賈 瑋, 徐 曦, 石 琳, 許秀麗, 張 峰
(1.陜西科技大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院, 陜西 西安 710021; 2.中國檢驗檢疫科學(xué)研究院, 北京 100123)
磺胺類、喹諾酮類、大環(huán)內(nèi)酯類獸藥在養(yǎng)殖業(yè)中廣泛應(yīng)用[1].2019年,國家市場監(jiān)督管理總局通告了多起獸藥違規(guī)使用導(dǎo)致的肉類食品中獸藥高殘留超標(biāo)問題,國家食品安全“十三五”規(guī)劃對獸藥殘留的綜合治理工作提出了要求,并引起社會的關(guān)注[2].肉類基質(zhì)復(fù)雜,開發(fā)針對羊肉等基質(zhì)復(fù)雜體系中獸藥提取、凈化與富集的前處理方法是藥物殘留分析的關(guān)鍵點[3].碳納米管(MWCNTs)是一種以碳為基礎(chǔ)的納米材料,具有非極性,經(jīng)磁化后,表面含有的多個π電子增強其疏水性在溶液中均勻分散,以結(jié)合羥基、羧基等基團改變自身表面活性,通過π-π作用力、疏水作用及共軛結(jié)構(gòu)對痕量分析物產(chǎn)生強烈吸附作用,通過施加外部磁場力實現(xiàn)吸附劑與樣品溶液的迅速分離.磁性MWCNTs的固相萃取常用于反相凈化體系,適用于復(fù)雜樣品的分離及測定[4,5].
本研究將乙二醇還原法結(jié)合水熱法制備磁性修飾碳納米管磁性復(fù)合納米材料(Fe3O4@O-MWCNTs)用于凈化羊肉基質(zhì),利用靜電場軌道阱技術(shù)的液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng),建立了一種同時檢測多種獸藥殘留的方法,為獸藥殘留的靶向篩查、結(jié)構(gòu)鑒定提供了技術(shù)支持.
甲醇、乙腈、甲酸,購自德國Merck公司;濃硫酸、濃硝酸、六水合三氯化鐵、乙二醇、聚乙二醇、無水乙酸鈉,購自新泰化玻試劑公司;磺胺嘧啶、磺胺噻唑、磺胺二甲氧噠嗪、磺胺二甲氧嘧啶、磺胺甲氧噠嗪、諾氟沙星、環(huán)丙沙星、恩諾沙星、泰樂霉素、紅霉素、羅紅霉素、林可霉素標(biāo)準(zhǔn)品,購自德國Dr.Erenstofer公司;MWCNTs,純度>97%,直徑10~30 nm,長度5~15μm,購自阿拉丁生化科技有限公司;羊肉,購自西安市本地超市.
UltiMate3000-Q-Exactive超高效液相色譜-四極桿-靜電場軌道阱質(zhì)譜;AL204-IC型分析天平;Milli-Q超純水系統(tǒng)(美國Millipore公司);Vortex Genie2T型旋渦混合器(美國Scientific Industries公司);真空干燥箱(上海一恒儀器公司);TGL-16C型高速離心機(湘儀離心機儀器有限公司).
分別稱取適量標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)置于10 mL容量瓶中,用甲醇配制成質(zhì)量濃度為100μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液,移取適量標(biāo)準(zhǔn)儲備液,用甲醇稀釋并定容至10 mL棕色容量瓶,配制相應(yīng)濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液于-20 ℃冷凍保存;以空白樣品提取液逐級稀釋混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液,制備基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液.
