董 杏 李 珍 宿曉曉 林艷麗 杜艷敏 張歡歡 曾憲旭

子宮內膜樣癌是原發(fā)于子宮內膜的上皮性惡性腫瘤，為女性生殖道三大惡性腫瘤之一[1]。近年來發(fā)病率在世界范圍內呈上升趨勢。據統(tǒng)計2015年中國新發(fā)病例63 400例，死亡病例21 800例[2]。子宮內膜樣癌的發(fā)生機制目前尚未明確，相關研究表明子宮內膜樣癌的發(fā)生與內源性及外源性雌激素長期刺激關系密切[3-4]。ING4作為ING家族中的一員，是一個腫瘤抑制因子，目前的研究表明，它可通過多種途徑來參與調控腫瘤細胞的增殖、凋亡[5]。本研究通過組織芯片及免疫組化方法聯合檢測，一方面探討ING4在子宮內膜樣癌中的表達，另一方面探討不同子宮內膜組織中ING4、p53、Ki-67、ER、PR的表達水平，結合臨床病理學特征進行分析，為疾病的診斷和預后提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 一般資料

該研究經鄭州大學第三附屬醫(yī)院倫理委員會批準，收集了2015年12月至2019年3月于鄭州大學第三附屬醫(yī)院因子宮內膜病變行全子宮切除術，術后常規(guī)病理確診為子宮內膜樣癌的標本60例(研究組，C組)，按照2009年國際婦產科聯盟新修訂標準，手術病理分期Ⅰ期40例、Ⅱ期13例、Ⅲ期7例；按照2003年世界衛(wèi)生組織修訂標準，組織學分級高分化28例、中分化17例、低分化15例；無子宮肌層浸潤7例、浸潤淺肌層者(<1/2)28例，深肌層或漿膜浸潤(≥1/2)25例；無淋巴結轉移53例，有淋巴結轉移7例。另取同時期因其他婦科疾病而進行手術切除的子宮內膜標本為對照組，其中子宮內膜不典型增生的標本30例(B組)以及正常的子宮內膜標本20例(A組)。所有研究對象術前均未接受內分泌治療或輔助放化療，且術前肝功能及腎功能指標均在正常范圍內。選取患者的年齡為45～79歲，平均53歲。

1.2 實驗試劑

免疫組化試劑P53(DO-7)、Ki-67(30-9)、ER(SP1)、PR(IE2)由美國羅氏診斷產品(上海)有限公司提供；ING4(Cat No.：I0617-I-AP)抗體由武漢三鷹公司提供。DAB顯色試劑盒購自上海生工生物工程公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 組織芯片的制備 首先在HE切片上選定最具代表性的子宮內膜位點，對照石蠟標本進行標記，精確穿刺位點，用1 mm孔徑的穿刺針將采集到的組織注入到蠟塊陣列中，并對每一個位點進行編號。并按照6×9的序列將其整齊的排列在蠟塊上。組織芯片要制平整以免出現組織移位、缺失等，點間距離是0.3 mm。使用Leica2245切片機以4 μm厚度進行連續(xù)切片，以備后續(xù)實驗。

1.3.2 免疫組織化學染色(SP)方法 組織芯片蠟塊取4 μm切片在75 ℃恒溫烤箱中烘烤30 min后，將石蠟切片放在二甲苯中脫蠟；將脫蠟后的切片進行梯度酒精脫水，自來水沖洗；然后將切片放入EDTA修復液中煮沸、修復；冷卻至室溫后把切片放入濕盒中用3%過氧化氫封閉；PBS沖洗3次后，滴加按比例稀釋的一抗，包括ING4抗體(Cat No.：I0617-I-AP，1：600)，P53(DO-7)、Ki-67(30-9)、ER(SP1)、PR(IE2)，37 ℃孵育1 h；PBS沖洗3次后，室溫下加用相應二抗30 min；DAB顯色、復染后用中性樹膠封片，在光學顯微鏡下觀察。

1.3.3 染色結果及判定標準 由2位病理科主任醫(yī)師在臨床和病理資料不知曉的情況下獨立觀察切片，并進行染色評分，ING4蛋白的陽性表達位于細胞核或胞質，但主要是核表達，以核出現棕黃色細顆粒狀著色為標準。陽性結果判定：每張切片隨機選取5個視野(×40)，計數 500個細胞，依照細胞染色強度和染色密度作為評分標準：①染色強度根據染色深度分為4級：無染色者為0分、淺黃色為1分，棕黃色者2分，棕褐色者為3分。②依據染色細胞百分比：未見染色細胞為0分，染色細胞比例≤25%者為1分，染色細胞比例在 25%～50%為2分，染色細胞比例≥50%為3分。以上訴兩方面之和的總得分來判定結果，≤2分判定為陰性，>2分判定為陽性[6]。

1.4 統(tǒng)計學分析

應用SPSS21.0統(tǒng)計軟件進行數據分析，定性資料應用χ2檢驗，有序等級資料采用Spearman等級檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 不同子宮內膜組織中ING4、p53、Ki-67及ER、PR 的表達情況

ING4在A組中表達率最高，在B組和C組中表達率逐漸降低，且三者比較差異有統(tǒng)計學意義。p53、Ki-67蛋白在C組中高表達，表達率分別為63.33%和41.67%；在B組中表達率分別為40.00%和33.33%，A組中表達率分別為15.00%和10.00%，A、B組與C組相比，P<0.05；且A組與B組比較差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。ER、PR在A組、B組、C組中的陽性表達率逐漸下降，且C組與A組及B組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1。

