賴 櫞 鄭 雪 魯衛(wèi)星

（1.北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029；2.北京中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院，北京 100029）

冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟?。–HD）簡(jiǎn)稱冠心病，是冠狀動(dòng)脈粥樣硬化引起血管阻塞、狹窄，使心肌細(xì)胞缺血缺氧或壞死引起的心臟病[1]。冠心病發(fā)病與動(dòng)脈粥樣硬化緊密相關(guān)，其機(jī)制主要集中在炎癥反應(yīng)和脂質(zhì)浸潤(rùn)這兩類學(xué)說上。

冠心病屬中醫(yī)學(xué)“胸痹”“真心痛”范疇，運(yùn)用中醫(yī)藥治療療效頗佳。其中燈盞細(xì)辛作為西南部地區(qū)少數(shù)民族的常用草本藥，具有活血通絡(luò)止痛、祛風(fēng)散寒的功效[2]，可用于治療因血瘀所致的各種疼痛不適。近年來，臨床上將燈盞細(xì)辛注射液用于治療心腦血管病的報(bào)道屢見不鮮。有研究表明，燈盞細(xì)辛所含的成分對(duì)神經(jīng)、心腦血管等靶器官具有明顯的保護(hù)作用，但其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)制仍不明確。本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法，對(duì)燈盞細(xì)辛進(jìn)行靶點(diǎn)、通路復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系研究，嘗試從多靶點(diǎn)、多通路角度說明燈盞細(xì)辛治療冠心病的可能機(jī)制?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 燈盞細(xì)辛化學(xué)成分收集與靶點(diǎn)篩選 通過運(yùn)用西北農(nóng)林科技大學(xué)自主研發(fā)的中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái) TCMSP（http：//tcmspw.com/index.php），在該平臺(tái)中以“燈盞細(xì)辛”為關(guān)鍵詞進(jìn)行初步檢索，得到燈盞細(xì)辛所有化學(xué)成分。在檢索結(jié)果中設(shè)置口服生物利用度（OB）≥30%，類藥性（DL）≥0.18為篩選參數(shù)，進(jìn)一步檢索燈盞細(xì)辛的化學(xué)成分。然后利用TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)平臺(tái)，對(duì)上述結(jié)果進(jìn)行系統(tǒng)搜索匹配，得到燈盞細(xì)辛有效成分的蛋白靶點(diǎn)。

1.2 疾病相關(guān)靶點(diǎn)篩選 以冠心病英文名稱“coronary disease”作為關(guān)鍵詞，在Genecards數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.genecards.org）中檢索與冠心病相關(guān)的靶點(diǎn)。

1.3 網(wǎng)絡(luò)模型構(gòu)建 將“1.1”及“1.2”中所得到的靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape3.6.1軟件進(jìn)行燈盞細(xì)辛有效成分和冠心病靶點(diǎn)之間的網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建。并將上述獲得的燈盞細(xì)辛有效成分靶點(diǎn)和冠心病疾病靶點(diǎn)上傳至在線韋恩圖（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/），得到燈盞細(xì)辛與冠心病的交集靶點(diǎn)，再利用STRING10.5數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//string-db.org）得到交集靶點(diǎn)相互作用關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖（PPI）。

1.4 富集分析 通過DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//david.ncifcrf.gov）將上述得到治療冠心病的靶點(diǎn)導(dǎo)入其中，設(shè)置閾值P＜0.05，對(duì)靶點(diǎn)生物過程（BP）、細(xì)胞組分（CC）、分子功能（MF）進(jìn)行GO富集分析和KEGG代謝通路富集分析，并采用線上繪圖工具Omic Share Tool（https：//www.omicshare.com/tools/index.php/）將富集結(jié)果可視化，以進(jìn)一步說明燈盞細(xì)辛治療冠心病的作用機(jī)制。

2 結(jié) 果

2.1 化學(xué)成分及其作用靶點(diǎn)分析 以“燈盞細(xì)辛”為關(guān)鍵字檢索到燈盞細(xì)辛的化學(xué)成分共49個(gè)，設(shè)置篩選參數(shù)OB≥30%，DL≥0.18后，得到燈盞細(xì)辛主要活性成分12個(gè)，剔除無對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)的1個(gè)成分，共獲得11個(gè)潛在有效成分。見表1。再次把燈盞細(xì)辛有效成分帶入TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索，得到有效成分相關(guān)的靶點(diǎn)331個(gè)。在Pharm Mapper中剔除所有重復(fù)的靶點(diǎn)，最后整理得到燈盞細(xì)辛有效靶點(diǎn)184個(gè)。在Gene cards數(shù)據(jù)庫(kù)中，以“coronary disease”為關(guān)鍵詞，檢索出冠心病相關(guān)靶點(diǎn)6 704個(gè)。

