胡凱，楊輝，晁園，謝昕，俞卉，耿紅，甄輝

浙江省醫(yī)療器械審評中心，杭州市，311121

0 引言

醫(yī)療器械產(chǎn)品適用的滅菌技術(shù)，是基于多種因素的權(quán)衡。在選擇最合適的滅菌方法時，應(yīng)考慮到典型的微生物污染和材料對熱、化學(xué)和輻射處理的穩(wěn)定性以及產(chǎn)品狀態(tài)（液體、半固體或固體）。但無論使用何種技術(shù)，都必須滿足各國對無菌保障水平的法律法規(guī)和強(qiáng)制性標(biāo)準(zhǔn)要求（如《中國藥典》，滅菌處理應(yīng)在使用前確保SAL-6水平）。

根據(jù)作者單位牽頭承擔(dān)的《無菌醫(yī)療器械滅菌工藝注冊技術(shù)審查指導(dǎo)原則（征求意見稿）》工作，常用的醫(yī)療器械滅菌工藝主要有濕熱、干熱、環(huán)氧乙烷（下文簡稱EtO）、輻射。征求稿中對這幾種滅菌方法的特點(diǎn)進(jìn)行了論述。

濕熱滅菌通常需要在121oC下運(yùn)行15～30 min才能殺死抗藥性細(xì)菌，因此不能將其應(yīng)用于對溫度和濕度敏感的產(chǎn)品。干熱滅菌排除了濕度因素，但其溫度相比濕熱滅菌更高。輻射滅菌中γ射線會引起聚合物鏈斷裂或形成不需要的化學(xué)鍵，對產(chǎn)品的臨床使用和性能產(chǎn)生重大影響（如生物相容性），而電子束輻射則無法穿透足夠的深度。EtO則是一種有毒、易燃易爆的氣體，其致癌性問題以及滅菌后存在的有毒殘留物影響了其應(yīng)用于生物材料等植入物滅菌?？梢?，以上幾種常見的滅菌方法有著顯著的局限性。

2019年2月美國當(dāng)局暫停了伊利諾伊州、佐治亞州等地的EtO滅菌機(jī)構(gòu)，因環(huán)保署（EPA）認(rèn)為工廠周圍空氣的EtO含量超過可接受限度。這導(dǎo)致了醫(yī)療器械生產(chǎn)企業(yè)和使用機(jī)構(gòu)的諸多不便，如小兒呼吸管的短缺[1]。

作為常規(guī)技術(shù)的替代方法，有研究者還探索了其他滅菌技術(shù)用于生物材料，例如過氧化氫氣體等離子體、過氧乙酸或臭氧，它們都有自己的局限性，并已被證實會改變不同有機(jī)聚合物的形態(tài)結(jié)構(gòu)和表面特性[2]。

因此，探索一種適用于新型材料醫(yī)療器械的安全、綠色滅菌技術(shù)意義重大。筆者通過國內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)的綜合分析，討論醫(yī)療器械領(lǐng)域使用超臨界二氧化碳（下文簡稱scCO2）作為新滅菌技術(shù)的可能性。

1 超臨界二氧化碳理化特性和滅菌機(jī)制學(xué)說

scCO2是一種超臨界流體，即介于液體和氣體之間的中間性質(zhì)的物質(zhì)相態(tài)（如圖1所示），兼具液體的密度和氣體的粘度及擴(kuò)散性，當(dāng)溫度和壓強(qiáng)超過臨界點(diǎn)（Pc，Tc）時流體為超臨界狀態(tài)。CO2在壓力（Pc=7.39 MPa）和溫度（Tc=31.1oC）下達(dá)到超臨界條件，相關(guān)文獻(xiàn)報道，scCO2還具有以下的特性。

圖1 物質(zhì)相態(tài)與溫度和壓強(qiáng)的關(guān)系Fig.1 Relationship between the phase state of matter and temperature/pressure