色譜柱:Hypersil Gold aQ C18(100 mm×2.1 mm,1.9μm);柱溫:35 ℃;流動相:A為0.1%(體積分?jǐn)?shù),下同)甲酸-4 mmol/L甲酸銨溶液,B為0.1%甲酸-4 mmol/L甲酸銨-甲醇溶液;流速:0.3 mL/min;梯度洗脫程序:0~1 min,100% A、1~7 min,100%~0% A、7~12 min,0% A、12~13 min,0%~100% A、13~15 min,100% A;進樣量:5μL;質(zhì)譜條件:電噴霧離子源(ESI+);毛細管電壓:3 500 V;碰撞氣:N2;干燥氣流量:13 L/min;離子源溫度:350 ℃;鞘氣流量:12 L/min;輔助氣流量:3 L/min.12種獸藥質(zhì)譜信息見表1.
表1 12種獸藥的色譜-質(zhì)譜參數(shù)
磁性碳納米管(Fe3O4@O-MWCNTs)的制備由以下兩步完成.
(1)氧化碳納米管(O-MWCNTs)的制備
在含有10 mL濃硝酸、30 mL濃硫酸的250 mL燒杯中加入5 g MWCNTs,磁力攪拌下反應(yīng)4 h后,采用離心法從酸液中分離,用超純水沖洗至中性后過濾,在60 ℃真空干燥箱中烘干10 h,制得O-MWCNTs,固體研磨呈粉末備用.
(2)磁性碳納米管(Fe3O4@O-MWCNTs)的制備
Fe3O4@O-MWCNTs采用乙二醇水熱還原法進行制備[6].稱取1.5 g六水合三氯化鐵與2 g O-MWCNTs懸浮在75 mL的乙二醇溶液中,再分別加入3.6 g無水乙酸鈉、1.8 g聚乙二醇溶解,渦旋3 min、超聲10 min后,繼續(xù)攪拌至混合均勻,將上述混合溶液轉(zhuǎn)至100 mL高壓反應(yīng)釜的聚氟乙烯內(nèi)襯中,將反應(yīng)釜在200 ℃下反應(yīng)12 h左右,將其冷卻至室溫后采用磁鐵分離,用超純水多次沖洗至中性,于真空干燥箱70 ℃下烘干,研磨后備用.
(1)提取
稱取絞碎均勻的羊肉樣品2 g(精確至0.01 g)于50 mL塑料離心管中,分別加5 mL0.1 mol/L Na2EDTA-Mcllvaine(檸檬酸緩沖液)、1%甲酸-乙腈溶液振蕩提取2 min,5 000 r/min離心5 min,收集上清液;殘渣中再分別加入5 mL提取液,于20 ℃超聲水浴超聲20 min后,離心5 min,合并兩次提取液過0.22μm濾膜后用于凈化.
(2)凈化
取一定量提取液,加入50 mg Fe3O4@O-MWCNTs渦旋混勻后,采用HCL或NaOH調(diào)pH至5,萃取10 min,用磁鐵分離出萃取劑,采用1.5 mL 0.1%甲酸-甲醇洗脫后收集洗脫液,經(jīng)0.22μm濾膜過濾,上機測定.凈化流程如圖1所示.
圖1 樣品凈化流程圖
通過掃描電子顯微鏡(SEM)對材料表面形態(tài)進行表征.從圖2、圖3可清晰地觀察到,MWCNTs和經(jīng)Fe3O4修飾后材料的表面形態(tài)、結(jié)構(gòu)與孔徑分布,對比可見,原始MWCNTs呈光滑的中空管束狀,磁化修飾后生成的Fe3O4尺寸大小基本一致的球狀顆粒較好的吸附在MWCNTs的表面并無團聚現(xiàn)象.
圖2 MWCNTs 的SEM圖譜
圖3 Fe3O4@O-MWCNTs的SEM圖譜
圖4為磁化后MWCNTs的X射線衍射(XRD)圖譜.圖中出現(xiàn)Fe3O4相近的6個特征衍射峰,2θ分別為12.88、17.61、30.02、35.95、57.96、64.98,同時保留了MWCNTs特征峰25.54、44.85,表明Fe3O4成功地積聚在MWCNTs的表面并未破壞MWCNTs的結(jié)構(gòu).
