賈 瑋， 徐 曦， 石 琳， 許秀麗， 張 峰

(1.陜西科技大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院， 陜西 西安 710021; 2.中國檢驗檢疫科學(xué)研究院， 北京 100123)

0 引言

磺胺類、喹諾酮類、大環(huán)內(nèi)酯類獸藥在養(yǎng)殖業(yè)中廣泛應(yīng)用[1].2019年，國家市場監(jiān)督管理總局通告了多起獸藥違規(guī)使用導(dǎo)致的肉類食品中獸藥高殘留超標(biāo)問題，國家食品安全“十三五”規(guī)劃對獸藥殘留的綜合治理工作提出了要求，并引起社會的關(guān)注[2].肉類基質(zhì)復(fù)雜，開發(fā)針對羊肉等基質(zhì)復(fù)雜體系中獸藥提取、凈化與富集的前處理方法是藥物殘留分析的關(guān)鍵點[3].碳納米管(MWCNTs)是一種以碳為基礎(chǔ)的納米材料，具有非極性，經(jīng)磁化后，表面含有的多個π電子增強其疏水性在溶液中均勻分散，以結(jié)合羥基、羧基等基團改變自身表面活性，通過π-π作用力、疏水作用及共軛結(jié)構(gòu)對痕量分析物產(chǎn)生強烈吸附作用，通過施加外部磁場力實現(xiàn)吸附劑與樣品溶液的迅速分離.磁性MWCNTs的固相萃取常用于反相凈化體系，適用于復(fù)雜樣品的分離及測定[4,5].

本研究將乙二醇還原法結(jié)合水熱法制備磁性修飾碳納米管磁性復(fù)合納米材料(Fe3O4@O-MWCNTs)用于凈化羊肉基質(zhì)，利用靜電場軌道阱技術(shù)的液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)，建立了一種同時檢測多種獸藥殘留的方法，為獸藥殘留的靶向篩查、結(jié)構(gòu)鑒定提供了技術(shù)支持.

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

甲醇、乙腈、甲酸，購自德國Merck公司；濃硫酸、濃硝酸、六水合三氯化鐵、乙二醇、聚乙二醇、無水乙酸鈉，購自新泰化玻試劑公司；磺胺嘧啶、磺胺噻唑、磺胺二甲氧噠嗪、磺胺二甲氧嘧啶、磺胺甲氧噠嗪、諾氟沙星、環(huán)丙沙星、恩諾沙星、泰樂霉素、紅霉素、羅紅霉素、林可霉素標(biāo)準(zhǔn)品，購自德國Dr.Erenstofer公司；MWCNTs，純度>97%，直徑10～30 nm，長度5～15μm，購自阿拉丁生化科技有限公司；羊肉，購自西安市本地超市.

1.2 儀器與設(shè)備

UltiMate3000-Q-Exactive超高效液相色譜-四極桿-靜電場軌道阱質(zhì)譜；AL204-IC型分析天平；Milli-Q超純水系統(tǒng)(美國Millipore公司)；Vortex Genie2T型旋渦混合器(美國Scientific Industries公司)；真空干燥箱(上海一恒儀器公司)；TGL-16C型高速離心機(湘儀離心機儀器有限公司).

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

分別稱取適量標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)置于10 mL容量瓶中，用甲醇配制成質(zhì)量濃度為100μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，移取適量標(biāo)準(zhǔn)儲備液，用甲醇稀釋并定容至10 mL棕色容量瓶，配制相應(yīng)濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液于-20 ℃冷凍保存；以空白樣品提取液逐級稀釋混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，制備基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液.