（1）對多孔或復(fù)雜結(jié)構(gòu)的材料具有極好的滲透性[3]；

（2）低分子量和低極性分子的良好溶劑；

（3）低反應(yīng)性，不會產(chǎn)生自由基和反應(yīng)產(chǎn)物而破壞材料的結(jié)構(gòu)和機(jī)械性能[4]。

可見，上述特性提供scCO2具有殺菌作用可行性。此外CO2本身無毒，其低反應(yīng)性亦不殘留有毒物質(zhì)，且可通過氣相、液相的轉(zhuǎn)換等建立循環(huán)復(fù)用，是一種綠色技術(shù)。

scCO2的滅菌機(jī)理被廣泛討論。細(xì)胞外部和內(nèi)部CO2濃度的增加可能觸發(fā)幾種與細(xì)胞活力相關(guān)程度的不同機(jī)制，其中多個國外研究支持“酸化是主要機(jī)制”的學(xué)說[5-6]。

細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞外介質(zhì)的酸化，是將CO2溶解在含有微生物的水性培養(yǎng)基中并轉(zhuǎn)化為碳酸，并進(jìn)一步電離成碳酸氫根和氫離子。這將降低細(xì)胞外的pH值并破壞細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致細(xì)胞膜通透性增加，從而促進(jìn)了CO2的進(jìn)一步滲透。因此，滅菌的動力學(xué)通常由兩個階段來表征，且兩個階段與CO2擴(kuò)散速率高度相關(guān)：①慢速期，最初緩慢的失活速率和低CO2滲透率；②快速期，在細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)中存在較高的CO2[7]。該過程中其他機(jī)制有：化學(xué)修飾、脂質(zhì)提取、干擾細(xì)胞代謝和細(xì)胞裂解。

國內(nèi)學(xué)者在scCO2對大腸桿菌鈍化作用的研究中得出，高壓CO2對細(xì)胞膜造成一定程度的損傷導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的外泄是細(xì)胞滅活的重要原因；細(xì)胞內(nèi)部pH降低，一些關(guān)鍵性的蛋白和酶失活，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)一系列生理代謝活動無法正常進(jìn)行，是另一個重要原因[8]。

2 超臨界二氧化碳對微生物的滅活能力

由上文可知，scCO2的滅菌機(jī)制可作用于革蘭氏陰性菌、革蘭氏陽性菌（營養(yǎng)態(tài)和休眠態(tài)）、真菌與病毒。外文文獻(xiàn)已針對scCO2在不同條件下對不同微生物滅活能力進(jìn)行了收集和展開。ZHANG等[9]研究了在給定的操作條件下，scCO2對12種革蘭氏陽性菌、10種革蘭氏陰性菌、8種細(xì)菌孢子和8種真菌的滅菌效果，溫度范圍大多為20oC至60oC，壓力為50至100 bar，保持時間從5 min到5 h。

scCO2在不同的初始條件和滅菌參數(shù)下，能夠?qū)崿F(xiàn)多種菌屬的滅菌（Log R＞6）；營養(yǎng)形態(tài)革蘭氏陽性菌種的細(xì)胞壁較革蘭氏陰性菌種厚，但在更嚴(yán)格的操作條件下仍易實現(xiàn)高水平滅菌。

孢子形態(tài)的細(xì)菌對熱和化學(xué)物質(zhì)的滲透具有更高的抵抗力，比營養(yǎng)形態(tài)對滅菌的抵抗力更高，因此孢子可用于測試某些實驗條件下滅菌效果。孢子對超臨界處理具有高度抗性，如枯草芽孢桿菌，與相應(yīng)的營養(yǎng)形態(tài)相比，可采用更長的滅菌時間、更高的操作溫度或使用添加劑來增加滅活能力。

對于真菌，SAL-6通常條件是中等工作壓力（85～150 bar），溫度（38～50oC）和適度的處理時間（少于1 h）下，在某些情況下也需要添加添加劑。scCO2滅菌對不同菌種的條件和效果如表1所示。

