姚東偉， 吳凌云， 田守波， 沈海斌， 李 明

(1.上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所， 上海 201403； 2.上?？屏⑻剞r(nóng)科(集團(tuán))有限公司， 上海 201106；3.上海市設(shè)施園藝技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 上海 201403)

作物生長過程中許多病害是由種子攜帶傳播的，播種前進(jìn)行種子消毒處理，是作物病害防治中最經(jīng)濟(jì)有效的方法,是確保作物正常生產(chǎn)的首要環(huán)節(jié)。目前生產(chǎn)上利用化學(xué)殺菌劑拌種、包衣是種子消毒處理的主要方式?；瘜W(xué)藥劑處理具有效果好，使用方便的優(yōu)點(diǎn)，但同時也存在一些不足之處，一是長期使用會使病蟲產(chǎn)生抗藥性，二是會污染環(huán)境，處理后的種子如果沒有種植，只能當(dāng)廢棄物處理，不能作為飼料重新利用。利用物理方法進(jìn)行種子消毒處理也是作物生產(chǎn)上的重要處理途徑，其中熱處理是主要方式，利用熱力及有效殺菌溫度與種子耐受溫度的差距來殺滅病菌，主要有熱水浸種、干熱、濕熱空氣處理方法[1]。

電磁種子處理技術(shù)是一項(xiàng)新興農(nóng)業(yè)技術(shù)，近40年來，對基于電磁生物學(xué)效應(yīng)的種子處理技術(shù)進(jìn)行了廣泛的研究，開發(fā)出了電場處理機(jī)、磁化機(jī)、等離子處理機(jī)等設(shè)備應(yīng)用于生產(chǎn)。張春慶等利用單向電暈場處理玉米、大豆、茄子、西瓜等種子后發(fā)現(xiàn)，電暈場處理能使種子發(fā)芽整齊，出苗迅速[2,3]；習(xí)崗等發(fā)現(xiàn)，極低頻高壓脈沖電場對玉米萌發(fā)有促進(jìn)作用[4]；尹美強(qiáng)發(fā)現(xiàn)磁化弧光等離子體對小麥、番茄、大豆3種作物具有明顯的刺激效應(yīng)，可以促進(jìn)種子發(fā)芽和幼苗生長。但此類處理方法殺菌作用較弱，盡管孤光等離子體環(huán)境中的臭氧、紫外光及其誘導(dǎo)產(chǎn)生的各種活性粒子對種子表面具有較強(qiáng)殺菌能力，但穿透性極低，殺菌作用有限[5]。

輻照處理技術(shù)在農(nóng)業(yè)上已廣泛應(yīng)用于誘變育種、昆蟲輻射不育、食品和農(nóng)產(chǎn)品加工等領(lǐng)域。通常使用60Co-γ和加速器產(chǎn)生3～10 MeV的電子束作為輻照源進(jìn)行種子處理，由于此類輻照源能量高，完全穿透整個種子，非常容易對種子胚造成傷害。電子束穿透深度與加速電子能級相關(guān)，電子簾加速器可以產(chǎn)生80～300 KeV的電子束，通過調(diào)節(jié)電子束能級可以精確控制電子束穿透深度，從而達(dá)到抑制種子表層病菌而不傷害胚的效果，可以進(jìn)行種子殺菌處理。德國Schmidt-Seeger AG公司于2000年研發(fā)出電子束處理機(jī)，并在谷類種子上廣泛應(yīng)用。

與溫燙浸種、干熱處理及常規(guī)的電磁種子處理相比，利用電子束輻照處理種子，具有抑菌效果好，處理速度快的優(yōu)點(diǎn)，國外已有在麥類作物上的應(yīng)用報(bào)道，掌握合適的穿透深度和劑量是電子束輻照處理成功的關(guān)鍵之一。本試驗(yàn)以西瓜雜交種子為材料，研究了電子束處理對西瓜種子發(fā)芽及出苗的影響，為進(jìn)一步應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試雜交一代西瓜品種8424、雷曉、美都、黑津由上海農(nóng)科種子種苗有限公司提供，含水量6%。種子板采用有機(jī)玻璃自制，每板大小為A 4大小，厚度3 mm，在板上按長11 mm 寬7 mm打橢圓形孔400個。種子萌發(fā)袋中號(18 cm×12.5 cm)購于北京啟維益成科技有限公司。