1.4 色譜質(zhì)譜條件

色譜柱：Hypersil Gold aQ C18(100 mm×2.1 mm,1.9μm)；柱溫：35 ℃；流動相：A為0.1%(體積分?jǐn)?shù)，下同)甲酸-4 mmol/L甲酸銨溶液，B為0.1%甲酸-4 mmol/L甲酸銨-甲醇溶液；流速：0.3 mL/min；梯度洗脫程序：0～1 min，100% A、1～7 min，100%～0% A、7～12 min，0% A、12～13 min，0%～100% A、13～15 min，100% A；進樣量：5μL；質(zhì)譜條件：電噴霧離子源(ESI+)；毛細管電壓：3 500 V；碰撞氣：N2；干燥氣流量：13 L/min；離子源溫度：350 ℃；鞘氣流量：12 L/min；輔助氣流量：3 L/min.12種獸藥質(zhì)譜信息見表1.

表1 12種獸藥的色譜-質(zhì)譜參數(shù)

1.5 材料的制備

磁性碳納米管(Fe3O4@O-MWCNTs)的制備由以下兩步完成.

(1)氧化碳納米管(O-MWCNTs)的制備

在含有10 mL濃硝酸、30 mL濃硫酸的250 mL燒杯中加入5 g MWCNTs，磁力攪拌下反應(yīng)4 h后，采用離心法從酸液中分離，用超純水沖洗至中性后過濾，在60 ℃真空干燥箱中烘干10 h，制得O-MWCNTs，固體研磨呈粉末備用.

(2)磁性碳納米管(Fe3O4@O-MWCNTs)的制備

Fe3O4@O-MWCNTs采用乙二醇水熱還原法進行制備[6].稱取1.5 g六水合三氯化鐵與2 g O-MWCNTs懸浮在75 mL的乙二醇溶液中，再分別加入3.6 g無水乙酸鈉、1.8 g聚乙二醇溶解，渦旋3 min、超聲10 min后，繼續(xù)攪拌至混合均勻，將上述混合溶液轉(zhuǎn)至100 mL高壓反應(yīng)釜的聚氟乙烯內(nèi)襯中，將反應(yīng)釜在200 ℃下反應(yīng)12 h左右，將其冷卻至室溫后采用磁鐵分離，用超純水多次沖洗至中性，于真空干燥箱70 ℃下烘干，研磨后備用.

1.6 樣品前處理方法

(1)提取

稱取絞碎均勻的羊肉樣品2 g(精確至0.01 g)于50 mL塑料離心管中，分別加5 mL0.1 mol/L Na2EDTA-Mcllvaine(檸檬酸緩沖液)、1%甲酸-乙腈溶液振蕩提取2 min，5 000 r/min離心5 min，收集上清液；殘渣中再分別加入5 mL提取液，于20 ℃超聲水浴超聲20 min后，離心5 min，合并兩次提取液過0.22μm濾膜后用于凈化.

(2)凈化

取一定量提取液，加入50 mg Fe3O4@O-MWCNTs渦旋混勻后，采用HCL或NaOH調(diào)pH至5，萃取10 min，用磁鐵分離出萃取劑，采用1.5 mL 0.1%甲酸-甲醇洗脫后收集洗脫液，經(jīng)0.22μm濾膜過濾，上機測定.凈化流程如圖1所示.

圖1 樣品凈化流程圖

2 結(jié)果與討論

2.1 合成材料的表征

通過掃描電子顯微鏡(SEM)對材料表面形態(tài)進行表征.從圖2、圖3可清晰地觀察到，MWCNTs和經(jīng)Fe3O4修飾后材料的表面形態(tài)、結(jié)構(gòu)與孔徑分布，對比可見，原始MWCNTs呈光滑的中空管束狀，磁化修飾后生成的Fe3O4尺寸大小基本一致的球狀顆粒較好的吸附在MWCNTs的表面并無團聚現(xiàn)象.

圖2 MWCNTs 的SEM圖譜

圖3 Fe3O4@O-MWCNTs的SEM圖譜

圖4為磁化后MWCNTs的X射線衍射(XRD)圖譜.圖中出現(xiàn)Fe3O4相近的6個特征衍射峰，2θ分別為12.88、17.61、30.02、35.95、57.96、64.98，同時保留了MWCNTs特征峰25.54、44.85，表明Fe3O4成功地積聚在MWCNTs的表面并未破壞MWCNTs的結(jié)構(gòu).