圖4 Fe3O4@O-MWCNTs的XRD圖譜
將磁性材料在室溫下用磁力計進行磁滯回線(VSM)測試,圖5中Fe3O4@O-MWCNTs的磁滯回線圖顯示出幾乎為零的矯頑力和剩磁,最大飽和磁化強度為88.4 emu·g-1,表明材料具有超磁導(dǎo)率和高飽和磁化強度,使其在外部磁場的作用下高效的從樣品介質(zhì)中分離出來從而實現(xiàn)磁固相分離[7].
圖5 Fe3O4@O-MWCNTs的VSM圖譜
MSPE通過渦旋或振蕩使磁性吸附劑在樣品溶液中分散,在磁力作用下實現(xiàn)分析物的快速轉(zhuǎn)移,吸附和洗脫過程是影響磁固相萃取效果的關(guān)鍵,主要影響因素有洗脫條件、吸附劑的量、溶液pH、吸附時間,評價方法為MSPE后洗脫溶劑中目標(biāo)分析物的總量與MSPE前標(biāo)準(zhǔn)溶液中目標(biāo)分析物總量之比,實驗中對以上參數(shù)進行了考察[8].
2.2.1 洗脫條件的優(yōu)化
洗脫溶劑的種類及用量是影響萃取率的重要因素之一[9].磺胺類、喹諾酮類、大環(huán)內(nèi)酯類藥物均含有堿性氨基,易溶于極性有機溶劑,在酸性條件下易獲得質(zhì)子.依據(jù)相似相溶原理,分別考察了單相極性溶劑(甲醇、乙腈)、弱酸水溶劑(0.1%甲酸-水)及弱酸緩沖液(0.1%甲酸-甲醇、0.1%甲酸-乙腈)5種洗脫溶劑對12種藥物的洗脫效果,結(jié)果如圖6所示.由圖6可知,0.1%甲酸-甲醇萃取率最高,因此選擇0.1%甲酸-甲醇作為洗脫溶劑[10-12].
圖6 洗脫溶劑的類型對萃取的影響
實驗進一步考察0.5~3.5 mL不同體積0.1%甲酸-甲醇的萃取效果,由圖7可見,洗脫溶劑體積的增加,萃取率顯著提高,當(dāng)體積達到1.5 mL時,萃取率最高,再繼續(xù)增大洗脫劑體積,萃取率逐漸降低.因此,綜合考慮選擇最佳洗脫溶劑體積為1.5 mL.
圖7 不同體積0.1%甲酸-甲醇對萃取率的影響
2.2.2 吸附劑量的優(yōu)化
為實現(xiàn)多組分分析物快速有效的富集,對吸附劑的用量進行優(yōu)化.圖8顯示, 當(dāng)Fe3O4@O-MWCNTs的量從10 mg增加至50 mg,12種獸藥萃取率顯著增加,當(dāng)吸附劑的量增至60 mg時萃取率減小,為提供更多吸附位點保證吸附完全,實驗選擇50 mg Fe3O4@O-MWCNTs作為MSPE過程吸附劑的量.
圖8 吸附劑量對萃取率的影響
2.2.3 pH的優(yōu)化
溶液的pH影響目標(biāo)分析物的化學(xué)性質(zhì)、吸附劑表面電荷的密度與類型,實驗研究了pH2~8范圍內(nèi)吸附劑對萃取率的影響.因強酸性pH環(huán)境下,12種獸藥主要以非離子化形式存在,在堿性環(huán)境下主要以去質(zhì)子化形式存在,MWCNTs表面負載的部分磁性納米顆粒會發(fā)生溶解,圖9所示,pH由酸性至弱酸性(2~5),12種化合物萃取率顯著增加;pH由弱酸性至堿性(5~8),萃取率逐漸減低.因此,pH為6作為最佳條件.
