都鵬程 - 王 輝 胡月明 - 涂宗財,2,3 -,2,3

(1. 南昌大學食品科學與技術國家重點實驗室，江西 南昌 330047；2. 江西師范大學國家淡水魚加工技術研發(fā)專業(yè)中心，江西 南昌 330022；3. 江西師范大學江西省淡水魚高值化利用工程技術研究中心，江西 南昌 330022)

硒作為必需微量元素，與人體生理功能密切相關，如構成體內(nèi)谷胱甘肽過氧化物酶、硫氧還蛋白還原酶的活性中心[1-3]，還具有預防心血管疾病、抗衰老、抗病毒等作用[4]。單質(zhì)硒是一種生物惰性硒，無生物毒性和生物活性[5]。張勁松等[6-7]發(fā)現(xiàn)硒顆粒在納米尺寸狀態(tài)下表現(xiàn)出較高的生物活性和較低的生物毒性。研究表明，粒徑<500 nm的紅色硒納米顆粒(Selenium nanoparticles, SeNPs)在生物傳感器[8]、納米醫(yī)學領域如抗菌[9]、抗氧化[10]、抑癌[11-12]等方面均表現(xiàn)出優(yōu)異特性。

目前，利用還原法制備SeNPs，其分散體系的選擇很大程度上決定了SeNPs的尺寸大小及穩(wěn)定性。蛋白質(zhì)(牛血清白蛋白)[13]、多糖(阿拉伯膠、海藻多糖)[14-15]等物質(zhì)可作為分散體系制備合適尺寸的SeNPs。而魚明膠作為不同水解程度的膠原蛋白混合物，不僅具有蛋白質(zhì)作為制備SeNPs分散體系所需特性，還具有優(yōu)異的凝膠性、穩(wěn)定性、成膜性等加工特性。試驗擬選用魚明膠作為分散體系，利用還原法制備SeNPs，并采取動態(tài)光散射法、掃描電鏡等手段探究SeNPs粒徑大小、形貌特征，抗氧化活性以及消化穩(wěn)定性，以期為SeNPs制備提供新的分散體系，為其產(chǎn)業(yè)化以及應用提供技術和理論指導依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

抗壞血酸(VC)、亞硒酸、DPPH、ABTS：分析純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；

透析袋(3 000 Da)、鄰苯三酚、Tris-HCl、EDTA-Na2：分析純，北京索萊寶科技有限公司；

魚明膠：美國Sigma公司。

1.1.2 主要儀器設備

酶標儀：Synergy H1型，美國伯騰儀器有限公司；

粒度儀：Nano ZS90型，英國馬爾文儀器有限公司；

掃描電鏡： Regulus8100型，日本日立公司；

凍干機：LGJ-1D-80型，北京亞泰科技儀器技術有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 納米硒制備 分別向魚明膠水溶液加入0.5，1.0，1.5，2.0 mL濃度為0.2 mol/L的亞硒酸溶液，混勻，加入3倍于亞硒酸體積的0.2 mol/L VC溶液，用蒸餾水定容至8 mL，混勻，使魚明膠分散體系濃度分別為2.000%，1.000%，0.500%，0.125%，常溫反應2 h，透析袋透析72 h，冷凍干燥，備用。

1.2.2 SeNPs粒徑測定及形貌表征

(1) 粒徑測定：將凍干后的SeNPs配置成30 mg/mL溶液，利用超聲波使其充分溶解后備用。取5 μL溶液，稀釋10 000倍后測定。掃描次數(shù)3次，單次掃描時間13 s，單次掃描重復15次。

(2) 形貌表征：取5 μL質(zhì)量分數(shù)為30 mg/mL的SeNPs溶液稀釋20 000倍，取10 μL稀釋液滴于潔凈的硅片上，自然干燥，噴金后置于掃描電鏡下進行形貌表征。加速電壓5 000 V，發(fā)射電流9.6 μA。

