丁紹蘭， 劉艷華, 龔貴金

(1.陜西科技大學 環(huán)境科學與工程學院， 陜西 西安 710021； 2.江西正合環(huán)保集團， 江西 南昌 330000)

0 引言

近年來，中國作為最大的皮革制造國，每年都會產(chǎn)生超過70萬噸的固體廢棄物[1].制革過程中會產(chǎn)生大量副產(chǎn)品和廢物，僅有20%的原料皮被轉(zhuǎn)化成商業(yè)皮革，而剩余的固體廢棄物中90%為膠原蛋白[2,3].這不僅浪費了蛋白資源，還對環(huán)境造成了危害.

環(huán)境污染成為全球皮革工業(yè)亟待解決的問題[4].傳統(tǒng)的皮革固體廢棄物處理方式如焚燒、填埋等不僅無法解決鉻離子的污染，而且可能會對環(huán)境造成二次污染[5].因此，在發(fā)展制革清潔生產(chǎn)技術的同時，也要進行資源化的利用.常見的鉻革屑處理方法有堿法處理、酸法處理、酶法處理、氧化法處理、配合法處理等[6].不同的處理方法有其各自的優(yōu)缺點：堿水解需要在較高的溫度和/或壓力下使用NaOH等堿性物質(zhì)進行水解[7]；酸水解會對設備造成腐蝕而無法進行推廣；酶水解具有較高的專一性，反應時間短且反應條件溫和，但酶對鉻的耐受能力差，且處理費用較高[8].

原來對鉻革屑的研究主要集中在鉻回收及鉻鞣劑的制備上[9].近幾年，膠原多肽的提取及應用的研究也越來越多[10]，主要表現(xiàn)在加脂劑、涂飾劑、農(nóng)業(yè)肥料上的應用.本課題通過利用一種較好的鉻革屑水解工藝提取膠原蛋白，并應用于厭氧發(fā)酵產(chǎn)沼氣.

本文首先通過單因素實驗對氧化鈣堿處理以及中性蛋白酶處理步驟中各項參數(shù)(投加量、時間、溫度)進行優(yōu)化，確定較佳的參數(shù)；再通過正交試驗和響應曲面法研究各因素對鉻革屑水解率影響的顯著性以及各因素之間的相互作用，優(yōu)化出鉻革屑堿-酶結(jié)合水解法的最佳方案，為鉻革屑資源化提供一定理論基礎.

1 實驗部分

1.1 實驗藥品和儀器

1.1.1 實驗藥品

實驗所需藥品如表1所示.

表1 實驗藥品

藥品名稱生產(chǎn)廠家鉻革屑晉江秋夏皮革制造廠氧化鈣天津市天力化學試劑有限公司中性蛋白酶北京奧博星生物技術有限公司硫酸西安化學試劑廠氫氧化鈉天津市科密歐化學試劑有限公司硼酸天津市天力化學試劑有限公司硫酸銅天津市天力化學試劑有限公司硫酸鉀天津市盛奧化學試劑有限公司甲基紅-亞甲基藍天津市天力化學試劑有限公司

1.1.2 實驗儀器

THZ-82恒溫水浴振蕩箱，國華企業(yè)；101-1AB型電熱鼓風干燥箱，天津市泰斯特儀器有限公司；HC-3018R高速冷凍離心機，中科中佳科學儀器有限公司；BS 224S電子天平，賽多利斯科學儀器有限公司；SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵，鄭州長城科工貿(mào)有限公司；ICP-AES，電感耦合等離子發(fā)射光譜，美國THEM有限公司.

1.2 實驗方法

1.2.1 鉻革屑的預處理

將從皮革廠取得的藍濕皮塊在102±2 ℃烘干2 h，用剪刀剪碎成小塊，置于4 ℃冰箱以備用.

1.2.2 實驗測定方法

膠原蛋白提取率采用重量分析法進行計算[11]；用ICP-AES法測定水解液中鉻含量[12]；根據(jù)水解前后鉻含量變化計算脫鉻率.

