付海洋 時(shí)維平 付廣明 張蓓 史海磊 李雪健

[摘要] 目的 測(cè)定慢性乙型肝炎（CHB）患者肝纖維化進(jìn)展過(guò)程中外周血中Th17細(xì)胞和Treg細(xì)胞的頻率及相關(guān)細(xì)胞因子的變化，以及肝組織中Th17細(xì)胞和Treg細(xì)胞數(shù)目的變化，探討Th17/Treg平衡在纖維化進(jìn)展中的作用。方法 方便選取2017年6—12月青島大學(xué)附屬醫(yī)院慢性乙型肝炎住院患者51例，其中F1期CHB患者（F1）5例，F(xiàn)2期CHB患者（F2）10例，F(xiàn)3期CHB患者（F3）15例，F(xiàn)4期CHB患者（F4）21例，同時(shí)選取10位健康體檢者作為對(duì)照（HC），流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)外周血中Th17和Treg的頻數(shù)，雙抗體夾心ELISA檢測(cè)血清中IL-17和IL-10的表達(dá)水平，免疫組化檢測(cè)CHB患者肝組織中Th17和Treg數(shù)量。 結(jié)果 在外周血中， Th17/Treg細(xì)胞頻率比值在F2組（0.76±0.37）和F4組（2.23±0.67）中與HC組（1.33±0.67）相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[P（HCvsF2）=0.022，P（HCvsF4）<0.001]，IL-17/IL-10比值在F2組（0.11±0.19）、F3組（0.12±0.32）和F4組（0.12±0.32）中與HC組（0.72±0.22）相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[P（HCvsF2）=0.008，P（HCvsF3）=0.001，P（HCvsF4）<0.001]，肝組織中，Th17/Treg比值在F3組（1.07±0.86）和F4組（0.79±0.28）中與F1組（2.08±1.06）相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[P（F1vsF3）=0.008， P（F1vsF4）=0.001]，F(xiàn)2組（1.51±0.77）和F4組（0.79±0.28）相比，Th17/Treg值變化差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[P（F2vsF4）=0.011]。 結(jié)論 Th17/Treg的失衡是造成慢性乙型肝炎肝纖維化進(jìn)程演變的重要因素，檢測(cè)Th17/Treg變化對(duì)預(yù)測(cè)肝纖維化發(fā)展有一定價(jià)值。

[關(guān)鍵詞] 慢性乙型肝炎;Th17細(xì)胞;調(diào)節(jié)性T細(xì)胞;IL-17;IL-10;肝纖維化

[Abstract] Objective To determine the frequency of Th17 cells and Treg cells in peripheral blood and the changes of related cytokines and the number of Th17 cells and Treg cells in liver tissue during the progression of liver fibrosis in patients with chronic hepatitis B （CHB）. Role of Th17 / Treg balance in fibrosis progression was explored. Methods A total of 51 hospitalized patients with chronic hepatitis B from the affiliated hospital of Qingdao University from June 2017 to December 2017 were convenient selected， including 5 patients with stage F1 CHB （F1）， 10 patients with stage F2 （F2）， and 15 patients with stage F3 （F3）; 21 cases of F4 stage CHB patients （F4）， 10 healthy subjects were selected as controls （HC）， the frequency of Th17 and Treg in peripheral blood was detected by flow cytometry， and the serum IL was detected by double antibody sandwich ELISA expression levels of IL-17 and IL-10 were detected by immunohistochemistry in the amount of Th17 and Treg in liver tissue of patients with CHB. Results In peripheral blood， the ratio of Th17 / Treg cell frequency in the F2 group （0.76±0.37） and the F4 group （2.23±0.67） was significantly different from that in the HC group （1.33±0.67）[P（HCvsF2） = 0.022， P（HCvsF4）<0.001]， the ratio of IL-17/IL-10 in the F2 group （0.11±0.19）， F3 group （0.12±0.32） and F4 group （0.12±0.32） compared with the HC group （0.72±0.22）， the difference was statistically significant[P（HCvsF2） = 0.008， P（HCvsF3） = 0.001， P（HCvsF4）<0.001]， Th17 / Treg ratio in liver tissues was in F3 group （1.07±0.86） and F4 group （0.79±0.28）， compared with the F1 group （2.08±1.06）， the difference is statistically significant[P（F1vsF3） = 0.008， P （F1vsF4） = 0.001]， compared with the F2 group （1.51±0.77） and the F4 group （0.79±0.28）. The difference in Th17 / Treg values was statistically significant[P （F2vsF4）=0.011]. Conclusion The imbalance of Th17 / Treg is an important factor in the evolution of liver fibrosis in chronic hepatitis B. Detection of changes in Th17 / Treg is of certain value in predicting the development of liver fibrosis.