注：“*”表示與對照0 kGy輻照劑量處理差異達(dá)p<0.05顯著水平。

1.2 電子束輻照設(shè)備

Ebeam EBLab-200：制造商為瑞士康姆艾德集團(tuán)公司，能級在80～200 KeV之間，傳輸速度為3～30m·min-1，單通道最大劑量為450 kGy，樣品可輻照面積大小為A 4大小，最大輻照厚度為50 mm，輻照過程可提供充氮，氧氣濃度低于50 mg·L-1。

1.3 電子束處理

種子輻照前先進(jìn)行置種，在種子板下面墊1塊2 mm A 4有機(jī)板，用夾子將種子板固定，然后將西瓜種子擺放到孔內(nèi)，利用Ebeam EBLab-200設(shè)備進(jìn)行輻照處理，設(shè)置輻照電壓、表面劑量、間隙距離后開始輻照，一面輻照完成后上面再蓋一塊2 mm A 4有機(jī)板，翻轉(zhuǎn)后用夾子固定進(jìn)行另一面輻照，雙面輻照完成后取出種子裝入密封袋保存待用。8424西瓜種子輻照電壓為200 KeV，雷曉、美都、黑津西瓜種子輻照電壓為100 KeV。

1.4 種子引發(fā)

按種子干重、蛭石干重與蒸餾水比例為1∶1.5∶2混合后置于15 ℃、黑暗條件下處理6 d。引發(fā)結(jié)束后，用不同規(guī)格的細(xì)篩將種子篩出，均勻攤開，移入鼓風(fēng)干燥箱中，在(25±2)℃下干燥至引發(fā)前種子的含水量為止。

1.5 種子發(fā)芽試驗(yàn)

發(fā)芽在光照培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行，溫度25 ℃，光照12 h，光強(qiáng)4 000 lx，相對濕度70%。發(fā)芽采用基質(zhì)發(fā)芽方法，將對照(未經(jīng)輻照處理)和各輻照處理放入發(fā)芽盒(13 cm×19 cm×16 cm)內(nèi)，盒內(nèi)裝有含水量30%的蛭石，種子上覆蓋2 cm厚的蛭石，每盒50粒種子，3次重復(fù)。以子葉破土為發(fā)芽標(biāo)準(zhǔn)，5日統(tǒng)計(jì)發(fā)芽勢，10日統(tǒng)計(jì)發(fā)芽率。

發(fā)芽率(%)=(正常幼苗數(shù)/供試種子總粒數(shù))×100%。

1.6 種子發(fā)芽袋發(fā)芽

種子處理后干燥密封貯藏，7 d后進(jìn)行發(fā)芽試驗(yàn)。發(fā)芽在光照培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行，溫度25 ℃，光照12 h，光強(qiáng)4 000 lx，相對濕度70%。發(fā)芽采用種子發(fā)芽萌發(fā)袋方法，將對照(未經(jīng)輻照處理)和各輻照處理種放入萌發(fā)袋內(nèi)，每袋10粒種子，發(fā)芽口向下，每袋加水40 mL，3次重復(fù)。6日統(tǒng)計(jì)根長及芽長。

1.7 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Microsoft Execl軟件繪圖，采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析和Tukey多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同輻照劑量對8424西瓜種子發(fā)芽的影響

由圖1可知，200 KeV輻照電壓下，當(dāng)輻照劑量大于30 kGy， 8424西瓜種子發(fā)芽勢隨著劑量的增加呈下降趨勢，輻照劑量為55 kGy和60 kGy兩個處理的發(fā)芽勢與對照差異達(dá)到顯著水平；當(dāng)輻照劑量大于15 kGy時，8424西瓜種子發(fā)芽率低于對照，但各處理間差異不顯著。結(jié)果表明，電子束輻照對西瓜種子發(fā)芽的影響存在臨界值，過高的劑量會降低種子發(fā)芽勢。

2.2 輻照及引發(fā)對西瓜種子發(fā)芽的影響

由圖2可知，與對照相比，輻照處理均降低了8424西瓜種子的根長和芽長，且隨著輻照劑量的增加，降低程度加劇。其中，30 kGy輻照處理的根長和芽長分別降低了11.72%、22.25%；40 kGy輻照處理的根長和芽長分別降低了27.25%、24.42%；50 kGy輻照處理的根長和芽長分別降低了41.38%、40.30%。西瓜種子引發(fā)處理的根長和芽長最高，分別比對照提高了77%、62.82%。

