徐涵穎，徐 燕，王騰飛，韓 旭，程 婷，沈繼龍， 桂雙英

牙齦卟啉單胞菌(Porphyromonasgingivalis,P.g)是引起牙周病的主要病原體之一。機(jī)械治療牙周炎存在局限性，而臨床上經(jīng)常使用的輔助治療藥物如抗生素、西吡氯銨等可能會(huì)引起細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生，味覺改變和色素沉著等問題[1]。近年來采用免疫學(xué)方法如卵黃抗體(immunoglobulin of yolk，IgY)來控制感染為解決這一難題提供新的思路和方法[2]。現(xiàn)采用薄膜分散法制備抗Pg-IgY脂質(zhì)體，測(cè)定其包封率、體外釋放率、粒徑、Zeta電位并進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)，以期達(dá)到緩慢釋藥，提高藥效的作用[3]。

1 材料與方法

1.1 試劑與器材特異性抗牙齦卟啉單胞菌卵黃抗體溶液(合肥安科生物有限公司)；卵磷脂(德國利保德公司)；膽固醇(生物試劑純，加拿大BBI公司)；三氯甲烷、生育酚等試劑(天津博迪化工技術(shù)有限公司)；透析袋(上海原野生物科技有限公司)。動(dòng)態(tài)光散射粒度分布儀(美國布魯克海文儀器公司)；恒溫磁力攪拌儀(常州智博瑞儀器有限公司)；N-1001型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(日本EYELA公司)；渦流振蕩器(常州神光儀器有限公司)；Mettler AE240電子天平(上海右一儀器有限公司)；酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀(山東博科生物有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1抗Pg-IgY蛋白檢測(cè)方法的建立

1.2.1.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 本實(shí)驗(yàn)采用BCA法進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制。取20 μl蛋白標(biāo)準(zhǔn)品(25 g/L BSA溶液)，加入980 μl蛋白稀釋液，配置成0.5 g/L，分別在96孔板中加入0、1、2、4、8、12、16、20 μl上述溶液，再分別加入標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液至20 μl。向每個(gè)孔中加入200 μl BCA工作溶液，并在37 ℃反應(yīng)30 min～1 h左右，測(cè)量562 nm處吸光度(optical density,OD)值。 以濃度C(g/L)對(duì)OD值進(jìn)行線性回歸。求出標(biāo)準(zhǔn)曲線Y=0.742X-0.109，R2=0.999。

1.2.1.2回收率和精密度測(cè)定 配制低、中、高濃度的抗Pg-IgY溶液，分別稀釋至為0.03、0.02、0.015 g/L。根據(jù)1.2.1.1項(xiàng)下操作，分別在OD值為562 nm處測(cè)量上述3種溶液的OD，并通過重復(fù)測(cè)量3次來計(jì)算回收率。取濃度為7.2 g/L的抗Pg-IgY溶液，準(zhǔn)確地將1 ml上述溶液轉(zhuǎn)移到試管1～6中。根據(jù)1.2.1.1項(xiàng)下的操作重復(fù)測(cè)量6組樣品的OD，并計(jì)算其精密度。

1.2.2抗Pg-IgY脂質(zhì)體的制備方法 為了提高脂質(zhì)體制備的成功率，本實(shí)驗(yàn)采用薄膜分散法制備脂質(zhì)體，并稱取60 mg干燥的卵磷脂，將9 mg膽固醇和0.1 mg親脂性抗氧化劑生育酚置于圓底燒瓶并溶于5 ml氯仿中。超聲震蕩使其充分水化，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)(400～700 kPa)干燥磷脂，溫度設(shè)置為30 ℃，同時(shí)30 ℃水浴環(huán)境預(yù)熱抗Pg-IgY溶液，30 min后，用5 ml抗Pg-IgY溶液將脂質(zhì)膜水合，使用振蕩并渦旋的方式攪拌混懸液數(shù)分鐘至數(shù)十分鐘不等，得到抗 Pg-IgY脂質(zhì)體溶液。

