張 毅 范 麗 馬亞琳 李著艷 劉 瑩 王任曉

宮頸癌是惡性腫瘤之一，其主要發(fā)病原因為hr-HPV感染導(dǎo)致宮頸組織逐漸惡化并形成淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移[1]。宮頸組織惡化發(fā)生原因有多種，宮頸腫瘤微環(huán)境變化是反映宮頸組織惡化的1種標志，微環(huán)境中如浸潤大量炎癥細胞，將導(dǎo)致腫瘤相關(guān)性炎癥，進而惡性發(fā)展成為癌癥，而癌癥發(fā)生、進展和預(yù)后不良與腫瘤相關(guān)巨噬細胞有著密閉可分的關(guān)系[2-3]。微型蛋白質(zhì)是1種單鏈且有編碼蛋白功能的小分子蛋白質(zhì)，它具有調(diào)控基因的表達、抑制或活化靶基因的功能，也對基因轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)錄后的水平均具有調(diào)控作用[4]。有研究發(fā)現(xiàn)，微型蛋白質(zhì)中miR-27a在很多癌癥中起著重要的促癌癥作用[5]。本文通過回顧性分析在本院治療的宮頸癌患者相關(guān)資料，研究分析miR-27a在宮頸組織不同病變程度時的表達水平分析，為宮頸癌患者的治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 基本資料

選取2015年1月至2018年1月在本院治療的宮頸組織病變患者120例，以確診為僅HPV-16陽性感染的正常宮頸組織患者為對照組(n=40)，以確診為HPV-16陽性宮頸癌前病變組織和HP-V16陽性早期宮頸鱗癌患者的病變組織為研究組1(n=40)、研究組2(n=40)。三組患者基本資料對比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性，詳見表1。本研究經(jīng)本院倫理委員會批準，患者或家屬知情并同意。

表1 三組患者基本資料對比

1.2 納入及排除標準

納入標準：確診為hr-HPV感染患者；無其他重大器官疾病患者；無精神疾病，能獨立完成調(diào)研患者；患者臨床資料齊全。

排除標準：孕婦與急性盆腔感染患者；接受過放射治療與化療等非手術(shù)治療患者；宮頸腺癌患者。

1.3 方法

宮頸癌細胞培養(yǎng)：調(diào)適培養(yǎng)箱，使其溫度為37 ℃，濕度95%，二氧化碳濃度為5%，在箱內(nèi)培養(yǎng)接種Siha。每天觀察細胞生長狀況1～2次，并據(jù)需換液。采用顯微鏡進行觀察細胞生長狀況，至細胞處于對數(shù)生長期，對細胞進行凍存、傳代等處理。在細胞覆蓋率達90%以上時，對所需的細胞內(nèi)DNA或者RNA進行提取，留作實驗使用。

細胞轉(zhuǎn)染：轉(zhuǎn)染片段序列的設(shè)計與合成均由上海吉瑪生物技術(shù)有限公司完成。miR-27a模擬物(miR-27amimic)、miR-27a模擬物對照(miR-27amimic NC)、miR-27a抑制物(miR-27a inhibitor)、miR-27a抑制物對照(miR-27a inhibitorNC)。轉(zhuǎn)染具體步驟如下：①以1 000 r/min的轉(zhuǎn)速對胰酶消化處理后的宮頸癌細胞離心5 min；②將2 ml DMEM培養(yǎng)基重懸細胞加入離心管中，隨后以每孔100 μl培養(yǎng)液標準將該細胞放置于96孔板中培養(yǎng)，共設(shè)立5組，每組均含有復(fù)孔3個，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。③細胞生長狀態(tài)采用顯微鏡觀察，待細胞貼壁之后，吸除培養(yǎng)基，并用PBS清洗細胞2次。④按照說明書對inhibitor組的小孔中加入10 μl的Lipofectamine3000與miR-27amimic混合物，用劑量Lipofectamine3000與miR-27ainhibitorNC的混合物加入miR-27a抑制對照組；并采用相同的方法對mimic組及空白對照組處理，后放入培養(yǎng)箱中孵育6小時。

1.4 指標檢測

1.4.1 細胞轉(zhuǎn)染率檢測 將進行過熒光標記的miRNA轉(zhuǎn)染Siha內(nèi)，后加入無血清培養(yǎng)基，于培養(yǎng)箱內(nèi)進行6 h培養(yǎng)。加入轉(zhuǎn)染試劑，待混合充分放置于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h，后采用PBS在避光下清洗細胞3次。使用200倍光鏡及熒光顯微鏡觀察細胞形態(tài)并計數(shù)熒光亮點。陽性細胞為由綠色熒光蛋白顯示的細胞，以此計算細胞的轉(zhuǎn)染效率。