1.2.3 SeNPs體外抗氧化能力測定

(1) DPPH自由基清除能力：根據(jù)Xie等[16]的方法稍作修改。利用70%乙醇配制濃度為0.25 mmol/L的DPPH溶液，吸取DPPH溶液300 μL，分別加入30 mg/mL的SeNPs溶液0，5，10，15，20，25 μL，用蒸餾水定容至325 μL，于暗處反應30 min，離心，測定517 nm處吸光值。以VC、谷胱甘肽為陽性對照，亞硒酸為陰性對照。按式(1)計算DPPH自由基清除能力。

(1)

式中：

DC——DPPH自由基清除能力，%；

As——樣品與DPPH溶液混合后的吸光值；

AC——樣品與70%乙醇混合后的吸光值；

Ab——DPPH與水混合后的吸光值。

(2) ABTS自由基清除能力：根據(jù)鄭善元等[17]的方法稍作修改。配制7.4 mmol/L ABTS溶液以及2.6 mmol/L過硫酸鉀溶液，等比混合，室溫避光反應16 h，用70%乙醇溶液稀釋至734 nm處的吸光值為0.75左右，備用。吸取ABTS溶液300 μL，分別加入30 mg/mL的SeNPs溶液0，2，4，6，8，10 μL，用蒸餾水定容至310 μL，室溫反應10 min，測定734 nm處吸光值，按式(2)計算ABTS自由基清除能力。

(2)

式中：

AC——ABTS自由基清除能力，%；

A0——水取代樣品測得的吸光值；

As——樣品與ABTS溶液反應后的吸光值。

(3) 還原力：根據(jù)Yen等[18]的方法稍作修改。各取200 μL 1%鐵氰化鉀溶液和磷酸鹽緩沖溶液(0.2 mol/L，pH 6.6)于試管中，分別加入30 mg/mL的SeNPs溶液0，5，10，15，20，25 μL，用蒸餾水定容至425 μL，50 ℃水浴20 min，再加入10%三氯乙酸溶液200 μL，混勻，3 000 r/min離心5 min。吸取200 μL上清液，加入200 μL蒸餾水以及40 μL 0.1%三氯化鐵溶液，室溫反應2 min，測定700 nm處吸光值。

(4) 超氧陰離子清除能力：根據(jù)郭雪峰等[19]的方法稍作修改。取236 μL 0.1 mol/L Tris-HCl緩沖溶液(pH 8.5，含2 mmol/L EDTANa2)置于96孔板中，分別加入3 mg/mL的SeNPs溶液4 μL，混勻，再迅速加入10 μL 1.2 mmol/mL鄰苯三酚溶液(pH 2.4，1 mmol/L HCl 溶解)，使反應體系SeNPs濃度為48 μg/mL，持續(xù)測定319 nm處吸光值，每40 s測定一次，共10 min。以水為空白對照，VC、谷胱甘肽為陽性對照，亞硒酸為陰性對照。

1.2.4 消化穩(wěn)定性測定 以1.000%，0.500%，0.125%魚明膠分散體系制備的SeNPs為樣品，分別記為1，2，3，進行體外模擬消化。采用粒度儀測定其在胃腸模擬消化過程中的粒徑變化，其中胃消化用G表示，腸消化用I表示。G-0、G-1分別表示樣品模擬胃消化0，1 h；G+I-0、G+I-1、G+I-2分別表示經(jīng)胃消化1 h樣品模擬腸消化0，1，2 h。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理 結果以“平均值±標準偏差”表示，利用SPSS 21.0，Origin 9.0以及CS 5軟件對數(shù)據(jù)、圖像進行處理。