病毒的結(jié)構(gòu)對所用滅菌技術(shù)的抵抗力有決定性影響。非包膜病毒無包膜結(jié)構(gòu)，對傳統(tǒng)的滅菌技術(shù)更具抵抗力，完全失活所需的條件可能對產(chǎn)品有害。為了克服這些缺點(diǎn)，有研究者利用scCO2技術(shù)對一些病毒族的滅活進(jìn)行了測試，結(jié)果表明scCO2技術(shù)可與其他技術(shù)（如PAA滅菌劑）結(jié)合進(jìn)行病毒滅活[10]。

3 超臨界二氧化碳滅菌技術(shù)對材料影響的研究案例

國外諸多文獻(xiàn)報道scCO2技術(shù)可在多種應(yīng)用場景中達(dá)到最終滅菌，例如再生醫(yī)學(xué)、食品、醫(yī)療廢物、藥品或水處理，涉及多類材料物質(zhì)?？煽康臏缇幚響?yīng)在不改變材料成分和特性的情況下達(dá)到效果。因此，需要評價scCO2對材料的影響，包括物理性能、結(jié)構(gòu)、生物相容性等等。

3.1 同種異體及異種移植生物材料

傳統(tǒng)的幾種滅菌技術(shù)因滲透能力低、生物材料熱不穩(wěn)定性、有害滅活以及輻射或氧化環(huán)境下材料的降解方面存在局限性，導(dǎo)致滅菌效率低、生物活性喪失以及組織特性的變化。據(jù)報道，對于同種異體及異種生物材料（軟組織和硬組織），scCO2滅菌技術(shù)對移植物的結(jié)構(gòu)和生物學(xué)性能影響很小[11-13]。

表1 scCO2滅菌對不同菌種的條件和效果Tab.1 Conditions and effects of scCO2 sterilization on different bacteria and fungi

對于軟組織，異種移植物進(jìn)行脫細(xì)胞和去除蛋白質(zhì)以獲得不會觸發(fā)免疫原性和其他術(shù)后異物反應(yīng)的細(xì)胞外基質(zhì)，是組織工程中的重要方法。為防止移植過程污染，需對移植物進(jìn)行滅菌。在用于脫細(xì)胞心臟瓣膜的滅菌測試中，scCO2滅菌（使用過氧乙酸和過氧化氫作為添加劑）被證明是獲得SAL-6無菌保障水平而不引起顯著結(jié)構(gòu)變化的唯一方法[14]。而γ射線輻射滅菌損壞了瓣膜尖端，電解水/過氧化氫滅菌由于微生物殘留不達(dá)標(biāo)不適合進(jìn)行最終滅菌。在對經(jīng)過scCO2滅菌處理的心臟瓣膜進(jìn)行了綿羊體內(nèi)測試，顯示至少5個月的再生反應(yīng)及正常的血液動力學(xué)功能[13]。用過氧乙酸作為添加劑的scCO2滅菌技術(shù)也被證明與細(xì)胞真皮基質(zhì)相容[10]，并且成功應(yīng)用于骨腱骨組織、肌腱和羊膜的同種異體移植以及脫細(xì)胞肺組織的異種移植[11,15-17]。

對于硬組織，如用于骨移植物的滅菌方法應(yīng)確保微生物滅活，同時保留骨移植物固有的機(jī)械和生物力學(xué)特性，多項研究強(qiáng)調(diào)了在低溫和中等壓力條件下，scCO2滅菌在微生物滅活以及同種異體不同部位（肱骨、半月板、股骨和脛骨）和異種來源移植物（羊、兔和牛）的最終滅菌中的效果[12,18]。體外和體內(nèi)研究表明，經(jīng)scCO2滅菌移植物的生物力學(xué)性能比經(jīng)γ射線輻照滅菌的移植物更接近原始移植物，并且使用某些添加劑（過氧化氫和過氧乙酸）不會顯著改變骨骼的靜態(tài)和動態(tài)機(jī)械性能[12,16]。此外，RUSSEL等[18]通過多項體內(nèi)研究證實，超臨界滅菌的移植物具有骨傳導(dǎo)性，和未處理的同種異體移植物沒有組織學(xué)差異[12,18]。

