周泓江 黃雋光 羅建勇 史一白 錢 芳， 黃立新*

1（華南理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣東廣州 510640）

2（廣州雙橋股份有限公司，廣東廣州 510280）

Protamex 復(fù)合蛋白酶是諾維信等生物技術(shù)公司從芽孢桿菌屬微生物開發(fā)生產(chǎn)的一種蛋白酶最適pH 值5.5～7.5，溫度35 ℃～60 ℃，是一種被廣泛應(yīng)用的蛋白酶酶制劑。前期研究表明，用Alcalase堿性蛋白酶水解大豆蛋白，其水解液苦味相對(duì)較大，對(duì)其應(yīng)用有不良影響，而Protamex 復(fù)合蛋白酶即使在低水解度下，水解液苦味不明顯，因此被用于酶解雞蛋蛋白、動(dòng)物蛋白以及小麥、玉米和大豆等植物蛋白，以及保健食品和醫(yī)藥等領(lǐng)域。

在企業(yè)開發(fā)啤酒用糖漿和前期試驗(yàn)基礎(chǔ)上，發(fā)現(xiàn)Alcalase 蛋白酶酶解大豆蛋白的水解原液存在一定的苦味。本文采用Protamex 蛋白酶在不同水解條件下酶解大豆蛋白，研究測(cè)定其大豆蛋白酶解液的蛋白質(zhì)回收率、水解度、α－氨基酸含量、隆?。↙undin）區(qū)分的變化及其SDS-PAGE 凝膠電泳，探討水解制備大豆蛋白酶解發(fā)酵液條件，使之接近或相當(dāng)于麥芽汁隆丁區(qū)分的一般要求：高分子含氮物質(zhì)占25%，中分子含氮物質(zhì)占15%，低分子含氮物質(zhì)占60%，以期具有更好的風(fēng)味，同樣能夠與啤酒用麥芽糖漿復(fù)配使用，更適于啤酒釀造。

1 材料與方法

1.1 材料

大豆蛋白，山東香馳豆業(yè)科技有限公司；Protamex 蛋白酶，活力1.5 AU/g，諾維信公司。

1.2 儀器設(shè)備

PHS－3C 型pH 計(jì)；FA1004 電子分析天平；KHW-D-1 電熱恒溫水浴渦；79-3 型恒溫磁力攪拌器；JJ-1 增力電動(dòng)攪拌器；KDN－2C 型凱氏定氮儀；KDN 型消化爐；TDL-5-A 型低速臺(tái)式離心機(jī)；DYCG-30 型電泳槽。

1.3 大豆蛋白酶解液的制備

1.3.1 步驟

準(zhǔn)確稱量大豆蛋白，加入一定量蒸餾水，攪拌均勻，在80 ℃±2 ℃處理15 min，冷卻至預(yù)定溫度后恒溫水浴，調(diào)節(jié)pH 值至設(shè)定值。加入一定量的蛋白酶，配制成設(shè)定底物濃度的反應(yīng)液，緩慢攪拌，反應(yīng)過程用0.5 mol/L NaOH 溶液滴定維持體系在預(yù)定pH 值。反應(yīng)到預(yù)定時(shí)間后，立即放入85 ℃水浴中加熱15 min 鈍化蛋白酶，冷卻后在4 800 r/min離心20 min，取上清液，于冰箱冷藏。采用pH-state 法測(cè)定大豆蛋白酶解過程的水解度（DH）。

1.3.2 裝置圖

大豆蛋白酶法水解的裝置簡(jiǎn)圖，見圖1。

1.4 測(cè)定方法

1.4.1 干固物

圖1 制備大豆蛋白酶解液的試驗(yàn)裝置簡(jiǎn)圖

參照參考文獻(xiàn)［13］方法測(cè)定。

1.4.2 蛋白質(zhì)

參照GB 5009.5 的標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)測(cè)定，換算系數(shù)為5.71。

1.4.3 可溶蛋白回收率（NR）

大豆蛋白粉水解后，計(jì)量水解離心后上清液的質(zhì)量，準(zhǔn)確稱取約1.000 g 的蛋白水解液，用凱氏定氮法消化、定氮，測(cè)定出上清液中蛋白含量，公式為：