2 結果與分析

2.1 SeNPs粒徑及形貌分析

由表1可知，SeNPs在溶液中均具有較小的粒徑分布系數(shù)(PDI值，PDI<0.3)，即SeNPs在溶液中有較高的分散度[20]。隨著魚明膠濃度的升高或降低，SeNPs的平均粒徑均增大，但其平均粒徑始終<100 nm(處于77～90 nm)，說明魚明膠可作為SeNPs制備過程中良好的分散體系，使其在溶液中分散均勻。Zhang等[21]利用牛血清白蛋白(BSA)作為SeNPs分散體系，增加BSA的濃度在一定程度上有利于更小的硒顆粒的生成；Jia等[22]利用多糖提取物為分散體系制備SeNPs，發(fā)現(xiàn)硒顆粒粒徑大小會隨著多糖含量的增加而減小。此外，改變魚明膠濃度或亞硒酸濃度對SeNPs粒徑有一定影響，但其尺寸始終<500 nm，處于具有生物活性范圍內(nèi)。因此，利用魚明膠作為SeNPs制備過程中分散體系，具有較高的可操作性，其制備過程中，SeNPs粒徑大小受物料濃度影響小，可使得制備的SeNPs具有均一性、穩(wěn)定性。

表1 亞硒酸含量對魚明膠分散體體系的SeNPs粒徑分布的影響Table 1 Effects of selenite content on the size distribution of SeNPs in fish gelatin dispersion System

魚明膠分散體系制備的SeNPs在溶液中均呈透明穩(wěn)定的紅色膠體狀態(tài)，而不含魚明膠的分散體系的硒顆粒經(jīng)反應后快速團聚并沉淀于容器底部。由圖1可知，魚明膠分散體系制備的SeNPs均為大小均一的球形顆粒，且尺寸均為73 nm左右，說明魚明膠是良好的制備SeNPs的分散體系，可有效防止生成的SeNPs團聚沉淀，且制備的SeNPs均為球形，形貌、粒徑大小不受魚明膠體分散體系濃度影響。而此處測定SeNPs粒徑大小與動態(tài)光散射法測定SeNPs存在差異，可能是由于溶液中包裹SeNPs的魚明膠具有一定厚度，導致其整體粒徑測定值偏大。

2.2 SeNPs體外抗氧化能力

2.2.1 DPPH自由基清除能力 由圖2可知，SeNPs的DPPH自由基清除能力低于VC、谷胱甘肽等強還原劑，但仍表現(xiàn)出較強的DPPH自由基清除能力，而亞硒酸水溶液表現(xiàn)出較弱的DPPH自由基清除能力。不同濃度魚明膠分散體系制備的SeNPs溶液DPPH自由基清除能力表現(xiàn)出較大的差異(清除能力為1.000%魚明膠體系<0.500%魚明膠體系<0.125%魚明膠體系)，但其自由基清除能力均隨SeNPs溶液濃度的增高而增大。其中，1.000%，0.500%魚明膠分散體系的SeNPs自由基清除IC50值分別為1.846 0，0.923 0 mg/mL。當0.125%魚明膠分散體系制備的SeNPs溶液濃度為0.461 5 mg/mL時，DPPH自由基清除率達(58.316±0.323)%，說明SeNPs具有良好的DPPH自由基清除能力。不同濃度魚明膠分散體系制備的SeNPs溶液DPPH自由基清除能力可能與制備的SeNPs溶液中SeNPs絕對含量有關，反應體系魚明膠濃度越低，SeNPs絕對含量越高，DPPH自由基清除能力越強。

圖1 SeNPs的掃描電鏡圖Figure 1 SEM images of SeNPs

2.2.2 ABTS自由基清除能力 由圖3可知，亞硒酸、VC以及谷胱甘肽都具有極強的ABTS自由基清除能力。而不同濃度魚明膠體系制備的SeNPs也表現(xiàn)出較強的ABTS自由基清除能力，其清除能力為1.000%魚明膠體系<0.500%魚明膠體系<0.125%魚明膠體系，其中1.000%，

圖2 SeNPs的DPPH自由基清除能力Figure 2 DPPH clearance ability of SeNPs

圖3 SeNPs的ABTS自由基清除能力Figure 3 ABTS clearance ability of SeNPs

0.500%，0.125%魚明膠體系制備的SeNPs清除ABTS自由基IC50值分別為0.580 0，0.387 1，<0.193 5 mg/mL，說明SeNPs具有較強的ABTS自由基清除能力，且制備過程中魚明膠濃度越低其清除能力越強，與DPPH自由基清除能力結果一致。