2.2 子宮內膜癌中ING4、p53、Ki-67、ER、PR的表達與臨床病理特征的關系

ING4的表達與子宮內膜癌臨床病理分期、組織分化程度、肌層浸潤深度等病理特征均有關，子宮內膜癌組織、臨床分期越晚、分化程度越差、肌層浸潤越深者，ING4表達越低，且具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。p53、Ki-67的陽性表達率隨子宮內膜癌病理分期、肌層浸潤深度的增加有增高的趨勢，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。ER的陽性表達率與分化程度及肌層浸潤深度有關(P<0.05)，PR的陽性表達率與病理分期、分化程度以及肌層浸潤深度均相關；由于淋巴結陽性樣本量較少，未發(fā)現上述因子的表達與淋巴結轉移之間的相關性，見表2。

表1 ING4、p53 、Ki-67及ER、PR在不同組織中的表達情況(例，%)

注：*表示與子宮內膜癌(C組)比較，P<0.05；#表示與不典型增生子宮內膜(B組)比較，P<0.05。

表2 子宮內膜組織中ING4、p53、Ki-67、ER、PR的陽性表達與臨床病理特征的關系(例，%)

2.3 子宮內膜樣癌中ING4、p53、Ki-67、ER和PR的相關性研究

Pearson相關分析顯示：ING4的表達與ER及PR的表達量存在正相關，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。ING4的表達與p53的表達量存在負相關，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表3。

表3 ING4、p53、Ki-67、ER和PR的相關性(γ)

注：*表示兩者相比，P<0.05。

3 討論

ING4作為ING家族的成員，是一個腫瘤抑制因子，它可以通過不同的途徑來參與調控腫瘤細胞的增殖和凋亡，如在結腸癌和膠質瘤細胞中，ING4可通過與NFκB/p65的相互作用導致NFκB/p65蛋白酶體依賴性降解和腫瘤抑制[7-8]。本研究中，ING4蛋白在正常子宮內膜、不典型增生性子宮內膜、子宮內膜樣癌中，隨著病變程度的增加，ING4的表達逐步降低，與趙倩等[6]研究結果一致。

ING4為抑癌基因，但其真正的作用機制目前尚未清楚，結合其在其他腫瘤中的研究，我們推測ING4可能在子宮內膜樣癌的發(fā)生發(fā)展過程中參與了p53通路的調控，所以本課題致力于探討ING4在子宮內膜癌中的分子作用機制，并對ING4對腫瘤細胞的增殖、凋亡進行研究分析。本研究發(fā)現ING4的表達與p53的表達量存在負相關，差異具有統(tǒng)計學意義。

我們對ING4蛋白的表達與子宮內膜樣癌臨床病理特征進行分析，結果發(fā)現ING4蛋白在子宮內膜樣癌組織中，隨著腫瘤肌層浸潤加深，其表達逐漸降低；Ⅱ～Ⅲ較Ⅰ期的表達下降；低分化組與中高分化組相比，ING4的表達下降。研究者在乳腺癌[9]和前列腺癌[10]中也發(fā)現同樣的結論，此外ING4在子宮內膜癌和不典型增生中的表達明顯下降，提示ING4的基因突變或蛋白表達異常甚至缺失可能參與了啟動子宮內膜癌的惡變過程。

Ki-67存在于增殖細胞核基質內，檢測Ki-67的陽性率表達常作為評估腫瘤細胞增殖活性的指標[11]。抑癌基因p53編碼核磷酸蛋白，具有調節(jié)轉錄、誘導凋亡等多種生物學作用。p53在人類腫瘤中極易發(fā)生突變，突變后其正常的抑癌作用消失，細胞將發(fā)生惡性轉化[12]。我們采用免疫組化方法檢測到的p53為突變型p53。Athanassiadou等[13]研究顯示，突變的p53可明顯增加子宮內膜的癌變率。本研究結果顯示，子宮內膜癌組織中p53陽性表達率明顯高于對照組患者，且與FIGO 病理分期、分化程度、肌層浸潤程度呈正相關，這表明突變的p53可直接反映子宮內膜癌的惡性程度，與腫瘤的發(fā)生、腫瘤細胞的侵襲、轉移密切相關。

子宮內膜癌發(fā)病與雌、孕激素密切相關[4]。研究顯示[14]PR、ER 陽性表達的子宮內膜癌患者有更高的5年生存率。PR低表達通常早于 EC 的發(fā)生或發(fā)生在早期階段，由此推測由于孕激素無法發(fā)揮拮抗ER的作用，促進了ER、PR 表達下調的早期癌變細胞的生存，從而誘發(fā)癌變的進一步發(fā)生，導致 EC 的發(fā)生[15]。本研究顯示，ER、PR陽性表達率從正常子宮內膜到癌變的內膜，呈下降趨勢，多數情況下為弱陽性表達，在子宮內膜癌中表達降低。ER、PR 在子宮內膜樣癌中的陽性率隨組織學分級的增高而降低，與肌層浸潤深度及分期無關，與徐珂等[16]研究中顯示的ER、PR蛋白表達量與 EC 臨床分期、組織分化程度存在明顯相關性結論一致。此外本研究證實ER、PR在雌激素依賴性子宮內膜癌中呈現出高表達的狀態(tài)且與P53、Ki-67的表達呈負相關。

綜上所述，ING4的表達與子宮內膜癌的發(fā)生呈負相關，可作為子宮內膜癌患者的一種可靠的預后指標。P53突變的子宮內膜癌，其瘤細胞分化較差，惡性程度高，提示預后不良。Ki-67陽性也提示子宮內膜癌預后較差。上述指標聯合應用可能對子宮內膜癌病理診斷及預后和靶向治療提供幫助。