1.2.3Zeta電位和脂質(zhì)體粒徑的測(cè)定 用超純水將1 ml抗Pg-IgY脂質(zhì)體溶液稀釋10倍，并通過動(dòng)態(tài)光散射粒度分布分析儀測(cè)量粒度分布，以25 ℃的溫度測(cè)量。將待測(cè)抗Pg-IgY脂質(zhì)體溶液加入到樣品杯中，將鈀電極插入溶液中，并通過Zeta電位分析儀測(cè)量脂質(zhì)體的表面電荷性質(zhì)。每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)量3次并取平均值，并將溫度設(shè)定為25 ℃。

1.2.4通過透析法測(cè)定包封率

1.2.4.1透析袋的處理 將透析袋剪成6～8 mm，放入2% NaHCO3(W/V)和1 mmol/L EDTA(pH 8.0)中將透析袋煮沸10 min。用超純水洗滌透析袋后，將其在1 mmol/L EDTA(pH 8.0)中煮沸數(shù)十分鐘。冷卻后存放于50%乙醇中4 ℃儲(chǔ)存?zhèn)溆肹4]。

1.2.4.2透析時(shí)間的確定 取2 ml抗Pg-IgY脂質(zhì)體溶液置于透析袋內(nèi)(孔徑1 000 ku)，將透析袋放入由200 ml生理鹽水作為透析液的燒杯內(nèi)，將恒溫磁力攪拌器的溫度設(shè)置為10 ℃，分別在2、4、6、8、12、20、24 h取透析液1 ml并補(bǔ)充等體積的生理鹽水，BCA法測(cè)定透析液中蛋白濃度。

1.2.4.3包封率的測(cè)定 包封率(encapculation efficiency,EE)的計(jì)算公式： EE(%)=(W總-W游)/W總。其中W總為總藥量；W游為未包封的游離藥量。

1.2.5體外釋放實(shí)驗(yàn)[5]取制備所得抗Pg-IgY脂質(zhì)體溶液，精確地將2 ml脂質(zhì)體溶液轉(zhuǎn)移到透析袋中。將末端固定并置于含有200 ml 0.9%生理鹽水的燒杯中。37 ℃恒溫水浴條件下進(jìn)行磁力攪拌，于0.5、1、2、8、12、24、36、48、72、84、96、108 h分別從燒杯中取1 ml樣品并同時(shí)補(bǔ)充等體積透析介質(zhì)，用BCA法測(cè)出每個(gè)取樣時(shí)間點(diǎn)透析介質(zhì)中的蛋白含量，以0 h時(shí)透析袋內(nèi)的蛋白含量作為總含量，二者之比即為累積釋放率。

1.2.6抗Pg-IgY脂質(zhì)體的質(zhì)量評(píng)價(jià)[6]用2%磷鎢酸負(fù)染脂質(zhì)體后置于透射電子顯微鏡下觀察。

2 結(jié)果

2.1 回收率實(shí)驗(yàn)和精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果根據(jù)1.2.1.2項(xiàng)所述方法進(jìn)行操作測(cè)定回收率和精密度，回收率R=測(cè)量濃度/實(shí)際濃度×100%，結(jié)果如表1所示。3組的平均回收率分別為1.045、1.00和1.02。精密度計(jì)算公式如下：

相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)=標(biāo)準(zhǔn)偏差/平均值×100%，結(jié)果如表2所示為1.29%。BCA蛋白質(zhì)測(cè)定的原理是在堿性條件下蛋白質(zhì)可以將二價(jià)銅離子還原為單價(jià)銅離子。單價(jià)銅離子與獨(dú)特的BCA溶液A(含有BCA)的相互作用產(chǎn)生敏感的顏色響應(yīng)。2個(gè)BCA分子螯合銅離子形成紫色反應(yīng)復(fù)合物。水溶性復(fù)合物在562 nm處顯示出強(qiáng)吸光性，并且OD和蛋白質(zhì)濃度在很寬的范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。因此根據(jù)OD可以推算出待測(cè)物的蛋白濃度。精密度常用RSD值表示，當(dāng)該值小于5%時(shí)，該組樣品之間彼此符合的程度越高。根據(jù)本文回收率和精密度實(shí)驗(yàn)所得結(jié)果計(jì)算出的RSD值為1.29%，均小于2%，說明用BCA蛋白濃度測(cè)定法測(cè)定抗Pg-IgY蛋白濃度試驗(yàn)精密度和回收率均較高，符合方法學(xué)要求。