2.2.3 還原力 由圖4可知，亞硒酸無還原能力，VC以及谷胱甘肽均具有強還原力，SeNPs具有較強的還原能力，且隨SeNPs濃度的增加而增大。其中0.125%魚明膠體系制備SeNPs的還原力顯著高于0.500%，1.000%魚明膠體系的。說明不同魚明膠體系制備的SeNPs還原力大小僅與溶液中SeNPs的絕對含量有關，反應體系魚明膠濃度越低，SeNPs絕對含量越高，其還原力越大。

圖4 SeNPs的還原力Figure 4 Reducing power of SeNPs

2.2.4 超氧陰離子清除能力 由圖5可知，當反應時間為2.5～9.5 min時，鄰苯三酚自氧化監(jiān)測曲線呈良好的線性關系，其曲線斜率代表了反應體系中鄰苯三酚自氧化速率，表明除VC具有一定羥基自由基清除能力外，其他樣品均能在一定程度上促進羥基自由基的產(chǎn)生。其中亞硒酸促進羥基自由基產(chǎn)生的程度顯著高于其他試驗組，3種體系制備的SeNPs促進羥基自由基產(chǎn)生的能力無顯著差異，但是體系中SeNPs含量越高，其自氧化速率越快。這可能是硒元素在體內(nèi)代謝過程中產(chǎn)生羥基自由基或其他形式的活性氧，從而對機體產(chǎn)生氧化損傷。綜上，SeNPs可促進羥基自由基的產(chǎn)生，加速鄰苯三酚自氧化速率，但SeNPs的促進程度又顯著低于亞硒酸，說明其生物毒性低于亞硒酸。

圖5 SeNPs的羥基自由基清除能力測定Figure 5 Determination of clearance ability of SeNPs

2.3 SeNPs消化穩(wěn)定性

由圖6可知，加入胃液后，SeNPs尺寸分布主要集中于220 nm以上，而其平均粒徑增加至850 nm左右；胃消化過程中，SeNPs尺寸繼續(xù)增加，而經(jīng)胃消化1 h后的硒顆粒溶液充分分散后，在模擬腸消化過程中，聚集的SeNPs又重新回到納米尺寸，均勻地分散于溶液中。此時，SeNPs粒徑尺寸分布主要集中于105 nm以下，平均粒徑<100 nm，且體系魚明膠含量越少， SeNPs平均粒徑越小。綜上，胃消化過程會使SeNPs聚集乃至形成沉淀，但該沉淀僅為簡單堆積，在腸消化過程中聚集狀態(tài)的SeNPs重新分散，擁有納米尺寸，表現(xiàn)出良好的消化穩(wěn)定性。研究[23-24]表明，腸黏膜只能阻斷>1 mm的顆粒，而納米硒顆粒可通過毛細血管深入組織。經(jīng)腸消化后SeNPs尺寸均<100 nm，說明SeNPs可能成為硒補充劑從而被機體消化吸收。

3 結論

采用魚明膠作為制備SeNPs的分散體系，并對其粒徑、形貌、抗氧化性、消化穩(wěn)定性進行研究。結果表明，魚明膠可作為SeNPs制備過程中良好的分散體系，制備出的SeNPs受物料分散體系濃度影響小，呈球形，且尺寸<100 nm，并具有優(yōu)異的體外抗氧化能力，且與SeNPs的絕對含量呈正比。此外，SeNPs在靜態(tài)模擬消化過程中表現(xiàn)出良好的消化穩(wěn)定性。但研究僅對SeNPs體外相關性質(zhì)進行了探索，后續(xù)可繼續(xù)采用細胞模型、動物模型開展SeNPs細胞抗氧化活性、細胞毒性、體內(nèi)吸收機制以及SeNPs生理活性相關研究，進一步為SeNPs可能成為新型硒補充劑提供理論指導和數(shù)據(jù)支撐。

圖6 SeNPs在模擬胃腸消化過程中的粒徑變化圖Figure 6 Changes in particle size of SeNPs during gastrointestinal digestion