1.4.2 miR-27a表達檢測 采用試劑盒法提取血清總RNA，以反轉(zhuǎn)錄后的cDNA為模板，采用RT-PCR檢測miR-27a相對表達量。

1.4.3 細胞增殖檢測 細胞接種：在96孔板中接種對數(shù)生長期的Siha細胞，實驗共5組，每組8 000個細胞，復(fù)孔3個，分別對每孔加入200 μl培養(yǎng)基，置于培養(yǎng)箱內(nèi)；將miR-27a模擬物(miR-27amimic)、miR-27a模擬物對照、miR-27a抑制物、miR-27a抑制物對照及Lipofectamine3000加入各實驗組及其復(fù)孔，進行轉(zhuǎn)染；分別在細胞轉(zhuǎn)染后、轉(zhuǎn)染48 h及72 h，對96孔板中細胞活性進行檢測，后重新加入新鮮培養(yǎng)基及10 μl的CCK-8試劑，緩慢均勻搖勻，放入培養(yǎng)箱中孵育2 h。采用酶標儀測定每小孔的吸光度，作為細胞增殖測定。

1.4.4 細胞凋亡檢測 使用6孔板接種處于對數(shù)生長期時的Siha細胞并進行細胞轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染72 h后，將細胞原培養(yǎng)基移至離心管中洗滌一次。將胰酶加入96孔板中進行消化后收集細胞，最后1 000 rmp，室溫，離心，10 min。帶上述操作結(jié)束，收集并使用結(jié)合緩沖液重懸細胞，稀釋、計數(shù)細胞約1×106個細胞/ml。

在避光條件下將100 μl上述細胞懸液加入5 μl的工作液中孵育，后加入400 μl結(jié)合緩沖液進行混合，均勻后進行分析檢測。

1.4.5 SIPA1L3的表達水平檢測 將蛋白樣品加入上樣緩沖液中，混勻后進行分鐘沸水加熱；參照試劑盒使用說明書進行分離膠與濃縮膠配置；將上述凝膠放入電泳槽后，依次加入緩沖液、Marker及待測的樣品蛋白；將上述樣品進行30 min的90 v恒壓存放，后進行60 min的150 v恒壓電泳，待溴酚藍進入分離膠邊緣的界面電泳停止。取出并切除多凝膠余部分，放置緩沖液中浸泡；以凝膠的大小為標準裁剪PVDF膜，并置于甲醇中激活，后將PVDF膜與濾紙均放入電轉(zhuǎn)緩沖液中，除去氣泡后，100 mA電流進行轉(zhuǎn)膜；封閉：配置封閉液，并放置PVDF膜，后進行3 h的溫室輕搖封閉；孵育一抗：稀釋一抗，并放入封閉后的PVDF膜，4 ℃恒溫存放一夜；洗膜：用TBST溶液洗滌PVDF膜3次，10 min/次，去除一抗；孵育二抗：稀釋并加入二抗，放入PVDF膜，后進行1 h室溫孵育；洗膜：同上述洗膜步驟；避光配置ECL發(fā)光液，并滴加在PVDF膜上，進行3 min孵育。曝光并拍攝條帶；分析比較：相對表達量=灰度值/內(nèi)參的灰度值。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 miR-27在不同程度宮頸病變組織中的表達

采用熒光定量PCR檢測miR-27在三組患者中的表達可知。研究組1、2中miR-27a表達顯著高于對照組，且研究組2中miR-27a表達量高于研究組1，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

表2 不同程度宮頸病變組織中miR-27表達量對比

注：a表示與對照組相比，P<0.05；b表示與研究組1相比，P<0.05。

2.2 細胞轉(zhuǎn)染率檢測

采用熒光檢驗法對細胞的轉(zhuǎn)染情況進行檢測可知，Siha細胞中FAM熒光標記的陽性細胞形態(tài)正常、凋亡及漂浮較少等，轉(zhuǎn)染效果明顯。

2.3 miR-27a表達量測定

對比轉(zhuǎn)染mir-27a模擬組、抑制組與mir-27a對照組中mir-27a的表達量可知，模擬組mir-27a表達量顯著高于mir-27a對照組，抑制組mir-27a表達量顯著低于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，但模擬、抑制對照組中mir-27a表達量與空白對照組對比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表3。