1.2.3 堿處理和酶處理水解鉻革屑單因素優(yōu)化實驗

(1)堿處理的單因素優(yōu)化實驗

取若干250 mL錐形瓶，分別加入5 g預處理后的鉻革屑和100 mL蒸餾水.稱取一定量的CaO(0%、0.5%、1%、2%、4%、6%、8%)，在一定溫度下(40 ℃、60 ℃、80 ℃、90 ℃)，反應一定時間后(0.5 h、1 h、2 h、3 h、4 h、5 h)，調(diào)節(jié)pH為7后加入3%中性蛋白酶，在40 ℃、150 r/min下恒溫水浴振蕩反應1 h，在8 000 r/min離心15 min.取上清液計算堿處理水解鉻革屑的膠原蛋白提取率和脫鉻率，并選出堿水解鉻革屑的最佳反應條件.

(2)酶處理的單因素優(yōu)化實驗

取若干250 mL錐形瓶，分別加入5 g預處理后的鉻革屑和100 mL蒸餾水.然后加入2% CaO，在80 ℃、150 r/min下恒溫水浴振蕩反應3 h后，調(diào)節(jié)pH為7，稱取一定量的中性蛋白酶(0%、0.5%、1%、2%、3%、5%、7%)，在一定溫度下(30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃)，反應一定時間后(0.5 h、1 h、2 h、3 h、4 h、6 h)，在8 000 r/min離心15 min.取上清液計算酶處理水解鉻革屑的膠原蛋白提取率和脫鉻率，并選出酶水解鉻革屑的最佳反應條件.

1.2.4 正交試驗和響應曲面法優(yōu)化堿-酶結(jié)合水解鉻革屑的工藝條件

以L16(35)分別對堿處理和酶處理進行正交試驗，正交分布如表2和表3所示.由正交優(yōu)化得到最佳正交方案，實施正交方案.運用Box-Behnken模型進行設計試驗，并將擬合的結(jié)果與優(yōu)化前的參數(shù)進行比較.

表2 堿處理正交試驗因素水平表

水平因素CaO投加量(A)/%CaO反應時間(B)/hCaO反應溫度(C)/℃111702238033590

表3 酶處理正交試驗因素水平表

水平因素酶投加量(E)/%酶反應時間(F)/h酶反應溫度(G)/℃111702238033590

2 結(jié)果與討論

2.1 堿處理和酶處理單因素參數(shù)確定

2.1.1 CaO投加量對鉻革屑水解的影響

不同投加量CaO水解鉻革屑的膠原蛋白提取率和脫鉻率如圖1所示.從圖1可以看出，膠原蛋白提取率隨著CaO投加量增加而增加.當CaO用量為2%時，提取率達到了79.79%，當投加量處于2%～8%時，提取率逐漸趨于穩(wěn)定.這是由于膠原蛋白提取率受反應體系中OH-濃度的影響，而CaO溶于水電離出的OH-有一定限度.當CaO用量過高時，一部分Ca(OH)2生成白色沉淀，反應體系中OH-濃度不再增加，因此膠原蛋白提取率逐漸穩(wěn)定[13].

從圖1還可以看出，脫鉻率隨著CaO投加量的增加先增大后趨于穩(wěn)定.當CaO投加量為2%時，脫鉻率相對較高，達到89.32%，當CaO投加量為6%～8%時，脫鉻率基本穩(wěn)定.過高CaO的投加不僅使系統(tǒng)灰分增加，而且浪費材料，因此確定2%CaO為最佳的投加量.