[Key words] Chronic hepatitis B; Th17 cells; Regulatory T cells; IL-17; IL-10; Liver fibrosis

慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B，CHB）是由乙型肝炎病毒感染引起的復(fù)雜的肝臟免疫性疾病。我國(guó)作為乙型肝炎高發(fā)國(guó)家，CHB患者約有2 300萬(wàn)，病毒攜帶者數(shù)量高達(dá)1.3億，每年約有50萬(wàn)以上死于乙肝引起的肝硬化、肝癌。HBV病毒在體內(nèi)導(dǎo)致的肝纖維化是多種慢性肝病的病變基礎(chǔ)，隨著纖維化的進(jìn)展易發(fā)展成肝硬化，具有很高的病死率，嚴(yán)重威脅患者的生命健康，因此早期診斷及治療具有重要意義[1]。乙肝病毒在體內(nèi)難以清除，關(guān)鍵在于免疫應(yīng)答不利，近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，輔助性T細(xì)胞17（T helper cells 17，Th17）與調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（regulatory T cells，Treg）同屬CD4+T細(xì)胞的兩組新亞群，它們?cè)诰S持機(jī)體免疫平衡及自身耐受中具有重要的作用[2]。為此，該研究以CHB患者為研究對(duì)象，方便選取2017年6—12月青島大學(xué)附屬醫(yī)院慢性乙型肝炎住院患者51例，檢測(cè)CHB患者肝纖維化進(jìn)展過(guò)程中外周血中Th17與Treg細(xì)胞頻率及相關(guān)細(xì)胞因子水平的變化，以及肝組織中Th17與Treg細(xì)胞的數(shù)目，并選取10例健康者作為對(duì)照，分析Th17/Treg細(xì)胞的失衡與肝纖維化發(fā)生發(fā)展的相關(guān)性，并探討其意義，現(xiàn)報(bào)道如下。

1? 對(duì)象與方法

1.1? 研究對(duì)象

方便選擇青島大學(xué)附屬醫(yī)院消化內(nèi)科及肝臟科CHB住院患者51例，男34例，女17例，其中F1期CHB患者（F1）5例，F(xiàn)2期CHB患者（F2）10例，F(xiàn)3期CHB患者（F3）15例，F(xiàn)4期CHB患者（F4）21例。慢性乙型肝炎性肝纖維化程度分級(jí)、分期標(biāo)準(zhǔn)參照2015年中華醫(yī)學(xué)會(huì)肝病學(xué)分會(huì)與感染病分會(huì)聯(lián)合修訂的《慢性乙型肝炎防治指南》，同時(shí)選取10位健康體檢者作為對(duì)照組（healthy controls，HC），年齡25～46歲（平均年齡44.2歲），無(wú)相關(guān)免疫性疾病、腫瘤或近期感染。組間性別、年齡比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。該研究經(jīng)醫(yī)院倫理學(xué)委員會(huì)批準(zhǔn)，患者、體檢者均知情同意。

該研究所用的主要試劑和儀器如下：PMA購(gòu)自Sigma公司，Ionomycin購(gòu)自Veasen公司，1640培養(yǎng)基購(gòu)自Hyclone公司，Human Th17/Treg Phenotyping Kit試劑盒購(gòu)自BD 公司， 人白介素17 酶聯(lián)免疫試劑盒和人白介素10 酶聯(lián)免疫試劑盒購(gòu)自博凌科為公司，免疫組化一抗IL-17和Foxp3購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司，蘇木素、伊紅、Masson三色試劑購(gòu)自珠海貝索生物技術(shù)有限公司。EVOLIS全自動(dòng)酶標(biāo)儀為Bio-Rad公司產(chǎn)品，F(xiàn)ACSCanto plus流式細(xì)胞儀為BD？Biosciences公司產(chǎn)品。