將燈盞細(xì)辛184個(gè)靶點(diǎn)與冠心病疾病靶點(diǎn)上傳至在線韋恩圖，得到兩者的交集靶點(diǎn)共155個(gè)，韋恩圖詳見圖1。交集靶點(diǎn)分別為：PTGS1、AR、PTGS2、PRSS1、NCOA2、RELA、EGFR、AKT1、VEGFA、CCND1、BCL2L1、CDKN1A、CASP9、MMP2、MMP9、MAPK1、IL10、RB1、JUN、IL6、CASP3、NFKBIA、MDM2、APP、MMP1、PC-NA、ERBB2、PPARG、HMOX1、CASP7、ICAM1、MCL1、BIRC5、IL2、CCNB1、IFNG、IL4、GSTP1、SLC2A4、INSR、CD40LG、PTGES、MET、AKR1B1、KCNH2、SCN5A、ADRB2、MMP3、F7、RXRA、ACHE、MAOB、BCL2、FOS、BAX、PLAU、EGF、ELK1、POR、ODC1、CASP8、RAF1、SOD1、PRKCA、HIF1A、STAT1、ACACA、CYP3A4、CYP1A2、CAV1、MYC、F3、GJA1、CYP1A1、IL1B、CCL2、SELE、VCAM1、CXCL8、PRKCB、DUOX2、NOS3、HSPB1、MGAM、NR1I2、CYP1B1、PLAT、THBD、SERPINE1、COL1A1、ALOX5、IL1A、MPO、NCF1、ABCG2、HAS2、NFE2L2、NQO1、PARP1、AHR、COL3A1、CXCL11、NR1I3、CLDN4、PPARA、PPARD、HSF1、CRP、CXCL10、CHUK、SPP1、RUNX2、E2F1、E2F2、CTSD、IGFBP3、IGF2、IRF1、ERBB3、PON1、DIO1、PCOLCE、HK2、RASA1、GSTM1、GSTM2、NOS2、CHRM1、ESR1、ADRA1A、SLC6A4、ESR2、MAPK14、GSK3B、CCNA2、ATP5F1B、PGR、SLC6A2、CHRM2、ADRA1B、IKBKB、MAPK8、PPP3CA、AKR1C3、SLPI、NR3C2、NR3C1、NCOA1、FOSL1、CYCS、ALOX12、NFATC1、EGLN1、NOX5、APOD。

表1 燈盞細(xì)辛有效活性成分

圖1 燈盞細(xì)辛有效成分與冠心病靶點(diǎn)交集

2.2 有效成分-靶點(diǎn)相互作用網(wǎng)絡(luò) 見圖2。通過Cytoscape3.6.1構(gòu)建燈盞細(xì)辛有效成分治療冠心病靶點(diǎn)相互作用網(wǎng)絡(luò)圖，右邊深色多邊形代表燈盞細(xì)辛，其外圈為燈盞細(xì)辛主要有效成分；左邊深色多邊形代表冠心病，其兩層外圈均為冠心病相關(guān)靶點(diǎn)；每條邊代表有效成分與作用靶點(diǎn)之間的關(guān)系。由圖可知，燈盞細(xì)辛有效成分與冠心病的內(nèi)圈靶點(diǎn)關(guān)聯(lián)邊比外圈邊更密集，因此內(nèi)圈的靶點(diǎn)為燈盞細(xì)辛治療冠心病的核心靶點(diǎn)，也體現(xiàn)了燈盞細(xì)辛治療冠心病多成分、多靶點(diǎn)共同作用的特點(diǎn)。

圖2 有效成分-靶點(diǎn)相互作用網(wǎng)絡(luò)圖

2.3 交集靶點(diǎn)相互作用網(wǎng)絡(luò) 將155個(gè)交集靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫(kù)得到交集靶點(diǎn)相互作用關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖，見圖3。圖中包括節(jié)點(diǎn)155個(gè)，邊2625條，節(jié)點(diǎn)代表靶點(diǎn)，邊代表作用靶點(diǎn)之間的關(guān)聯(lián)。節(jié)點(diǎn)發(fā)出的邊越多，則代表兩個(gè)靶點(diǎn)間的關(guān)聯(lián)越密切，發(fā)出邊越多的節(jié)點(diǎn)則越可能為網(wǎng)絡(luò)圖中的核心靶點(diǎn)基因。統(tǒng)計(jì)其中關(guān)聯(lián)度最高的前30個(gè)靶點(diǎn)，見圖4。