圖1 CaO投加量對膠原蛋白提取率和脫鉻率的影響

此外，如圖1所示，單獨蛋白酶水解的膠原蛋白提取率和脫鉻率分別為74.82%和75.36%.隨著CaO投加量的增加膠原蛋白提取率也增加，當投加量為8%，膠原蛋白提取率達到最大85.32%，比單獨酶處理提取率提高了10.5%.此時，脫鉻率也達到最大，為98.82%，比單獨蛋白酶水解的脫鉻率大幅提高了23.46%，這表明相比于單獨的酶處理，堿-酶結(jié)合處理法明顯提高了鉻革屑的水解效率.

2.1.2 CaO反應時間對鉻革屑水解的影響

CaO反應時間對膠原蛋白提取率和脫鉻率的影響如圖2所示.從圖2可以看出，隨著反應時間的延長，膠原蛋白提取率先增加后降低.當反應時間為4 h時，提取率達到最大，為78.11%，但此時水解液中鉻含量最高.

由圖2還可以看出，脫鉻率隨著反應時間的增加而總體呈下降趨勢.當反應時間為3 h時，膠原蛋白提取率為74.9%，脫鉻率達到96.07%，鉻含量最低，為3.686 mg/L.這是由于鉻的沉淀與pH(OH-濃度)有很大的關系.反應初始，體系中OH-濃度較高，Cr(Ⅲ)與OH-絡合生成Cr (OH)3被沉淀，水解液中鉻含量逐漸降低.但隨著反應時間的增加，Cr(Ⅲ)與OH-反應趨于平衡，Cr(OH)3部分轉(zhuǎn)化Cr3+和CrO2-于水解液中相對穩(wěn)定[14].反應3 h與4 h的提取率相比，僅降低了3.21%，幅度很小.因此確定反應時間3 h為CaO水解最佳時間.

圖2 CaO反應時間對膠原蛋白提取率和脫鉻率的影響

2.1.3 CaO反應溫度對鉻革屑水解的影響

不同溫度下，CaO水解鉻革屑的膠原蛋白提取率和脫鉻率如圖3所示.從圖3可以看出，在一定范圍內(nèi)，隨著反應體系溫度的升高膠原蛋白提取率迅速增加.當反應溫度為80 ℃時，膠原蛋白提取率達到最大，92.98%.反應體系溫度大于80 ℃時，提取率逐漸降低.由圖3還可以看出，脫鉻率隨著反應時間的增加而逐漸降低，當反應溫度為40 ℃時，水解液中鉻含量最低，但此時膠原蛋白提取率很差，這是由于低溫條件下分子運動緩慢，不利于反應進行.當溫度超過60 ℃后，脫鉻率趨于穩(wěn)定并稍有減少，可見反應過高不利于水解反應.因此確定80 ℃為最佳反應溫度.

圖3 CaO反應溫度對膠原蛋白提取率和脫鉻率的影響

2.1.4 酶投加量對鉻革屑水解的影響

蛋白酶投加量水解鉻革屑的膠原蛋白提取率和脫鉻率如圖4所示.從圖4可以看出，隨著蛋白酶投加量的增大，膠原蛋白提取率增加后趨于穩(wěn)定，而脫鉻率總體呈減小趨勢.當?shù)鞍酌赣昧?%時，膠原蛋白提取率達到92.98%，脫鉻率達到88.58%，此時水解液中鉻含量為10.47 mg/L，與蛋白酶用量5%相比，提取率僅相差0.112%，但鉻含量約為前者的3倍.因此確定酶量3%是最佳蛋白酶投加量.

圖4 蛋白酶投加量對膠原蛋白提取率和脫鉻率的影響

此外，當?shù)鞍酌赣昧?%時，水解鉻革屑的膠原蛋白提取率和脫鉻率均較低，分別為56.9%和81.4%，與投加量3%的水解結(jié)果相比，提取率和脫鉻率分別增加了36.08%和7.18%.由于CaO單獨水解鉻革屑時，利用OH-與鉻離子的配合能力大于膠原羧基離子[15].但隨著蛋白酶的添加，蛋白酶對革屑蛋白質(zhì)進行高效、專一水解作用，從而使得膠原蛋白提取率大幅度的提高.因此，相比于單獨堿處理，堿-酶結(jié)合水解法可顯著提高鉻革屑的水解效果.