1.2? 方法

1.2.1? 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Th17和Treg細(xì)胞的頻率? 采集每組實(shí)驗(yàn)者清晨空腹靜脈血2 mL，于EDTA抗凝管中并編號(hào)，加入等體積生理鹽水混勻，用滴管向底部緩緩加入1/3體積的Ficoll分離液，500 g離心力離心20 min，升7降3，吸取PBMC層，加入2 mL PBS，500 g離心力離心5 min，洗滌兩遍。1640完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞備用。每個(gè)樣本取1×106個(gè)細(xì)胞，用200 μL含刺激劑的培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，37℃，5%CO2培養(yǎng)5 h。250 g離心力離心5 min后收集細(xì)胞，加入2 mL Buffer A固定細(xì)胞，室溫避光孵育20 min。500 g離心力離心5 min，棄上清，加入2 mL Stain buffer重懸細(xì)胞，500 g離心力離心5 min，棄上清。每管加入500 μL 1×Buffer C固定破膜液，室溫避光孵育30 min。每管加入2 mL Stain buffer，500 g離心力離心5 min。重復(fù)此步驟1次。100 μL Stain buffer重懸細(xì)胞，按20 μL/test加入抗體，室溫避光孵育40 min。每管加入2 mL Stain buffer，500 g離心力離心5 min。重復(fù)此步驟一次。棄上清，加入300 μL Stain buffer重懸后，上機(jī)檢測(cè)。

1.2.2? ELISA檢測(cè)血清IL-17和IL-10水平? 采集每組實(shí)驗(yàn)者清晨空腹外周血5 mL，3 000 r/min離心3 min后分離血清儲(chǔ)存于-80℃冰箱備用。收集全部標(biāo)本后，取上述血清標(biāo)本室溫凍融后采用雙抗體夾心ELISA測(cè)定IL-17和IL-10水平，操作遵循試劑盒說(shuō)明，在酶標(biāo)儀450 nm處讀取吸光度（A）值。

1.2.3? 免疫組化檢測(cè)CHB患者肝組織中Th17和Treg細(xì)胞? 采集CHB患者肝穿刺或手術(shù)標(biāo)本，常規(guī)10%中性福爾馬林固定，組織脫水透明包埋成組織塊，收集全部標(biāo)本后，石蠟切片4 μm，用粘附載玻片撈片，60℃烤片2 h后，切片脫蠟至水，蒸餾水水洗2×2 min，PBS 3×2 min，高壓修復(fù)2 min，蒸餾水水洗2×2 min，PBS 3×3 min，3%過(guò)氧化氫10 min，PBS 3×3 min，加一抗室溫孵育1 h，PBS 4×3 min，加二抗室溫孵育30 min，PBS 4×3 min，加DAB顯色液1～2 min，蘇木素復(fù)染，晾干封片。由兩名資深病理診斷醫(yī)師對(duì)每個(gè)切片中6個(gè)匯管區(qū)的細(xì)胞計(jì)數(shù)總和除以6，得到的平均數(shù)作為各個(gè)標(biāo)本中Th17和Treg細(xì)胞的數(shù)目。

1.3? 統(tǒng)計(jì)方法

數(shù)據(jù)資料經(jīng)過(guò)整理后導(dǎo)入SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以（x±s）表示，進(jìn)行t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2? 結(jié)果

2.1? 各組被檢測(cè)者外周血中Th17細(xì)胞和Treg細(xì)胞頻率情況

與HC組相比，F(xiàn)3組和F4組患者外周血Th17細(xì)胞頻率明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。與HC組相比，F(xiàn)2組、F3組和F4組Treg細(xì)胞頻率升高差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。與HC組相比，F(xiàn)2、F4組Th17/Treg值變化差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見(jiàn)表1。

2.2? 各組被檢測(cè)者外周血中IL-17和IL-10細(xì)胞因子情況

與HC組相比，4組IL-17水平、IL-10水平明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。與HC組相比，F(xiàn)2、F3、F4組IL-17/IL-10值顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見(jiàn)表2。