圖3 燈盞細(xì)辛與冠心病交集靶點(diǎn)

2.4 GO富集分析 將155個(gè)靶點(diǎn)信息導(dǎo)入DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)中，從生物過程、細(xì)胞組分、分子功能3個(gè)水平對(duì)關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行GO富集分析，分別得到生物過程（BP）條目2 155個(gè)，細(xì)胞組分（CC）條目60個(gè)、分子功能（MF）條目152個(gè)，并以P＜0.05篩選整合排名靠前的條目，分別取富集程度較高的前10個(gè)繪制成圖，見圖5。

圖4 PPI網(wǎng)絡(luò)核心基因統(tǒng)計(jì)圖

圖5 GO功能富集分析

2.5 KEGG通路富集分析 同樣通過DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)，對(duì)燈盞細(xì)辛治療冠心病的主要155個(gè)靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG通路富集分析，得到信號(hào)通路162條，同樣以P＜0.05篩選整合排名靠前的條目并選取其中所含靶點(diǎn)數(shù)量較高的前30條轉(zhuǎn)化為可視化圖，見圖6。

圖6 KEGG富集分析

3 討 論

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是采用網(wǎng)絡(luò)分析的模式，對(duì)中藥的物質(zhì)基礎(chǔ)、生物效應(yīng)及其藥效機(jī)制開展網(wǎng)格化、系統(tǒng)化的整合研究[3]。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的興起，將古今中外的信息、內(nèi)容、技術(shù)相融合，為現(xiàn)代研究中醫(yī)藥治療疾病的作用機(jī)制提供了更為廣闊的思路和方法。

本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法探討燈盞細(xì)辛治療冠心病的作用機(jī)制，結(jié)果得到11個(gè)有效成分，155個(gè)作用于冠心病的主要靶點(diǎn)。有效成分包括木樨草素、槲皮素、芒柄花素、山奈酚等[4-6]，有研究表明這些成分對(duì)心肌細(xì)胞具有保護(hù)作用。而從PPI網(wǎng)絡(luò)圖的分析中可知，燈盞細(xì)辛作用靶點(diǎn)與冠心病靶點(diǎn)之間相互影響，靶點(diǎn)間的關(guān)系錯(cuò)綜復(fù)雜，表明其治療作用機(jī)制復(fù)雜多樣。統(tǒng)計(jì)其中關(guān)聯(lián)性最高的靶點(diǎn)，位于前幾位的靶點(diǎn)分別為AKT1、IL-6、VEGFA、JUN、CASP3，這些靶點(diǎn)主要參與了細(xì)胞凋亡、血管生成、炎癥反應(yīng)等過程。AKT1是PI3K通路中的一個(gè)重要蛋白，是AKT 3個(gè)同種型蛋白結(jié)構(gòu)中的一種[7]。AKT又稱為蛋白激酶B，在葡萄糖代謝、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)錄中具有關(guān)鍵作用[8]；在心血管系統(tǒng)中一旦被胰島素、血小板衍化生長(zhǎng)因子（PDGF）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）、表皮生長(zhǎng)因子（EGF）等激活，這些生長(zhǎng)因子通過轉(zhuǎn)錄或翻譯機(jī)制調(diào)節(jié)AKT活性[9]。CASP3屬于凋亡蛋白酶亞科中的一種，其激活方式主要通過受損的細(xì)胞線粒體膜，從胞內(nèi)釋放到胞外來誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡[10]。AKT活化后可以調(diào)節(jié)VEGF介導(dǎo)的血管生長(zhǎng)，使內(nèi)皮細(xì)胞遷移來減慢心功能受損速度，同時(shí)通過抑制心肌細(xì)胞凋亡來增加心肌細(xì)胞活性[9]。IL-6由單核巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞產(chǎn)生，是一種常見的炎癥因子。它不僅可以引發(fā)血管壁損傷，另一方面還可誘導(dǎo)肝臟產(chǎn)生CRP，加速冠心病進(jìn)程[11]。黃樂等研究發(fā)現(xiàn)，隨著冠心病病變程度增加，血清中IL-6水平隨之增高，因此可推斷IL-6與冠心病呈正相關(guān)性[12]。JUN是組成轉(zhuǎn)錄因子AP-1（激活蛋白-1）的一類蛋白族，包括c-JUN、v-JUN、JUN B和JUN D這幾個(gè)亞單位。韓暢暢、伍培等研究認(rèn)為AP-1通過對(duì)各種生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化、凋亡以及炎癥等多種細(xì)胞過程，其中c-JUN蛋白對(duì)誘導(dǎo)炎性介質(zhì)分泌起重要作用[13-14]。綜上所述，本研究團(tuán)隊(duì)推測(cè)認(rèn)為燈盞細(xì)辛一方面通過激活A(yù)KT1蛋白保護(hù)心肌細(xì)胞，一方面單獨(dú)通過抑制IL-6介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，減緩炎癥反應(yīng)造成的冠脈粥樣硬化；同時(shí)從JUN蛋白方面調(diào)控炎性介質(zhì)分泌，從而減慢冠心病形成過程中的炎癥反應(yīng)。由此說明，燈盞細(xì)辛治療冠心病可能是依靠多靶點(diǎn)相互影響、共同調(diào)節(jié)的作用機(jī)制。

