（武漢市農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所，武漢 430065）

在奶牛場的日常飼養(yǎng)管理工作中，繁殖是重點所在，提高繁殖率是提高產(chǎn)奶量和牧場經(jīng)濟效益的關鍵。奶牛受胎率低或屢配不孕一直是困擾養(yǎng)殖戶的重要問題，而妊娠早期胚胎死亡是導致奶牛繁殖障礙的重要原因之一[1]。研究發(fā)現(xiàn)，雖然反芻動物的受精成功率可達90%～100%，但最終成功分娩的只有大約55%，有將近一半的胚胎在妊娠早期發(fā)生了胚胎死亡，其中有2/3發(fā)生在妊娠的圍植入期，表明約有30%的胚胎在配種后約21d內(nèi)死亡，特別是在配種后14～19d的母體妊娠識別期死亡[2,3]。導致奶牛妊娠早期胚胎死亡的原因有來源于母體的，也有來源于胚胎本身的，主要包括胚胎與子宮間的互作障礙、內(nèi)分泌環(huán)境以及母體營養(yǎng)和疾病等多方面因素。妊娠早期胚胎死亡會導致奶牛屢配不孕和發(fā)情延遲，從而延長產(chǎn)犢間隔，降低奶牛繁殖效率，增加飼養(yǎng)成本，最終造成奶牛場的經(jīng)濟損失。

反芻動物妊娠識別信號IFNT可引起母體外周血中干擾素刺激基因（interferon stimulated genes，ISGs）和免疫反應相關細胞因子的表達變化，從而影響妊娠的建立和維持。ISGs在外周血中的表達模式可反映胚胎的發(fā)育狀態(tài)，不僅可用于妊娠診斷，也可用于胚胎死亡的早期監(jiān)測[4～8]。因此，為了探究奶牛妊娠早期胚胎死亡的原因和分子機理，本研究通過采集奶牛人工授精后0d、18d和28d的外周血液樣本，檢測ISGs和免疫相關細胞因子等的表達規(guī)律，并深入分析導致妊娠失敗的原因，為奶牛配種后胚胎死亡高峰期保胎措施的制定提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 主要試劑與儀器

RNAprep Pure血液樣品總RNA提取試劑盒，購自天根生化科技有限公司；反轉錄試劑盒RevertAid First-Strand cDNA Synthesis kit，為Thermo Scientific公司產(chǎn)品；普通PCR擴增預混液和熒光定量PCR擴增預混液(SYBR Green Master Mix），為南京諾唯贊生物科技有限公司產(chǎn)品；瓊脂糖，購自Sigma公司；?？焖倏梢曉袡z試劑盒，購自美國IDEXX公司；QPCR引物，于北京擎科新業(yè)生物技術有限公司合成；Bio-Rad CFX96實時熒光PCR儀和尤尼柯紫外分光光度計，購自尤尼柯（上海）儀器公司。

1.1.2 樣本采集

試驗動物來自湖北省黃岡市某奶牛養(yǎng)殖場，選取健康狀況良好、體況相近的未孕奶牛11頭，經(jīng)同期發(fā)情后進行人工授精。在配種后0d、18d和28d，通過尾靜脈采集試驗牛的血液樣本，放入冰盒并迅速送至實驗室提取總RNA或分離血清。經(jīng)人工授精后28d血清PAG ELISA檢測和42d直腸觸診確定妊娠失敗牛9頭，該9頭牛的血液樣本用于ISGs的分析。

1.2 試驗方法

1.2.1 血液總RNA的提取及反轉錄

利用RNAprep Pure血液總RNA提取試劑盒提取血液樣本中總RNA，具體步驟按試劑盒說明書進行，并通過瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性，然后用紫外分光光度計測定RNA的純度和濃度，制備好的RNA樣本保存于-80℃冰箱。RNA樣本的反轉錄采用Thermo Scientific公司的RevertAidTM 第一鏈cDNA合成試劑盒進行，具體步驟參見說明書。

1.2.2 Real-time qPCR檢測相關基因mRNA的表達變化

采用諾唯贊的SYBR Green Master Mix進行熒光定量PCR檢測，反應體系為20μL：2×AceQ qPCR SYBR Green Master Mix 10μL，上下游引物（10μmol/L）各0.4μL，cDNA模板0.6μL，ddH2O補至20μL。每個樣本重復3次。定量PCR在Bio-Rad CFX96實時熒光PCR儀上進行，反應條件為：95℃預變性5min，95℃10s，60℃ 30s，共40個循環(huán)，融解曲線采集程序為65～95℃，0.5℃/s，共10s。熒光定量PCR引物信息見表1。