圖4 Fe3O4@O-MWCNTs的XRD圖譜

將磁性材料在室溫下用磁力計進行磁滯回線(VSM)測試，圖5中Fe3O4@O-MWCNTs的磁滯回線圖顯示出幾乎為零的矯頑力和剩磁，最大飽和磁化強度為88.4 emu·g-1，表明材料具有超磁導(dǎo)率和高飽和磁化強度，使其在外部磁場的作用下高效的從樣品介質(zhì)中分離出來從而實現(xiàn)磁固相分離[7].

圖5 Fe3O4@O-MWCNTs的VSM圖譜

2.2 磁固相萃取條件(MSPE)的優(yōu)化

MSPE通過渦旋或振蕩使磁性吸附劑在樣品溶液中分散，在磁力作用下實現(xiàn)分析物的快速轉(zhuǎn)移，吸附和洗脫過程是影響磁固相萃取效果的關(guān)鍵，主要影響因素有洗脫條件、吸附劑的量、溶液pH、吸附時間，評價方法為MSPE后洗脫溶劑中目標(biāo)分析物的總量與MSPE前標(biāo)準(zhǔn)溶液中目標(biāo)分析物總量之比，實驗中對以上參數(shù)進行了考察[8].

2.2.1 洗脫條件的優(yōu)化

洗脫溶劑的種類及用量是影響萃取率的重要因素之一[9].磺胺類、喹諾酮類、大環(huán)內(nèi)酯類藥物均含有堿性氨基，易溶于極性有機溶劑，在酸性條件下易獲得質(zhì)子.依據(jù)相似相溶原理，分別考察了單相極性溶劑(甲醇、乙腈)、弱酸水溶劑(0.1%甲酸-水)及弱酸緩沖液(0.1%甲酸-甲醇、0.1%甲酸-乙腈)5種洗脫溶劑對12種藥物的洗脫效果，結(jié)果如圖6所示.由圖6可知，0.1%甲酸-甲醇萃取率最高，因此選擇0.1%甲酸-甲醇作為洗脫溶劑[10-12].

圖6 洗脫溶劑的類型對萃取的影響

實驗進一步考察0.5～3.5 mL不同體積0.1%甲酸-甲醇的萃取效果，由圖7可見，洗脫溶劑體積的增加，萃取率顯著提高，當(dāng)體積達到1.5 mL時，萃取率最高，再繼續(xù)增大洗脫劑體積，萃取率逐漸降低.因此，綜合考慮選擇最佳洗脫溶劑體積為1.5 mL.

圖7 不同體積0.1%甲酸-甲醇對萃取率的影響

2.2.2 吸附劑量的優(yōu)化

為實現(xiàn)多組分分析物快速有效的富集，對吸附劑的用量進行優(yōu)化.圖8顯示， 當(dāng)Fe3O4@O-MWCNTs的量從10 mg增加至50 mg，12種獸藥萃取率顯著增加，當(dāng)吸附劑的量增至60 mg時萃取率減小，為提供更多吸附位點保證吸附完全，實驗選擇50 mg Fe3O4@O-MWCNTs作為MSPE過程吸附劑的量.

圖8 吸附劑量對萃取率的影響

2.2.3 pH的優(yōu)化

溶液的pH影響目標(biāo)分析物的化學(xué)性質(zhì)、吸附劑表面電荷的密度與類型，實驗研究了pH2～8范圍內(nèi)吸附劑對萃取率的影響.因強酸性pH環(huán)境下，12種獸藥主要以非離子化形式存在，在堿性環(huán)境下主要以去質(zhì)子化形式存在，MWCNTs表面負載的部分磁性納米顆粒會發(fā)生溶解，圖9所示，pH由酸性至弱酸性(2～5)，12種化合物萃取率顯著增加；pH由弱酸性至堿性(5～8)，萃取率逐漸減低.因此，pH為6作為最佳條件.