2.1.5 酶反應時間對鉻革屑水解的影響

蛋白酶反應時間對膠原蛋白提取率和脫鉻率的影響如圖5所示.從圖5可以看出，隨著蛋白酶反應時間增長，膠原蛋白提取率先增加后降低.當反應時間為1 h時，膠原蛋白提取率達到最大，水解液中氮含量為3 493 mg/L.由圖5還可知，脫鉻率隨著反應時間的延長變化幅度不大，水解液中鉻含量在9.705～22.755 mg/L變化，可見酶反應時間對脫鉻率影響不明顯，因此選擇1 h作為最佳蛋白酶反應時間.

圖5 蛋白酶反應時間對膠原蛋白提取率和脫鉻率的影響

2.1.6 酶反應溫度對鉻革屑水解的影響

蛋白酶反應溫度對膠原蛋白提取率和脫鉻率的影響如圖6所示.從圖6可以看出，隨著反應溫度的增加，膠原蛋白提取率先增加后減小并趨于平緩.反應溫度40 ℃時，提取率最大，達到88.39%.溫度過低時，酶活性不足，不利于酶水解反應，溫度過高時，蛋白酶失活，酶水解作用減慢甚至停止，從而膠原蛋白提取率逐漸下降.從圖6還可以看出，脫鉻率隨著反應溫度的增加而基本不變，說明酶水解溫度對水解液中鉻含量影響不大，在40 ℃時，鉻含量稍低，因此確定40 ℃為酶水解的最佳溫度.

圖6 蛋白酶反應溫度對膠原蛋白提取率和脫鉻率的影響

2.2 正交試驗和響應曲面法分析優(yōu)化

Box-Behnken設計及結(jié)果如表4所示.

表4 Box-Behnken設計及試驗結(jié)果

2.2.1 CaO投加量與CaO反應時間交互作用的分析與優(yōu)化

CaO投加量、CaO反應時間及其交互作用對膠原蛋白提取率和脫鉻率的響應曲面如圖7所示.從圖7(a)可以看出，對于膠原蛋白提取率來說，兩者(AB)交互作用極顯著(P<0.000 1).在試驗水平范圍內(nèi)，當CaO投加量和CaO反應時間分別處于1.5%～2%和2～4 h時，對水解效率有較大影響.

從圖7(b)可以看出，對于脫鉻率來說，兩者(AB)交互作用不顯著(P=0.883 6).在試驗水平范圍內(nèi)，CaO投加量和CaO反應時間分別在2%～2.5%和2～4 h時，此時脫鉻率在試驗中達到最大值.

2.2.2 CaO投加量與CaO反應溫度交互作用的分析與優(yōu)化

CaO投加量、CaO反應溫度及其交互作用對水解鉻革屑的膠原蛋白提取率和脫鉻率的響應曲面如圖8所示.從圖8(a)可以看出，對于膠原蛋白提取率來說，兩者(AC)交互作用極顯著(P<0.000 1)，在試驗水平范圍內(nèi)，當CaO投加量和CaO反應溫度分別處于1.5%～2.5%和75 ℃～85 ℃時，膠原蛋白提取率在試驗水平中達到最大值.

從圖8(b)可以看出，對于脫鉻率來說，兩者(AC)交互作用不顯著(P=0.877 1)，當CaO反應溫度為80 ℃時，脫鉻率在試驗內(nèi)達到最大值.當溫度處于70 ℃～80 ℃時，脫鉻率不斷增大，隨著溫度的繼續(xù)升高，脫鉻率逐漸降低.在試驗水平范圍內(nèi)，當CaO投加量和CaO反應溫度分別處于1.5%～3%和75 ℃～85 ℃時，脫鉻率在試驗內(nèi)達到最大值.