與僅引發(fā)處理相比，輻照+引發(fā)處理降低了西瓜種子根長，但仍顯著高于對照。與對照相比，F(xiàn)Y 30、FY 40、FY 50三個處理的根長分別提高了61.22%、42.84%、25.93%；FY 30、FY 40兩個處理的芽長分別提高了43.42%、11.67%；FY 50處理的西瓜種子芽長比對照降低了17.23%。說明引發(fā)處理可以緩解輻照處理對種子的負(fù)面效應(yīng)，引發(fā)緩解效果隨著輻照劑量的增大而減少，當(dāng)輻照劑量到達(dá)50 kGy時，引發(fā)處理不能完全緩解輻照損傷。

表1 輻照對不同品種西瓜種子發(fā)芽的影響

品種處理劑量/kGy根數(shù)/個平均根長/cm芽數(shù)/個平均芽長/cmck0398.70±0.36c374.17±0.25dT110408.87±0.15bc384.17±0.15d美都T215409.33±0.25b384.77±0.15cT3204010.23±0.45a395.76±0.15bT4254010.37±0.25a396.33±0.25ack03310.5±0.40d304.20±0.20cT1103411.33±0.32c324.20±0.30c雷曉T2153512.13±0.42b334.80±0.20bT3203612.57±0.31b355.13±0.15abT4253613.43±0.15a355.43±0.15ack0257.77±0.25d217.23±0.15cT110267.70±0.26d227.27±0.25c黑津T215268.23±0.15c247.93±0.15bT320278.87±0.15b258.23±0.25bT425289.57±0.31a248.77±0.45a

注：表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，同列數(shù)據(jù)后標(biāo)不同小寫字母表示差異達(dá)p<0.05 顯著水平；輻照電壓為100 KeV。

注：ck，Yck分別表示未經(jīng)任何處理和引發(fā)處理；F 30，F(xiàn) 40，F(xiàn) 50分別表示輻照電壓200 KeV下， 30 kGy、40 kGy、50 kGy輻照劑量處理；FY 30、FY 40、FY 50分別表示相應(yīng)劑量輻照后再進(jìn)行引發(fā)處理；不同小寫字母表示處理間達(dá)p<0.05顯著水平。

2.3 輻照對不同品種西瓜種子發(fā)芽的影響

由表1可知，輻照電壓100 KeV下，不同劑量輻照處理對美都、雷曉、黑津3個西瓜品種種子根長和芽長的變化趨勢一致，表現(xiàn)為隨劑量增加，根長芽長逐漸升高，輻照劑量25 kGy處理的西瓜種子根長和芽長最大。對于美都西瓜品種，與對照相比，T 2、T 3、T 4輻照處理種子根長分別提高了7.24%、17.59%、19.19%；芽長分別提高了14.39%、38.13%、51.79%；對于雷曉西瓜品種，與對照相比，T 2、T 3、T 4輻照處理種子根長分別提高了15.52%、19.71%、27.90%；芽長分別提高了14.29%、22.14%、29.29%；對于黑津西瓜品種，與對照相比，T 2、T 3、T 4輻照處理種子根長分別提高了5.92%、14.16%、23.17%；芽長分別提高了9.68%、13.83%、21.30%。