圖9 pH對萃取率的影響

2.2.4 吸附時間的優(yōu)化

吸附時間是MSPE的重要參數(shù)之一，常以延長吸附時間以達到萃取平衡提高萃取率[13].通過渦旋輔助，在Fe3O4@O-MWCNTs用量為50 mg，洗脫溶劑為0.1%甲酸-甲醇，洗脫體積1.5 mL，pH為5的吸附條件下，研究了不同時間(1～13 min)萃取率隨時間變化的影響.由圖10可知，當(dāng)吸附時間為10 min時，F(xiàn)e3O4@O-MWCNTs對12種藥物的萃取率達到最高值.因此，萃取時間選擇為10 min.

圖10 吸附時間對萃取率的影響

2.3 Fe3O4@O-MWCNTs循環(huán)性實驗

Fe3O4@O-MWCNTs具有反復(fù)吸附-脫附的性能，實驗研究其吸附12種獸藥循環(huán)使用次數(shù).吸附完成后，使用乙腈和水依次洗滌Fe3O4@O-MWCNTs 3次后于烘箱70 ℃下烘干，按“1.6”步驟進行實驗.結(jié)果顯示，材料可重復(fù)使用至少10次，回收率偏差小于12%，說明此材料具有較好的循環(huán)性.

2.4 基質(zhì)效應(yīng)

通過比較空白基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液和純?nèi)軇?biāo)準(zhǔn)溶液的響應(yīng)值差異評價基質(zhì)效應(yīng).在空白羊肉基質(zhì)提取液中添加混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，以基質(zhì)效應(yīng)(ME)=(1-基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率/溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率)×100%計算目標(biāo)物的基質(zhì)效應(yīng)[14].結(jié)果表明，12種獸藥ME的絕對值在20%～50%之間，表明存在中等強度的基質(zhì)效應(yīng).因此，實驗通過基質(zhì)匹配法進行定量分析，減弱基質(zhì)效應(yīng).

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 線性范圍及檢出限

分別添加1μg/L、5μg/L、10μg/L、50μg/L、100μg/L、200μg/L的目標(biāo)化合物混合標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)于空白基質(zhì)中，以各物質(zhì)的響應(yīng)峰面積對應(yīng)的質(zhì)量濃度繪制工作曲線.結(jié)果表明，12種化合物在1～200μg/L呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)(r2)均大于0.99.在空白液中添加系列濃度的12種獸藥混標(biāo)溶液，分別以3倍信噪比確定檢出限，以10倍信噪比確定定量限，結(jié)果見表2，12種化合物的檢出限為0.09～5.29μg/kg.

2.5.2 回收率與精密度

分別在陰性羊肉樣品中添加低、中、高3個水平的12種目標(biāo)化合物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照“1.6”處理后檢測分析，每個水平進行6次試驗.結(jié)果表明，12種化合物的平均回收率為71.37%～94.65%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.35%～6.37%(見表2).其準(zhǔn)確度與精密度能滿足殘留檢測的要求，表明該方法可靠、準(zhǔn)確，適合此類物質(zhì)的定量分析.

2.6 實際樣品測定

應(yīng)用本研究建立的方法對市售23批次羊肉進行篩查，采用精確質(zhì)量數(shù)與保留時間對樣品中12種獸藥定性篩查，結(jié)合二級特征碎片離子進行確證，檢出一份陽性樣品含有磺胺二甲氧嘧啶，含量為1.3μg/kg.

表2 羊肉中12種獸藥的線性關(guān)系、檢出限、回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差

3 結(jié)論

本研究將Fe3O4@O-MWCNTs作為吸附劑用于富集羊肉中12種獸藥，通過優(yōu)化磁固相萃取方法，結(jié)合超高效液相色譜-四極桿-靜電場軌道阱質(zhì)譜(UHPLC-Q-Orbitrap MS)，極大地提高了萃取率與檢測方法的靈敏度，實現(xiàn)了對復(fù)雜基質(zhì)多種藥物殘留的快速篩查與定量.