2.3? 各組CHB被檢測(cè)者肝組織中Th17及Treg細(xì)胞數(shù)目檢測(cè)結(jié)果

與F1組相比，其余3組Th17細(xì)胞和Treg細(xì)胞數(shù)目升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。與F1組和F2組相比，F(xiàn)3組和F4組Th17/Treg值降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見(jiàn)表3。

HBV感染導(dǎo)致的相關(guān)肝病具有發(fā)病率高、難治愈等特點(diǎn)，嚴(yán)重威脅人類(lèi)的健康。對(duì)于慢性肝病，肝纖維化是其發(fā)展過(guò)程中的重要階段，也是造成肝臟不可逆性損害的重要因素[1]。目前對(duì)于HBV感染導(dǎo)致的肝臟功能紊亂的機(jī)制尚不明確，近年來(lái)的研究表明，HBV感染引起的相關(guān)肝病免疫系統(tǒng)失衡與Th17和Treg細(xì)胞有關(guān)系，二者失衡可引起免疫系統(tǒng)的功能紊亂[2]，主要表現(xiàn)為相關(guān)細(xì)胞因子和細(xì)胞數(shù)量的失衡[3]

該實(shí)驗(yàn)顯示，CHB患者外周血中Th17和Treg細(xì)胞頻率與HC組相比，均表現(xiàn)為升高的趨勢(shì)，但兩者升高的幅度并不相同，說(shuō)明在HBV患者中存在Th17和Treg細(xì)胞的失衡，具體表現(xiàn)為F1、F2反應(yīng)初期，以Treg細(xì)胞升高為主，其與Th17細(xì)胞的比值呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，根據(jù)本文數(shù)據(jù)表明在反應(yīng)初期階段，HBV刺激機(jī)體使Th17細(xì)胞大量分化，產(chǎn)生炎性刺激反應(yīng)后又促使Treg細(xì)胞的分化，而Treg細(xì)胞具有負(fù)向調(diào)控功能，會(huì)導(dǎo)致機(jī)體清除HBV能力下降，使炎癥呈現(xiàn)慢性發(fā)展[4]，因此在F3、F4期，Th17細(xì)胞升高幅度較Treg細(xì)胞顯著，表現(xiàn)為對(duì)機(jī)體產(chǎn)生持續(xù)性的炎性刺激，與Treg的比值呈上升趨勢(shì)，加重機(jī)體纖維化的發(fā)展。在CHB患者中，Th17與Treg細(xì)胞頻率的比值大致呈升高趨勢(shì)，說(shuō)明在HBV感染過(guò)程中，與Treg細(xì)胞相比，Th17細(xì)胞的分化占據(jù)優(yōu)勢(shì)地位，使機(jī)體保持炎性刺激，而Treg的活化使反應(yīng)慢性化，加重纖維化的進(jìn)程，顧娜等人[5]通過(guò)研究，將乙肝纖維化患者分為輕中重度3組并檢測(cè)其外周血中Th17/Treg比值，結(jié)果顯示隨著乙肝纖維化病情的加重，Th17細(xì)胞與Treg細(xì)胞的表達(dá)率呈上升趨勢(shì)，且其比值與輕度組（1.26±0.32）相比，中度組（1.52±0.41）及重度組（1.76±0.49）患者的Th17/Treg比值呈上升趨勢(shì)，與該文結(jié)果相同。CHB患者外周血中IL-17及IL-10細(xì)胞因子與HC組相比，均呈升高趨勢(shì)，而兩者的比值與HC組相比呈下降趨勢(shì)，但在CHB患者中，其比值呈上升趨勢(shì)，說(shuō)明機(jī)體受HBV刺激后產(chǎn)生大量細(xì)胞因子來(lái)抑制感染，但兩者升高的幅度也存在差異，具體表現(xiàn)為T(mén)h17細(xì)胞相關(guān)因子IL-17的表達(dá)水平強(qiáng)于IL-10的表達(dá)水平，IL-17的高表達(dá)可以通過(guò)激活肝星狀細(xì)胞加重肝炎的發(fā)展，而IL-10的抑制性負(fù)反饋調(diào)節(jié)使HBV清除能力下降，導(dǎo)致病變遷延不愈，進(jìn)一步肝纖維化的進(jìn)程[6]，徐笛[7]等通過(guò)對(duì)健康者和HBV患者進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，IL-17和IL-10的表達(dá)隨著纖維化的進(jìn)展，兩者表達(dá)水平均升高，IL-17和IL-10的比值呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，與該文結(jié)果一致。樊海燕等[8]將乙肝患者分為HBV攜帶者、急性乙肝和慢性乙肝進(jìn)行監(jiān)測(cè)外周血中Th17/Treg比值，結(jié)果顯示3組Th17細(xì)胞升高幅度較Treg細(xì)胞均為明顯，進(jìn)一步說(shuō)明，Th17和Treg平衡打破后，機(jī)體的炎癥反應(yīng)呈現(xiàn)慢性化發(fā)展，使肝炎癥加重，促進(jìn)肝纖維化發(fā)展。