3.2 天然材料

關(guān)于其他天然材料，如多糖，scCO2技術(shù)通過減弱對材料化學(xué)結(jié)構(gòu)和性能相關(guān)的有害作用，開辟新機(jī)制。在對藻酸鹽水凝膠進(jìn)行scCO2滅菌的實驗中[4,19]，結(jié)果達(dá)到SAL-6，并通過調(diào)節(jié)滅菌條件（滅菌劑含量，處理時間）以減輕藻酸鹽的降解，保留了基于天然聚合物的膜的機(jī)械性能。同時豬體外試驗證明該材料具有生物相容性，scCO2滅菌還能夠保留淀粉氣凝膠材料的復(fù)雜納米結(jié)構(gòu)[20]。

膠原蛋白是一種對熱敏感的天然蛋白，已在35oC用scCO2成功滅菌[21]。該技術(shù)還成功地對通過凍干獲得的高度多孔的3D海綿形式的膠原和礦化膠原進(jìn)行了滅菌，并且沒有顯示出明顯的機(jī)械或形態(tài)損傷[19,21]。超臨界滅菌后，藻酸鹽水凝膠和膠原蛋白支架與人間充質(zhì)干細(xì)胞顯示細(xì)胞相容性[19]。

3.3 人工合成材料與紡織物

關(guān)于合成材料，scCO2滅菌主要集中在用于人體植入物等。用超臨界CO2對熱固性材料進(jìn)行滅菌不會引起材料的熱和機(jī)械性能變化，但是可以通過去除未反應(yīng)的單體來純化材料[22]。

有實驗證實了scCO2滅菌對被污染的導(dǎo)管進(jìn)行滅菌的有效性，并且經(jīng)過多次處理后未觀察到表面發(fā)生明顯變化[23]。量熱法和電子顯微鏡分析證明了用scCO2處理聚乳酸材料不會改變支架的生物相容性和結(jié)構(gòu)[7]。在其他研究中，scCO2滅菌處理不會影響凝膠的流變性質(zhì)、pH和結(jié)構(gòu)，并且使用雪貂進(jìn)行的體內(nèi)試驗顯示皮下注射無菌水凝膠的生物相容性[24]。對于紡織物，scCO2是需低溫處理和不適用刺激性化學(xué)消毒劑的紡織品的滅菌替代方法。對由真絲和50%棉—50%聚酯制成的紡織品實驗顯示，通過單獨(dú)添加水或與氫氧化鈣組合使用，超臨界處理的消毒功效會提高，而不會對經(jīng)處理的紡織品的物理性能造成不利影響[25]。

4 超臨界二氧化碳滅菌設(shè)備用于醫(yī)療器械的實踐

scCO2設(shè)備在多個臨床醫(yī)學(xué)場景下得到了應(yīng)用，但大多為實驗室搭建，如ZHANG等[9]的滅菌效果驗證實驗。歐洲HCM-Medical公司提供專業(yè)scCO2服務(wù)，可清潔自體組織以準(zhǔn)備重新植入患者體內(nèi)。美國NovaSterilis公司的scCO2工藝移植了70 000多個同種異體移植組織，為這種綠色滅菌工藝增加了現(xiàn)實生活的支持。

WHITE等[26]在研究中介紹了NovaSterilis 公司的一種滅菌設(shè)備（US7108832 B2）。該設(shè)備如圖2所示，包括一個與二氧化碳的標(biāo)準(zhǔn)壓縮氣瓶（2）和CO2增壓器（6）結(jié)合使用的標(biāo)準(zhǔn)空氣壓縮機(jī)（4），止回閥（8），壓力表（10），泄壓裝置（12），以及回收過濾器（30）。該系統(tǒng)的控制組件由帶有觸摸屏界面和數(shù)據(jù)記錄的控制板監(jiān)控和操作（32）。國內(nèi)臨床醫(yī)學(xué)領(lǐng)域已見該設(shè)備用于同種異體骨組織材料的處理工藝[27]。

