統(tǒng)計(jì)分析采用χ2檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1常規(guī)的染色體核型分析及CMA 檢測結(jié)果 CMA及常規(guī)的染色體核型分析均檢出59例(59/305,19.3%)染色體異常，分別為21三體31例、18三體11例、Turner綜合征(45，XO)8例、13三體2例、22三體1例、其他性染色體異常6例(47,XXY,3例；47,XXX,2例；47,XYY,1例)。此外，與常規(guī)的染色體核型分析相比，CMA多檢出5例致病性CNVs，同時(shí)還檢測出12例VOUS變異。5例致病性CNVs的結(jié)果見表1。其中1例染色體微重復(fù)經(jīng)染色體核型分析證實(shí)為染色體不平衡易位所致，另有1例為DMD基因變異經(jīng)父母驗(yàn)證證實(shí)為母親來源。

2.2不同NT值的胎兒染色體異常結(jié)果的比較 隨著NT厚度增加，2.5～2.9 mm組、3.0～3.4 mm組、3.5～3.9 mm組、4.0～4.9 mm組、≥5.0 mm組胎兒染色體異常發(fā)生率依次增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表2。

表1 NT增厚孕婦CMA檢測致病性微缺失、微重復(fù)結(jié)果

注：*，46XX18der(18)t(9:18)(q13:p11.21)； #，男性胎兒，DMD；母親為DMD基因3～9號外顯子雜合缺失突變攜帶者。

表2 NT厚度與胎兒染色體異常發(fā)生的關(guān)系

2.3NT增厚合并超聲異常孕婦胎兒染色體異常發(fā)生情況的比較 305例孕婦中單純NT增厚胎兒染色體異常發(fā)生率為16.4%(43/262)，合并有其他異常(伴隨有淋巴水囊瘤、單臍動(dòng)脈、脈絡(luò)叢囊腫、鼻骨缺失、腦室增寬等超聲異常)的胎兒染色體異常發(fā)生率為44.2%(19/43)，兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=16.25，P<0.05)。

3 討論

本研究對305例NT增厚的胎兒進(jìn)行CMA檢測，共發(fā)現(xiàn)64例染色體異常，包括21三體者(31例)、18三體者(11例)、13三體者(2例)、Turner綜合征者(8例)、22三體(1例)和其他性染色體異常(6例)；此外，還發(fā)現(xiàn)5例經(jīng)常規(guī)染色體核型分析不能檢出的致病性CNVs，與Christiansen等[5]研究結(jié)果較為一致。既往的研究結(jié)果表明，隨著NT的增厚，胎兒染色體異常比例逐漸增加[6-7]。本研究中NT值為2.5～2.9 mm、3.0～3.4 mm、3.5～3.9 mm、4.0～4.9 mm、≥5.0 mm時(shí)，胎兒染色體異常率分別為5.6%、14.4%、22.4%、25.0%和42.3%，亦符合上述參考文獻(xiàn)結(jié)果。目前，國外眾多學(xué)者將NT增厚的標(biāo)準(zhǔn)定為≥3.5 mm，然而，在本研究中NT值為2.5～3.5 mm的胎兒染色體異常率為12.3%(14/114)。而Maya等[8]也建議，在NT值超過3.0 mm時(shí)就應(yīng)進(jìn)行CMA檢查。因此，對于NT增厚進(jìn)行產(chǎn)前診斷的臨界值的判定標(biāo)準(zhǔn)仍需要更多的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)支持。

目前，CMA檢測越來越多地被用于妊娠早期的產(chǎn)前診斷。本研究也發(fā)現(xiàn)，在妊娠早期NT增厚的胎兒中，采用CMA可以檢出約2.0%(5/246)的常規(guī)染色體核型分析無法檢測出的致病性CNVs，略低于Egloff等[9]報(bào)道的2.7%。Grande等[10]對17項(xiàng)研究進(jìn)行薈萃(meta)分析后認(rèn)為，采用CMA技術(shù)可以在染色體核型分析正常的胎兒中多檢出4%(95%CI：2%～7%)的致病性CNVs，表明CMA能明顯提高染色體異常的檢出率。此外，本研究還檢出3.9%(12/305)的VOUS，但由于數(shù)據(jù)庫中具有完整臨床資料的病例數(shù)有限，產(chǎn)生的VOUS可能會(huì)給臨床醫(yī)師的診斷帶來新的挑戰(zhàn)，因此，應(yīng)做好檢測前的咨詢工作[11]。

臨床上對于NT增厚的胎兒多考慮進(jìn)行綜合征的篩查。如Egloff等[9]對1 076例胎兒檢測后發(fā)現(xiàn)36例CNVs,其中7例CNVs(5例微重復(fù)，2例微缺失)發(fā)生于22q11.21區(qū)域，此外還發(fā)現(xiàn)1例1q21.1微缺失；麥明琴等[6]及杜柳等[7]亦在對妊娠早期NT增厚胎兒研究時(shí)分別發(fā)現(xiàn)1例22q11.21區(qū)域的微缺失。而本研究也發(fā)現(xiàn)1例22q11微缺失的患兒以及1例1q21.2區(qū)域2.9 MB的微缺失(包含1q21.1微缺失綜合征相關(guān)的區(qū)域)患兒，表明對NT增厚的胎兒進(jìn)行綜合征篩查至關(guān)重要。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)1例DMD基因的半合子缺失，經(jīng)染色體核型分析，患兒母親為DMD基因的雜合缺失攜帶者。本研究中NT增厚的胎兒伴隨的超聲異常均為超聲軟指標(biāo)的異常，但未發(fā)現(xiàn)合并嚴(yán)重的結(jié)構(gòu)畸形，分析原因可能與NT篩查時(shí)孕婦的孕周較小，很多結(jié)構(gòu)異常尚不能表現(xiàn)出來有關(guān)。