然而，Th17/Treg平衡的改變不僅體現(xiàn)在CHB患者外周血中，還體現(xiàn)在肝組織中，且與肝臟組織的免疫炎性應(yīng)答密切相關(guān)。該實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在肝臟組織中，Th17和Treg細(xì)胞活化程度與外周血中不相同，肝組織中Th17和Treg細(xì)胞均呈升高趨勢(shì)，說(shuō)明肝臟啟動(dòng)免疫應(yīng)答來(lái)應(yīng)對(duì)HBV的感染，在初期Th17細(xì)胞活化并對(duì)肝臟進(jìn)行炎性損傷時(shí)，Th17細(xì)胞活化分泌IL-17介導(dǎo)炎性反應(yīng)，引發(fā)免疫應(yīng)答來(lái)抑制炎性損傷，繼而刺激肝臟中Treg細(xì)胞的活化，其分泌的高水平TGF-β1會(huì)抑制Th17細(xì)胞分化[9]，控制炎癥發(fā)展[10]并促進(jìn)Treg細(xì)胞的產(chǎn)生，表現(xiàn)為T(mén)reg細(xì)胞升高明顯，因此肝臟中Th17細(xì)胞活化水平不及Treg細(xì)胞，Th17/Treg比值呈下降趨勢(shì)，結(jié)果是肝臟長(zhǎng)期處于慢性免疫炎性應(yīng)答狀態(tài)，加重纖維化的發(fā)展[11]，而血液中Th17和Treg細(xì)胞的監(jiān)測(cè)可能會(huì)有一些不確定的因素，導(dǎo)致與肝臟中的比值變化表現(xiàn)不一致。馬海霞[12]通過(guò)研究乙肝纖維化患者肝臟組織F1、F2和F3期的Treg/ Th17比值，結(jié)果顯示肝組織內(nèi)Th17和Treg細(xì)胞均呈上升趨勢(shì)，而Treg/Th17細(xì)胞比值呈上升趨勢(shì)，F(xiàn)1期為（0.48±0.05），F(xiàn)2期為（0.85±0.15），F(xiàn)3期為（1.09±0.03），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均 P<0.001），從其F1、F2、F3期肝臟組織檢測(cè)結(jié)果看Th17/Treg比值變化與該文趨勢(shì)相一致[（2.08±1.06），（1.51±0.77），（1.07±0.86）]，呈降低趨勢(shì)，然而未檢測(cè)相對(duì)應(yīng)的血液中數(shù)值變化，但認(rèn)為HBV是嗜肝細(xì)胞性病毒，外周血中Th17和Treg 細(xì)胞水平變化與肝臟中相比可能存在差異，而該文結(jié)果顯示肝臟和血液中Th17和Treg表達(dá)雖然均升高，但Th17/Treg比值與血液中比值變化存在一定的差異，推測(cè)肝臟中和血液中的可能存在一些因素影響兩者的比值變化。

綜上所述，從該實(shí)驗(yàn)中可以看出外周血及肝組織中Th17/Treg失衡可以影響HBV感染導(dǎo)致的肝纖維化的進(jìn)程，而且肝臟中的Th17/Treg比值與血液中比值變化存在一定的差異，但其比率變化在一定程度上可以反映HBV感染肝纖維化的進(jìn)展程度，對(duì)于臨床干預(yù)及治療具有重要指導(dǎo)意義。

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（收稿日期：2019-12-13）