式中：X——蛋白質(zhì)回收率；

m1——上清液中蛋白質(zhì)含量；

m0——底物蛋白質(zhì)含量

1.4.4 SDS-PAGE 凝膠電泳

標(biāo)準(zhǔn)蛋白樣和未知樣品在同一塊凝膠上進(jìn)行電泳，用標(biāo)準(zhǔn)蛋白遷移率與相對(duì)分子質(zhì)量對(duì)數(shù)作圖，可以獲得一條mR-lgMr 標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)未知蛋白遷移率，可得到未知樣品相對(duì)分子質(zhì)量。

2 結(jié)果與討論

2.1 酶用量對(duì)大豆蛋白水解產(chǎn)物的影響

在底物質(zhì)量濃度5%，反應(yīng)溫度50 ℃，pH 值6.5，酶用量分別為750 U/g、1 000 U/g 和1 500 U/g條件下進(jìn)行酶解。隨著水解的進(jìn)行，體系pH 值逐漸下降，滴加0.5 mol/L 的NaOH 保持pH 值為6.5。取不同時(shí)間段水解液，測(cè)量其NR 值、DH 值，以及酶解液Lundin 分布和電泳后分子量分布，測(cè)定結(jié)果分別見下頁(yè)圖1～圖3。

由下頁(yè)圖1（b）可知，隨著酶用量和酶解時(shí)間增加，水解度呈現(xiàn)逐漸增加的變化趨勢(shì)。在水解初期，DH 值上升很快，2 h 后上升速度逐漸緩慢，基本保持穩(wěn)定；當(dāng)酶用量從750 U/g 增至1 000 U/g時(shí)，最終DH 值變化較小，對(duì)水解度影響減弱。

圖1 酶用量對(duì)可溶蛋白回收率和水解度的影響

由圖1（a）可知，隨著酶用量增加，NR 值相應(yīng)增加，當(dāng)酶用量大于1 000 U/g 時(shí)，NR 增加速率降低，與DH 值變化一致。反應(yīng)時(shí)間為3 h 時(shí)，NR接近峰值，此后隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，NR 值有所減小。該水解是一個(gè)復(fù)雜的變化過程，在大分子蛋白被水解成小分子蛋白和多肽的同時(shí)，這些小分子蛋白和多肽經(jīng)過相互作用，再次聚集成分子量稍大的蛋白質(zhì)，使得NR 值減小。

由圖2 可知，C 區(qū)分在酶解時(shí)間超過2 h 后，其含量比例基本都超過60%；酶添加量為1 000 U/g和1 500 U/g，C 區(qū)分在酶解1 h 時(shí)，其含量比例均超過60%。在A 區(qū)分，隨著酶用量和酶解時(shí)間的增加，其含量比例下降明顯，酶用量的影響比較顯著；在酶用量相同時(shí)，Protamex 蛋白酶酶解大分子蛋白的能力比Alcalase 蛋白酶弱，其A 區(qū)分含量比例都相應(yīng)較高。

圖2 酶用量對(duì)Lundin A、B 和C 區(qū)分分布的影響

圖3 不同酶用量隨反應(yīng)時(shí)間變化所得酶解液的SDS-PAGE 凝膠圖譜

由下頁(yè)圖3 可知，隨著酶用量的增加，酶解液中大分子蛋白呈下降趨勢(shì)。當(dāng)酶用量為750 U/g時(shí)，反應(yīng)1.5 h 時(shí)仍然有分子量約30×104Da 的蛋白質(zhì)分子；當(dāng)酶用量為1 000 U/g，反應(yīng)1.5 h 時(shí)，蛋白分子量幾乎都在2.5×104Da 以下；當(dāng)酶用量達(dá)到1 500 U/g，反應(yīng)1 h 后，酶解液中分子量都在2.0×104Da 以下。