表1 回收率實(shí)驗(yàn)(n=9)

表2 精密度試驗(yàn)(n=6)

2.2 抗Pg-IgY脂質(zhì)體Zeta電位和粒徑的測(cè)定取3個(gè)樣品測(cè)定Zeta電位和粒徑，其平均粒徑為(82.48±2.3) nm，多分散指數(shù)為0.313±0.01。Zeta電位為(-38.55±0.16) mV，Zeta電位絕對(duì)值大于25 mV，多分散指數(shù)為0.3左右，表明該系統(tǒng)相對(duì)穩(wěn)定并且粒子不易沉降。

2.3 抗Pg-IgY脂質(zhì)體包封率的測(cè)定本實(shí)驗(yàn)選擇的透析時(shí)間是24 h，在此時(shí)游離藥物基本釋放，透析袋內(nèi)外的濃度差距隨著藥物釋放越來越小，透析介質(zhì)內(nèi)的蛋白濃度已恒定不變，由公式可測(cè)得EE為40%(n=3)。如圖1。

圖1 抗Pg-IgY脂質(zhì)體透析曲線

2.4 抗Pg-IgY脂質(zhì)體的體外釋放行為從圖2可以看出，抗Pg-IgY脂質(zhì)體具有顯著的持續(xù)釋放效果，并且4 h內(nèi)的累積藥物釋放速率是20%左右，表明該藥物不產(chǎn)生爆發(fā)釋放。生理鹽水中的蛋白質(zhì)濃度在0.5～24 h顯著增加，未釋放的游離蛋白質(zhì)主要在12 h釋放。在12～24 h這一階段，生理鹽水中的游離蛋白質(zhì)的比例增加到約50%，這部分蛋白質(zhì)來源于抗Pg-IgY脂質(zhì)體。48 h以后，藥物釋放趨向平穩(wěn)，累積釋放率由70.5%上升至79.9%，并且可以從趨勢(shì)中看出108 h后仍然持續(xù)釋放，說明藥物被包封在脂質(zhì)體內(nèi)部，通過脂質(zhì)體的破裂從而達(dá)到緩釋發(fā)揮藥效的作用。

圖2 抗Pg-IgY脂質(zhì)體體外釋放率曲線

2.5 抗Pg-IgY脂質(zhì)體的質(zhì)量評(píng)價(jià)通過透射電鏡觀察抗 Pg-IgY 脂質(zhì)體，脂質(zhì)體粒徑分布較均一 ,形狀呈卵圓形，其層狀結(jié)構(gòu)明顯，外表光滑，囊泡完整。釋放藥物后的脂質(zhì)體在鏡下可見囊泡破裂，有磷脂碎片分布在周圍，并且此時(shí)脂質(zhì)體已經(jīng)萎縮變形。如圖3。

圖3 透射電鏡下抗Pg-IgY脂質(zhì)體形態(tài)

A：脂質(zhì)體分布粒徑均一×40 K；B、C：脂質(zhì)體呈卵圓形，層狀結(jié)構(gòu)明顯，囊泡完整×60 K；D：釋藥后的脂質(zhì)體，囊泡破裂，磷脂碎片分布在周圍，脂質(zhì)體已萎縮變形×30 K