表3 轉(zhuǎn)染后的宮頸組織細胞中miR-27a表達量測定

注：a為與miR-27a模擬對照組相比，P<0.05；b為與miR-27a抑制對照組相比，P<0.05。

2.4 細胞增殖狀況

采用CCK-8法檢測模擬組、模擬對照組、抑制組、抑制對照組及空白對照組轉(zhuǎn)染Siha細胞后及轉(zhuǎn)染48、72 h的細胞增殖水平，重復(fù)測量方差分析結(jié)果顯示：組間轉(zhuǎn)染試劑與組內(nèi)增殖時間交互影響，且對細胞增殖起到顯著的影響作用(P<0.05)，多重比較可知，與miR-27amimic組Shia細胞增殖能力顯著高于miR-27amimic NC組，miR-27a inhibitor組則弱于miR-27a inhibitor NC組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義，見表4。

表4 miR-27a對Siha細胞增殖的影響

注：a為與miR-27a模擬對照組相比，P<0.05；b為與miR-27a抑制對照組相比，P<0.05。

2.5 細胞凋亡狀況

轉(zhuǎn)染72 h后，模擬組細胞凋亡率顯著低于miR-27a模擬對照組，抑制組凋亡率顯著高于miR-27a抑制對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表5。

表5 miR-27a對siha細胞凋亡的影響

注：a為與miR-27a模擬對照組相比，P<0.05；b為與miR-27a抑制對照組相比，P<0.05。

2.6 miR-27a對SIPA1L3蛋白表達的調(diào)控

轉(zhuǎn)染72 h后，對比SIPA1L3蛋白的表達量可知，miR-27a模擬組顯著低于miR-27模擬對照組，miR-27a抑制組顯著高于miR-27a抑制對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖1。

圖1 轉(zhuǎn)染72 h后Siha細胞中SIPA1L3相對表達水平

3 討論

miRNAs的異常表達與多種癌癥的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后等密切相關(guān)[6-7]。宮頸癌的發(fā)生有多種miRNA參與，它們在宮頸癌組織中活躍表達，且在不同病變程度的宮頸組織中表達量差異較為[8-9]。而miR-27a是1種致癌miRNA，主要由P53、E2F和c-Myc調(diào)制而成，它具有一定的原癌基因活性[10]。

有研究表明，miR-27a在多種腫瘤的生物學(xué)過程中均能活躍表達，具有一定的促癌作用[11-12]。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-27a在三組患者中的表達量完全不同，且隨著宮頸組織的惡化，miR-27a的表達量逐漸升高，可知，宮頸組織的病變與miR-27a的表達密切相關(guān)。本文同時對細胞功能與miR-27a表達的關(guān)系進行相關(guān)研究，探究對miR-27a對Siha細胞的生物學(xué)行為影響，結(jié)果表明：miR-27a高表達時，Siha細胞的增值能力顯著增強，凋亡現(xiàn)象發(fā)生較少。而miR-27a低表達時，Siha細胞的增殖能力也受到了抑制，增殖較為緩慢，但Siha細胞的凋亡速度反而顯著增快。由此可知，宮頸組織病變過程中，miR-27a的表達能夠促進癌癥發(fā)生，同時說明miR-27a具有原癌基因活性[13-14]。有研究表明通過抑制miR-27a的表達，能夠增加蛋白的表達，因此可知，miR-27a在不同腫瘤中發(fā)揮作用[15-16]。本研究通過對宮頸癌細胞進行轉(zhuǎn)染，促使Siha細胞內(nèi)miR-27a高表達或低表達，并采用蛋白印跡法對Siha細胞中SIPA1L3蛋白表達水平進行檢測，發(fā)現(xiàn)miR-27amimic組SIPA1L3蛋白表達水平顯著低于miR-27amimic NC組SIPA1L3蛋白表達水平，miR-27a inhibitor組SIPA1L3蛋白表達水平顯著高于miR-27a inhibitorNC組SIPA1L3蛋白表達水平，即高表達miR-27a能夠明顯降低SIPA1L3的蛋白表達水平，低表達miR-27a則能夠顯著提升蛋白的表達水平。

綜上所述，miR-27a隨著宮頸組織的病變程度加重，表達水平顯著提升，且能夠通過調(diào)控其下游靶基因SIPA1L3的表達促進Siha細胞的增殖并抑制其凋亡，進而促進了腫瘤的發(fā)生發(fā)展。