綜合成本、NR 值、DH 值，以及反應(yīng)所得酶解液的Lundin 分布和電泳圖的結(jié)果，選擇加酶量1 000 U/g 為宜。

2.2 pH 值對(duì)大豆蛋白水解產(chǎn)物的影響

在底物濃度5%，反應(yīng)溫度50 ℃，酶用量1 000 U/g，pH 值分別在6.0、6.5、7.0 條件下反應(yīng)，過程中滴加0.5 mol/L 的NaOH 溶液保持pH 值不變。取不同時(shí)間段的水解液，測(cè)量其NR 值、DH值，以及酶解液Ludin 分布和電泳后分子量分布，測(cè)定結(jié)果見圖4～圖6。

由圖4 可知，Protamex 屬于中性蛋白酶，在中性至微酸性條件下，水解效果較好。隨著pH 值的升高，NR 值也逐漸上升；反應(yīng)初期，NR 值、DH值皆隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)而升高；繼續(xù)酶解，DH值的增加減緩，到2 h 后趨于平緩；酶解3 h 時(shí)，NR 值達(dá)到最高值，隨后降低，原因可能是部分中小分子多肽重新發(fā)生了聚集。

圖4 pH 值對(duì)蛋白質(zhì)回收率和水解度的影響

圖5 pH 值對(duì)LundinA、B 和C 區(qū)分分布的影響

由圖5 可知，pH 值對(duì)Protamex 蛋白酶的影響比Alcalase 的影響大。酶解pH 值增大，隨反應(yīng)的進(jìn)行，A 區(qū)分含量比例降低，C 區(qū)分含量增加，1 h后都超過60%。反應(yīng)2 h～4 h 時(shí)，B 區(qū)分含量為15%左右。Protamex 對(duì)大豆蛋白的水解效果從蛋白的分子量分布上看優(yōu)于Alcalase 蛋白酶，水解1 h時(shí)A 區(qū)分含量較接近發(fā)酵液要求。

圖6 不同pH 酶解下隨反應(yīng)時(shí)間所得的酶解液的SDS-PAGE 電泳圖譜

由圖6 可知，當(dāng)酶解pH 值為6.0 或7.0 時(shí)，反應(yīng)2 h 后，在2.01×104～3.1×104Da 區(qū)間，依然有多條明顯的凝膠譜帶。在啤酒發(fā)酵過程當(dāng)中，B 區(qū)分含量決定了啤酒持泡性和泡沫質(zhì)量，對(duì)B 區(qū)分含量要求相對(duì)較高。因此，綜合考慮NR 值、DH 值和Lundin 分布等情況，選擇pH6.5 條件較為適合。

2.3 酶解溫度對(duì)大豆蛋白水解產(chǎn)物的影響

在底物濃度5%，酶用量1 000 U/g，pH 值6.5，分別在45 ℃、50 ℃、55 ℃條件下進(jìn)行酶解，過程中滴加0.5 mol/L NaOH 溶液保持pH 值不變。取不同時(shí)間段的水解液，測(cè)量其NR 值、DH 值，以及酶解液Lundin 分布和電泳后分子量分布，測(cè)定結(jié)果見圖7～圖9。

由圖7 可知，溫度對(duì)NR 值、DH 值的影響變化一致，且影響都較顯著。Protamex 蛋白酶水解大豆蛋白的機(jī)理及動(dòng)力學(xué)研究表明，酶解溫度為45℃～50 ℃水解效果較好。酶解溫度50 ℃時(shí)反應(yīng)3 h可得到較高的蛋白質(zhì)回收率值，為63.7%（濕基）。

圖7 反應(yīng)溫度對(duì)蛋白質(zhì)回收率和水解度的影響

由圖8 可知，在本試驗(yàn)溫度條件下，酶解1 h～6h，所有酶解液的C區(qū)分都大于60%。與45℃和55 ℃相比，在50 ℃的酶解，其Lundin A 和B 區(qū)分含量比例最小，C 區(qū)分最大，酶解6 h 時(shí)，其C 區(qū)分含量超過80%，表明50 ℃的酶解效果較好。