圖9 pH對萃取率的影響
2.2.4 吸附時間的優(yōu)化
吸附時間是MSPE的重要參數(shù)之一,常以延長吸附時間以達到萃取平衡提高萃取率[13].通過渦旋輔助,在Fe3O4@O-MWCNTs用量為50 mg,洗脫溶劑為0.1%甲酸-甲醇,洗脫體積1.5 mL,pH為5的吸附條件下,研究了不同時間(1~13 min)萃取率隨時間變化的影響.由圖10可知,當(dāng)吸附時間為10 min時,F(xiàn)e3O4@O-MWCNTs對12種藥物的萃取率達到最高值.因此,萃取時間選擇為10 min.
圖10 吸附時間對萃取率的影響
Fe3O4@O-MWCNTs具有反復(fù)吸附-脫附的性能,實驗研究其吸附12種獸藥循環(huán)使用次數(shù).吸附完成后,使用乙腈和水依次洗滌Fe3O4@O-MWCNTs 3次后于烘箱70 ℃下烘干,按“1.6”步驟進行實驗.結(jié)果顯示,材料可重復(fù)使用至少10次,回收率偏差小于12%,說明此材料具有較好的循環(huán)性.
通過比較空白基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液和純?nèi)軇?biāo)準(zhǔn)溶液的響應(yīng)值差異評價基質(zhì)效應(yīng).在空白羊肉基質(zhì)提取液中添加混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,以基質(zhì)效應(yīng)(ME)=(1-基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率/溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率)×100%計算目標(biāo)物的基質(zhì)效應(yīng)[14].結(jié)果表明,12種獸藥ME的絕對值在20%~50%之間,表明存在中等強度的基質(zhì)效應(yīng).因此,實驗通過基質(zhì)匹配法進行定量分析,減弱基質(zhì)效應(yīng).
2.5.1 線性范圍及檢出限
分別添加1μg/L、5μg/L、10μg/L、50μg/L、100μg/L、200μg/L的目標(biāo)化合物混合標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)于空白基質(zhì)中,以各物質(zhì)的響應(yīng)峰面積對應(yīng)的質(zhì)量濃度繪制工作曲線.結(jié)果表明,12種化合物在1~200μg/L呈良好的線性關(guān)系,相關(guān)系數(shù)(r2)均大于0.99.在空白液中添加系列濃度的12種獸藥混標(biāo)溶液,分別以3倍信噪比確定檢出限,以10倍信噪比確定定量限,結(jié)果見表2,12種化合物的檢出限為0.09~5.29μg/kg.
2.5.2 回收率與精密度
分別在陰性羊肉樣品中添加低、中、高3個水平的12種目標(biāo)化合物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,按照“1.6”處理后檢測分析,每個水平進行6次試驗.結(jié)果表明,12種化合物的平均回收率為71.37%~94.65%,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.35%~6.37%(見表2).其準(zhǔn)確度與精密度能滿足殘留檢測的要求,表明該方法可靠、準(zhǔn)確,適合此類物質(zhì)的定量分析.
應(yīng)用本研究建立的方法對市售23批次羊肉進行篩查,采用精確質(zhì)量數(shù)與保留時間對樣品中12種獸藥定性篩查,結(jié)合二級特征碎片離子進行確證,檢出一份陽性樣品含有磺胺二甲氧嘧啶,含量為1.3μg/kg.
表2 羊肉中12種獸藥的線性關(guān)系、檢出限、回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差
本研究將Fe3O4@O-MWCNTs作為吸附劑用于富集羊肉中12種獸藥,通過優(yōu)化磁固相萃取方法,結(jié)合超高效液相色譜-四極桿-靜電場軌道阱質(zhì)譜(UHPLC-Q-Orbitrap MS),極大地提高了萃取率與檢測方法的靈敏度,實現(xiàn)了對復(fù)雜基質(zhì)多種藥物殘留的快速篩查與定量.