表1 熒光定量PCR引物序列信息

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與處理

熒光定量PCR試驗樣品目的基因mRNA的相對表達量用2-△△Ct法進行計算，0d時各目的基因的相對表達量較正為1，其余各組的表達量均為0d的倍數(shù)。采用GraphPad Prism5軟件對試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，試驗數(shù)據(jù)以“平均值±標準誤”表示，采用t檢驗對試驗結果進行差異顯著性分析，P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 干擾素刺激基因在妊娠失敗牛外周血液中的表達

ISGs在妊娠失敗奶牛外周血液中的表達結果如圖1所示，與人工授精后0d相比，試驗牛配種后18d外周血中ISG15、RSAD2、MX1和RTP4 mRNA的表達量均無顯著變化，其中RSAD2、MX1和RTP4 mRNA水平有上調的趨勢，與0d時相比其平均上調倍數(shù)分別為2.01、1.66和3.49（P＞0.05）。

圖1 妊娠失敗牛外周血中ISGs mRNA的表達

2.2 Th1和Th2細胞因子在妊娠失敗牛外周血液中的表達

熒光定量PCR檢測Th1和Th2細胞因子在妊娠失敗牛外周血中的表達結果如圖2所示。與人工授精后0d相比，試驗牛配種后18d外周血中IL-2、IFNγ和IL-4 mRNA表達分別平均上調1.98倍（P＜0.05）、2.07倍（P＞0.05）和1.28倍（P＞0.05），IL-10 mRNA表達平均下調1.38倍（P＜0.05）。

圖2 妊娠失敗牛外周血中Th1、Th2細胞因子mRNA的表達

2.3 CCL8和CXCL10在妊娠失敗牛外周血液中的表達

趨化因子CCL8和CXCL10在妊娠失敗牛外周血中的表達結果如圖3所示。與人工授精后0d相比，試驗牛配種后18d外周血中CCL8 mRNA表達平均下調1.37倍（P＜0.05），CXCL10 mRNA表達平均上調2.90倍（P＞0.05）。

圖3 妊娠失敗牛外周血中CCL8和CXCL10 mRNA的表達

3 討論

在過去數(shù)十年中，由于遺傳選育和生產(chǎn)管理及營養(yǎng)水平的不斷提高，奶牛的產(chǎn)奶量得到了顯著提升，然而高產(chǎn)奶牛的繁育性能卻表現(xiàn)出明顯的下降，特別是早期胚胎死亡的高發(fā)生率，成為造成奶牛場經(jīng)濟損失的主要原因之一[12,13]。研究指出在妊娠早期IFNT不僅可引起子宮組織，也可引起黃體和外周血白細胞中如ISG15、MX1、RTP4等ISGs的表達上調，為反芻動物早期妊娠診斷方法的建立提供了分子基礎[14,15]。然而，也有研究表明ISGs的高表達可能與牛配種后早期胚胎損失的發(fā)生密切相關[8,16]?；诖?，本試驗檢測了妊娠失敗牛人工授精后0d和18d外周血中經(jīng)典ISGs的表達，結果顯示與0d相比，18d時血液中ISG15 mRNA的表達有輕微下降趨勢，而RSAD2、MX1和RTP4的表達有上調的趨勢，但統(tǒng)計分析無顯著差異。程蕾等研究結果指出，與0d時相比，空懷牛18d時外周血中ISG15基因呈下調表達，RSAD2的表達無顯著變化[17,18]。Shirasuna等[19]學者也有類似的發(fā)現(xiàn)，在空懷?；蛟缙谂咛ニ劳雠Ｍ庵苎獑魏思毎蠭SG15的表達量無顯著變化，本試驗結果與前人研究結果基本一致。此外，在本試驗結果中分析發(fā)現(xiàn)，妊娠失敗牛配種后18d血液中RSAD2基因表達相比0d時平均上調2.01倍，MX1基因平均上調1.66倍，RTP4基因平均上調3.49倍，雖然平均上調倍數(shù)較大，但統(tǒng)計分析顯示仍不具備顯著性差異。本試驗結果與Kose等[8]的研究報道具有一定的相似之處，該研究小組發(fā)現(xiàn)在發(fā)生胚胎死亡的綿羊外周血白細胞中RTP4和MX1 mRNA的表達量在18d時呈極顯著上調，而本試驗結果顯示MX1和RTP4雖也呈上調表達，但無顯著差異，這可能與本研究中實驗牛頭數(shù)相對較少且由于遺傳或營養(yǎng)等因素引起的個體間差異較大有關。