圖8 溫度對(duì)酶解液LundinA、B 和C 區(qū)分分布的影響

酶解溫度為45 ℃時(shí)，A 區(qū)分含量隨酶解時(shí)間的延長(zhǎng)而減少，B 區(qū)分含量則隨時(shí)間的延長(zhǎng)而增加。酶解時(shí)間以1 h～6 h 時(shí)，B 區(qū)分含量從13%升至17.5%，表明B 區(qū)分中分子多肽水解為C 區(qū)分小分子肽的數(shù)量，小于A 區(qū)分高分子肽水解成B 區(qū)分中分子肽的數(shù)量。

酶解溫度為50 ℃和55 ℃時(shí)，A 和B 區(qū)分含量變化趨勢(shì)比較一致。其中，B 區(qū)分含量都隨酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢(shì)，在2 h 時(shí)，B 區(qū)分含量比例最大，接近或大于15%。

圖9 不同溫度條件下隨反應(yīng)時(shí)間所得SDS-PAGE 電泳圖譜

從圖9 電泳圖可見，隨著溫度的增加，反應(yīng)所得酶解液的分子量在3.0×104Da、2.0×104Da、0.6×104Da 均有分布，符合啤酒發(fā)酵液所要求的Lundin 分布。綜合考慮NR 值、DH 值、Ludin 分布等結(jié)果，酶解溫度控制在50 ℃～55 ℃之間較為適宜。

2.4 底物濃度對(duì)大豆蛋白水解產(chǎn)物的影響

在酶用量1 000 U/g，pH 值6.5，溫度50 ℃，底物濃度分別為4%、5%、6%和7%條件下酶解，過程中滴加0.5 mol/LNaOH 溶液保持pH 值不變。取不同時(shí)間段的水解液，測(cè)量其NR 值、DH 值，以及酶解液Lundin 分布和電泳后的分子量分布，測(cè)定結(jié)果分別見圖10、圖11。

圖10 底物濃度對(duì)蛋白質(zhì)回收率和水解度的影響

由圖10 可知，4%～6%大豆蛋白質(zhì)量濃度對(duì)NR值、DH 值的影響不大，大豆蛋白含量5%～6%的水解效率較高，以后隨著蛋白濃度的增大，酶水解效率逐漸下降。蛋白質(zhì)量濃度超過7%，水解效果變得較差。但是，生產(chǎn)時(shí)提高濃度可以減少能耗、提高設(shè)備利用率，在保證達(dá)到所需水解度的條件下，可根據(jù)實(shí)際情況選用較高底物濃度。

圖11 不同底物濃度條件下隨反應(yīng)時(shí)間所得的酶解液的SDS-PAGE 電泳圖譜

由圖11 可知，隨著底物濃度的增加，高分子含量的部分不斷增加，當(dāng)?shù)孜餄舛仍?%時(shí)，分子量主要分布在0.7×104Da、1.8×104Da、2.0×104Da和2.8×104Da 左右，當(dāng)?shù)孜餄舛葹?%的時(shí)候，分子量出現(xiàn)超過4.3×104Da 的部分。綜上所述，為了實(shí)現(xiàn)與麥汁組分相近的酶解液，選擇底物濃度為5%較為適宜。

3 結(jié)論

通過實(shí)驗(yàn)可知，Protamex 酶對(duì)大豆分離蛋白有較好的水解效果。為了得到可以用于部分或全部替代麥汁的與糖漿復(fù)配的酶解液，所選取的酶解條件并不是最佳水解度的酶解條件。Protamax 蛋白酶水解大豆蛋白的產(chǎn)物，其分子量分布范圍較為廣泛，當(dāng)反應(yīng)時(shí)間在1.0 h～1.5 h 時(shí)，所得到的酶解液的Lundin 分布較為接近麥汁Lundin 區(qū)分分布的要求，而此時(shí)的NR 值也在63.7%（濕基）左右。因此，采用Protamex 酶來制取含氮復(fù)合糖漿的蛋白復(fù)配液是可行的。

Protamex 酶制取糖漿復(fù)配含氮酶解液的最佳條件是：底物濃度5%，酶用量1 000 U/g，溫度50 ℃，pH 值6.5，反應(yīng)時(shí)間1.0 h～1.5 h。在此條件下所得的酶解液為淺黃色，略帶苦味，但弱于Alcalase 蛋白酶酶解大豆蛋白所得酶解液的苦味。