2.2.3 CaO反應時間與CaO反應溫度交互作用的分析與優(yōu)化

CaO反應時間、CaO反應溫度及其交互作用對膠原蛋白提取率和脫鉻率的響應曲面如圖9所示.由圖9(a)可見，對于膠原蛋白提取率，兩者(BC)交互作用極顯著(P<0.000 1).在試驗水平范圍內(nèi)，當CaO反應時間和CaO反應溫度分別處于2.5～5.5 h和70 ℃～85 ℃時，膠原蛋白提取率達到最大值.

由圖9(b)可見，對于脫鉻率，兩者(BC)交互作用顯著(P<0.011 6).當CaO反應時間和CaO反應溫度分別處于1～4 h和80 ℃～85 ℃時，脫鉻率達到最大值.

(a)CaO反應時間與CaO反應溫度交互作用對膠原白提取率的響應曲面

(b)CaO反應時間與CaO反應溫度交互作用對脫鉻率的響應曲面圖9 CaO反應時間與CaO反應溫度交互作用對膠原蛋白提取率和脫鉻率的響應曲面

2.2.4 酶投加量、酶反應時間和酶反應溫度交互作用的分析與優(yōu)化

酶投加量、酶反應時間和酶反應溫度及其交互作用對膠原蛋白提取率的響應曲面如圖10所示.酶投加量和酶反應時間交互作用(圖10(a)：EF，P=0.967 8)、酶反應時間和酶反應溫度交互作用(圖10(b)：FG，P=0.712 4)、酶投加量和酶反應溫度交互作用(圖10(c)：EG，P=0.232 6)，均不顯著.

在試驗水平范圍內(nèi)，當酶投加量和酶反應時間分別處于0.9%～1.3%和4～5 h時、酶反應時間和酶反應溫度分別處于4～5 h和35 ℃～45 ℃時、酶投加量和酶反應溫度分別處于0.9%～1.1%和35 ℃～45 ℃時，膠原蛋白提取率達到最大值.對于脫鉻率來說，酶投加量、酶反應時間和酶反應溫度之間沒有交互作用.

通過響應曲面分析，確定堿-酶結(jié)合法水解鉻革屑最佳工藝條件，即為：CaO投加量2.1%、CaO反應時間3.3 h、CaO反應溫度79.7 ℃、酶投加量5.6%、酶反應時間1.2 h、酶反應溫度48.6 ℃.優(yōu)化后膠原蛋白提取率和脫鉻率分別達到99.14%和98.9%.

3 結(jié)論

(1)通過單因素實驗探究堿水解鉻革屑和酶處理鉻革屑的最佳工藝參數(shù)：堿水解鉻革屑最佳條件為CaO用量2%、CaO反應時間3 h、CaO反應溫度80 ℃，酶水解鉻革屑最佳參數(shù)為酶用量3%、酶反應時間1 h、酶反應溫度40 ℃.水解液中鉻含量最低達到3.686 mg/L.

(2)通過響應曲面優(yōu)化試驗確定鉻革屑水解的最佳工藝條件，即為：CaO投加量2.1%、CaO反應時間3.3 h、CaO反應溫度79.7 ℃、酶投加量5.6%、酶反應時間1.2 h、酶反應溫度48.6 ℃.優(yōu)化后膠原蛋白提取率和脫鉻率分別達到99.14%和98.9%，比優(yōu)化前分別增加了6.16%和2.83%.

(3)過響應曲面優(yōu)化試驗確定各因素之間的相互作用結(jié)果，結(jié)果表明：AB、AC、BC的交互作用對于膠原蛋白提取率有著顯著的影響，而EF、EG、FG的交互作用對水解效果影響不顯著，影響效果依次為FG>EG>EF.AB和AC之間的交互作用對水解脫鉻影響不明顯，但BC的交互作用對脫鉻效果有一定影響，酶水解對脫鉻效果沒有交互作用的影響