在反芻動物早期妊娠期間，Th細胞及其細胞因子的動態(tài)平衡在避免胚胎遭受母體的免疫排斥，保證胎兒的正常發(fā)育中發(fā)揮重要作用。Th1細胞因子包括IL-2、IFN-γ和TNF-α，在妊娠過程中可增強機體的免疫反應，是促炎性細胞因子；Th2細胞因子包括IL-4、IL-5、IL-6、IL-10和IL-13，可發(fā)揮抗炎作用抑制機體的免疫反應[20]。在正常的妊娠情況下，母體Th1細胞因子受到抑制，而Th2細胞因子分泌增加[21]。本研究檢測了妊娠失敗牛血液中Th1和Th2細胞因子的表達，結果顯示妊娠失敗牛配種18d時血液中IL-2的表達量顯著高于0d（P＜0.05），IFN-γ 的表達相比0d也平均上調2.07倍（P＞0.05），且18d時IL-10的表達量呈顯著下調（P＜0.05），這與前人的研究結果基本一致[10]，表明Th1與Th2細胞因子表達水平的失衡可能是導致本研究中實驗牛妊娠失敗的原因之一。但在本研究結果中也發(fā)現(xiàn)配種18d時IL4的表達相比0d上調1.28倍（P＞0.05），這可能與實驗牛頭數(shù)及個體間差異較大有關。

CCL8是趨化因子CC家族中的一員，由單核細胞和巨噬細胞分泌產(chǎn)生，CXCL10屬于CXC家族，由中性粒細胞、單核細胞和NK細胞等多種免疫細胞在受IFN-γ刺激后分泌產(chǎn)生，兩者均在機體炎癥反應和免疫調節(jié)中發(fā)揮重要作用[22]。有研究表明早期妊娠可引起牛子宮內(nèi)膜CCL8和CXCL10的表達增加，且CCL8可下調牛子宮內(nèi)膜COX-2和催產(chǎn)素受體的表達[23]，CXCL10在促進胚胎滋養(yǎng)層與子宮內(nèi)膜的黏附中也發(fā)揮重要作用[24]。本試驗檢測了妊娠失敗牛血液中CCL8和CXCL10的表達，結果顯示妊娠失敗牛配種18d時血液CCL8的表達量顯著低于0d（P＜0.05），而CXCL10的表達相對0d平均上調2.90倍（P＞0.05）。Sakumoto等[11]學者研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)生早期或晚期胚胎死亡牛配種18d時外周血白細胞中CCL8和CXCL10 mRNA的表達與14d相比均無顯著差異，與本試驗結果存在一定的不同之處，可能的原因是實驗動物品種及樣本比較分析的時間點不同。研究表明，CXCL10可由IFN-γ和IFNT刺激產(chǎn)生，與靶細胞上的受體結合后可通過一系列炎癥反應信號通路介導Th1細胞因子產(chǎn)生，同時抑制Th2細胞因子[25]，因此，這可能與本試驗結果中IL-2的顯著上調表達，以及IL-10的顯著下調表達相關。

4 結論

本研究通過對人工授精后妊娠失敗牛外周血中ISGs和免疫反應相關的細胞因子的檢測分析發(fā)現(xiàn)，配種18d時RSAD2、MX1和RTP4的表達雖無顯著變化，但均呈上調趨勢，提示ISGs的高表達可能對早期妊娠產(chǎn)生不利影響；此外，18d時IL-2的顯著上調表達，以及IL-10和CCL8的顯著下調表達可能是導致母體免疫失調，引發(fā)早期胚胎死亡的原因。本研究可為奶牛早期妊娠失敗的原因提供基礎參考，并為奶牛配種后胚胎死亡高峰期保胎措施的制定提供理論依據(jù)。