3 結(jié)論與討論

種子本身結(jié)構(gòu)具有一定的保護(hù)性能，病原菌可能在種子成熟期間由母株感染或收割加工過程中侵染種子，許多病原菌隱藏于種子組織，特別是外面幾層(果皮和種皮)中，能侵染種子內(nèi)層胚組織的病原菌較少，因此殺滅外層病原菌是種子處理的重點(diǎn)[6]。輻照處理具有處理快速、安全有效、綠色環(huán)保、不受溫度限制等優(yōu)點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于食品殺蟲滅菌[7]。植物種子為活體細(xì)胞，使用穿透力極強(qiáng)的輻照很容易對種子造成損害，小麥種子經(jīng)過2 400～3 000 Gy輻照后，發(fā)芽率為零[8]；輻照強(qiáng)度8～10 KGy可以完全殺滅西瓜果斑病菌，但對種子發(fā)芽有顯著抑制作用[9]；60Coγ射線輻射對西瓜種子發(fā)芽有抑制作用，抑制效應(yīng)隨著輻射劑量的增大而增強(qiáng)[10]。本研究利用能級在80～200 KeV間的Ebeam設(shè)備處理西瓜種子，電子束穿透深度與電壓相關(guān)，以穿透水為例，輻照能級為100 KeV，穿透深度約95μm，輻照能級為150 KeV，穿透深度約240μm，輻照能級為200 KeV，穿透深度約380μm。西瓜種子種皮厚度為200～380μm，平均厚度260μm[11]。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在設(shè)備最大電壓200 KeV下，60 KGy輻照劑量對8424西瓜種子發(fā)芽率沒有顯著性影響，超過30 KGy輻照延緩了8424西瓜種子發(fā)芽。輻照劑量30 KGy可以殺滅包括芽孢體的大部分真菌及細(xì)菌，通過檢測輻照前后西瓜種子自帶菌變化，電壓170 KeV劑量30 KGy輻照后8424西瓜種子無菌檢出(數(shù)據(jù)沒有給出)。因此輻照劑量小于30 KGy，可以有效抑制種子表面病菌且不影響種子發(fā)芽。

一定劑量范圍內(nèi)的輻射對種子的發(fā)芽有促進(jìn)作用，當(dāng)超過一定值后會使種子胚組織受到損傷，影響細(xì)胞生長和分裂[12-14]。楊世梅利用60Co-γ射線輻射西瓜種子發(fā)現(xiàn)各西瓜品種在低劑量(50～350 Gy)輻照后顯著促進(jìn)幼苗鮮重增加，高劑量(500～650 Gy)顯著抑制鮮重增加[10]。本試驗(yàn)中，輻照電壓100 KeV，劑量15～25 kGy的處理提高了美都、雷曉、黑津3個西瓜品種種子根長和芽長，這與前人研究結(jié)果相似，說明合適的劑量可以促進(jìn)西瓜種子發(fā)芽。

DNA是細(xì)胞增殖、遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ)，是引起細(xì)胞生化、生理改變的關(guān)鍵性物質(zhì)，DNA損傷在細(xì)胞輻射損傷中起重要作用。γ射線輻射和電子束輻射對生物體的影響主要是間接作用，通過作用水分子產(chǎn)生活性很高的自由基進(jìn)而損傷DNA，導(dǎo)致分子結(jié)構(gòu)發(fā)生堿基變化、DNA鏈斷裂和交聯(lián)等[15]。被損傷的生物分子可以通過各種方式進(jìn)行修復(fù)，種子引發(fā)可以促進(jìn)萌發(fā)代謝，加速萌發(fā)與出苗，引發(fā)期間許多發(fā)生在吸水階段Ⅱ的萌發(fā)代謝如DNA和線粒體修復(fù)、殘留mRNA的降解、新蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)錄和翻譯可以繼續(xù)進(jìn)行[16]。本試驗(yàn)中， 8424西瓜種子在萌發(fā)6 d，引發(fā)處理種子根長芽長最大，30～50 kGy的輻照處理根長芽長低于對照，說明該輻照劑量造成了種子輻照損傷；30 kGy和40 kGy輻照處理結(jié)合引發(fā)處理的根長芽長高于對照，低于引發(fā)處理，說明該劑量輻照損傷可以通過引發(fā)技術(shù)修復(fù)；50 kGy輻照處理結(jié)合引發(fā)處理的芽長低于對照，說明該劑量輻照損傷已不能通過引發(fā)技術(shù)完全修復(fù)。

利用電子簾加速器產(chǎn)生的電子束輻照西瓜種子，在合適的電壓和劑量下，可以殺滅種子表面病菌，且可以促進(jìn)種子發(fā)芽，輻照結(jié)合引發(fā)處理可以在減少種帶病菌的同時，提高種子發(fā)芽勢，是一種具有應(yīng)用前景的綠色環(huán)保種子處理技術(shù)。電子束輻照對西瓜種子的抑菌效果有待深入研究，種子表面接受均勻、全面的電子束劑量是輻照處理應(yīng)用的關(guān)鍵技術(shù)，合適的輻照方式及工藝還有待進(jìn)一步深入研究。