3 討論

抗Pg-IgY可靶向殺滅牙周病原微生物，在彌補(bǔ)機(jī)械治療不足的同時(shí)還有效避免抗生素等過度使用。盡管抗Pg-IgY臨床療效良好，但在口腔環(huán)境中易被生物酶降解，無法長(zhǎng)期維護(hù)牙周健康。脂質(zhì)體是一種微球系統(tǒng)，由親油和親水分子構(gòu)成雙層結(jié)構(gòu)并將藥物包封在其中，使其免受生物酶破壞，延長(zhǎng)藥物在牙周袋內(nèi)的作用時(shí)間。因此抗Pg-IgY脂質(zhì)體對(duì)于牙周病治療具有重要意義。

卵黃抗體是一種親水性免疫蛋白，考慮到大量制備的需要，本實(shí)驗(yàn)采用薄膜分散法制備抗Pg-IgY脂質(zhì)體。由此制備出的脂質(zhì)體多數(shù)為大多室脂質(zhì)體，大多室脂質(zhì)體是多層結(jié)構(gòu)，主要由小囊泡聚集形成[7]。抗Pg-IgY脂質(zhì)體即是包裹抗Pg-IgY的雙分子層小囊泡，通過囊泡的破裂釋放出抗Pg-IgY并發(fā)揮其藥效。

測(cè)定脂質(zhì)體包封率的方法包括超速冷凍離心法、葡聚糖凝膠層析法、透析法、魚精蛋白凝聚法、微柱離心法等[8]。IgY的相對(duì)分子量約為180 ku。游離IgY可以通過透析袋，而脂質(zhì)體由具有大分子量的磷脂雙層組成，難以通過透析袋。因此本實(shí)驗(yàn)選用透析法測(cè)定脂質(zhì)體包封率簡(jiǎn)便易行且非常經(jīng)濟(jì)。2015年版中國藥典對(duì)脂質(zhì)體的包封率有明確規(guī)定。如果包封率過低，則失去了制備脂質(zhì)體的意義。本實(shí)驗(yàn)制備出的脂質(zhì)體包封率較高(40%)，能夠滿足進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)要求。

脂質(zhì)體的Zeta電位及其粒徑也是評(píng)價(jià)脂質(zhì)體性質(zhì)的基本參數(shù)，較小的脂質(zhì)體在生物方面的主要優(yōu)勢(shì)在于被清除較慢。已有學(xué)者[9]證明即使脂質(zhì)體是空間穩(wěn)定的，較小的粒徑(70～200 nm)和均勻的粒度分布也有利于延長(zhǎng)其循環(huán)時(shí)間。脂質(zhì)體顆粒的表面電荷是確保顆粒分散體系穩(wěn)定性的重要因素，其高低可直接反映粒子帶電多少，間接反映粒子之間排斥力的強(qiáng)弱。Zeta電位的絕對(duì)值越高，顆粒之間的靜電排斥越大，物理穩(wěn)定性越好。通常，Zeta電位的絕對(duì)值高于25 mV，那么該系統(tǒng)被認(rèn)為是相對(duì)穩(wěn)定的。本實(shí)驗(yàn)中制備的脂質(zhì)體的Zeta電位的絕對(duì)值大于38 mV，表明脂質(zhì)體顆粒之間的靜電排斥大并且系統(tǒng)相對(duì)穩(wěn)定。同時(shí)該實(shí)驗(yàn)制備出的脂質(zhì)體平均粒徑為82.48 nm，有利于藥物的緩釋。

抗Pg-IgY脂質(zhì)體在體外釋放期間表現(xiàn)出兩個(gè)釋放階段[10]。在0～4 h內(nèi)快速釋放，約占總藥物釋放量的25%。這是未包封在脂質(zhì)體中的游離藥物的釋放，并且脂質(zhì)體的包封效率為40%，證明存在60%的游離藥物；在4～48 h顯示藥物緩慢釋放，因?yàn)橹|(zhì)體內(nèi)層中的藥物必須穿過雙分子層才得以進(jìn)入0.9%生理鹽水。

總之，本實(shí)驗(yàn)制備的抗Pg-IgY脂質(zhì)體的粒徑、Zeta電位、PDI指數(shù)、包封率和體外釋放度均符合要求,為進(jìn)行下一步研究奠定良好基礎(chǔ)。