本研究對(duì)燈盞細(xì)辛治療冠心病的155個(gè)主要靶點(diǎn)進(jìn)行GO生物過程富集，主要涉及氧化應(yīng)激反應(yīng)、代謝反應(yīng)等。KEGG富集分析結(jié)果顯示，燈盞細(xì)辛主要參與PI3K-Akt信號(hào)通路、糖尿病并發(fā)癥中的AGERAGE信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路、HIF-1信號(hào)通路等。PI3K-Akt信號(hào)通路的激活影響著心肌細(xì)胞存活、增殖、凋亡以及心肌細(xì)胞能量代謝及調(diào)節(jié)，血管再生等，其在調(diào)控心肌細(xì)胞存活和功能方面起著重要作用[9，15]。動(dòng)脈粥樣硬化是冠心病的發(fā)生發(fā)展基礎(chǔ)，關(guān)鍵的病理生理過程為巨噬細(xì)胞膽固醇代謝紊亂從而形成泡沫細(xì)胞[16]，其中涉及的巨噬細(xì)胞膽固醇攝取能力對(duì)脂質(zhì)積累起到重要作用[17]。徐雷等研究認(rèn)為，AGE-RAGE信號(hào)通路通過干預(yù)SRA2和CD36表達(dá)來介導(dǎo)巨噬細(xì)胞膽固醇的代謝，從而影響糖尿病并發(fā)癥中的大血管病變，進(jìn)一步導(dǎo)致冠心病的發(fā)生[18]。MAPK信號(hào)通路是細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的調(diào)節(jié)通路之一，參與細(xì)胞增殖、凋亡、炎癥、免疫應(yīng)答等過程，主要包括了ERK、p38 MAPK和JNK信號(hào)通路。其中p38 MAPK信號(hào)通路磷酸化后生成p-p38 MAPK發(fā)揮促進(jìn)心肌細(xì)胞凋亡的作用[19]；p38 MAPK信號(hào)通路激活后還使細(xì)胞內(nèi)的炎癥因子水平升高，進(jìn)一步誘發(fā)巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)的發(fā)生[20]。HIF-1α是HIF-1信號(hào)通路中的重要因子，HIF1的生理活性主要是由HIF-1α決定。鞏曉東等研究發(fā)現(xiàn)，雖然在心肌缺血時(shí)HIF-1α的穩(wěn)定表達(dá)對(duì)心肌有一定保護(hù)作用，但當(dāng)HIF-1α表達(dá)水平增高時(shí)，冠脈軟斑塊的發(fā)病率也相應(yīng)增高[21]。這可能與患者血清缺氧和炎癥反應(yīng)程度明顯增加有關(guān)，導(dǎo)致患者血管內(nèi)皮損傷更加嚴(yán)重、更容易形成軟斑塊。以上表明，燈盞細(xì)辛作用靶點(diǎn)可能通過分布于不同代謝通路，相互調(diào)節(jié)治療冠心病的作用機(jī)制。

綜上所述，燈盞細(xì)辛治療冠心病的過程涉及多個(gè)有效成分，作用靶點(diǎn)和通路，從靶點(diǎn)基因的角度初步驗(yàn)證了燈盞細(xì)辛治療冠心病的藥理學(xué)作用機(jī)制，為后續(xù)進(jìn)一步研究奠定了基礎(chǔ)。由于本研究?jī)H依據(jù)生物利用度和類藥性這一常用篩選標(biāo)準(zhǔn)作為篩選條件，因此對(duì)于生物利用度較低但在臨床研究中較為重視的成分有所漏篩，未能將這些成分納入研究中來，是本研究存在的不足之處。