圖2 Nova Sterilis設(shè)備的示意圖Fig.2 Schematic diagram of the Nova Sterilis equipment

也有國外研究者利用超流體處理設(shè)備配合其他組件，搭建了實驗室處理系統(tǒng)，如ISCO SFX 2-10[28]。國內(nèi)暫未見單純使用scCO2技術(shù)的醫(yī)療器械滅菌裝置。

5 超臨界二氧化碳滅菌用于醫(yī)療器械工業(yè)領(lǐng)域的考慮

在醫(yī)療器械工業(yè)領(lǐng)域，scCO2滅菌技術(shù)的考慮與實驗室應(yīng)用環(huán)境有很大的不同。首先，工業(yè)化生產(chǎn)量要遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于實驗室的生產(chǎn)量。其次，產(chǎn)品在生產(chǎn)滅菌中需要包裝作為無菌屏障，因此要考慮滅菌方法對包裝的影響等。再者，應(yīng)考慮產(chǎn)品的綜合效益。未見報道描述有工業(yè)大批量產(chǎn)品scCO2滅菌系統(tǒng)。

對于符合ISO 13485:2016（國內(nèi)等同轉(zhuǎn)化為YY/T 0287—2017）的制造商，ISO 14937:2009（國內(nèi)等同轉(zhuǎn)化為GB/T 19974—2018）定義了用于醫(yī)療器械滅菌方法的開發(fā)、驗證和常規(guī)控制等相關(guān)的要求。

根據(jù)ISO 14937:2009，應(yīng)評估scCO2滅菌過程對材料和包裝的影響。在scCO2滅菌前后測試產(chǎn)品的微生物，包括建立控制產(chǎn)品污染物的系統(tǒng)以避免影響滅菌過程的有效性。根據(jù)前文所述，溫度和壓力作為兩大影響CO2形態(tài)的根本條件，使用最大操作條件來表示對材料和包裝的最嚴(yán)苛挑戰(zhàn)，排除可能存在的副反應(yīng)等不利因素。同時應(yīng)關(guān)注滅菌過程中，工藝變量的系列參數(shù)對產(chǎn)品和包裝材料的影響，以及達(dá)到無菌要求的工藝參數(shù)。應(yīng)驗證和確認(rèn)包裝、裝載結(jié)構(gòu)、質(zhì)量、密度和物理狀態(tài)對滅菌過程的有效性的影響，且該研究須在最難滅菌的材料位置進(jìn)行。在驗證的最后階段，證明建立的滅菌過程是有效且可重復(fù)的，從安裝鑒定、操作鑒定和性能鑒定三個階段論述。

另外，根據(jù)前文以及相關(guān)研究者如HERDEGEN等[21]在醫(yī)療產(chǎn)品滅菌中的研究，scCO2滅菌過程中若用到特殊因素，如滅菌輔助劑（如H2O2）用量、壓力循環(huán)次數(shù)等，也應(yīng)考慮充分驗證。

一次性醫(yī)療器械的再處理（SUD）因在多個國家和地區(qū)未得到合規(guī)性的確認(rèn)，且目前尚無關(guān)于SUD以及患者從這些潛在成本節(jié)省中受益的明確證據(jù)，筆者不討論此種情形的應(yīng)用。此外，scCO2滅菌技術(shù)對產(chǎn)品的貨架有效期影響，也需要產(chǎn)業(yè)界和研究學(xué)者的共同探索。

從前文可知，已有較多的證據(jù)證明scCO2滅菌具有克服傳統(tǒng)滅菌方法局限性的潛力。在該技術(shù)受到合理監(jiān)管下，可增加醫(yī)療器械生產(chǎn)滅菌的產(chǎn)品范圍，具有明顯的經(jīng)濟(jì)效益。