朱戈麗，林 莉，伍 軍，畢智敏，鞏雪敏，李菊霜

腎間質纖維化(renal interstitial fibrosis，RIF)是多種慢性腎臟疾病發(fā)展為終末期腎病的主要途徑。百令膠囊是人工培養(yǎng)的一種冬蟲夏草菌絲，具有增強免疫力、抗纖維化、保護腎功能等作用[1]。還原型谷胱甘肽(reduced glutathione，GSH)是由谷氨酸、胱氨酸及甘氨酸組成的一種三肽，在機體的脂質過氧化損傷中具有重要作用[2]。已有研究[3]表明，百令膠囊和GSH均可以抑制RIF，保護腎組織結構和功能損傷，但其具體的保護機制尚不清楚。課題組前期研究[4]顯示，百令膠囊聯(lián)合GSH可以抑制單側輸尿管梗阻大鼠的腎組織纖維化。因此，該研究從細胞水平上分析了百令膠囊加GSH含藥血清對大鼠間質成纖維細胞NRK-49F的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物SD雄性大鼠20只，7～8周齡，體質量250～300 g，購自三峽大學實驗動物中心，動物許可證號SCXK(鄂)2017-0012，保持室溫恒定為25 ℃，模擬晝夜光照，自由攝食與飲水。

1.2 儀器與試劑酶標儀(MULTISKAN MK3)購自美國Thermo公司；CO2恒溫培養(yǎng)箱(MCO-15AC)購自日本SANYO公司；大鼠腎成纖維細胞NRK-49F由上海拜力生物科技有限公司提供；百令膠囊購自杭州中美華東制藥有限公司(國藥準字Z10910036)；GSH購自上海復旦復華藥業(yè)有限公司(國藥準字H20031265)；CCK8檢測試劑盒由廣州Biosharp提供；無支原體胎牛血清購自美國Gibco公司；兔抗大鼠增殖細胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)、細胞周期蛋白(Cyclin)D1、Ⅰ型膠原(Collagen Ⅰ)抗體、Sma和Mad相關蛋白2(sma and mad-related protein，Smad2)抗體、磷酸化Smad2(phosphorylation of Smad2，p-Smad2)抗體、Smad3抗體、p-Smad2抗體、α肌動蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)抗體、辣根過氧化酶(horseradish peroxidase，HRP)標記羊抗兔二抗均購自武漢博士德生物工程有限公司；RNA提取試劑盒、反轉錄試劑盒、熒光定量試劑均購自日本TaKaRa公司；PCR引物由南京金斯瑞有限公司合成。

1.3 動物含藥血清的制備大鼠禁食水12 h后，采用結扎左側輸尿管建立單側輸尿管梗阻大鼠模型[5]。治療組大鼠每日給予百令膠囊1.5 g/kg聯(lián)合GSH 300 mg/kg灌胃治療，治療時間為術前1 d至術后第9天；模型組給予等體積的生理鹽水灌胃。無菌采集各組大鼠血液，3 000 r/min離心10 min，56 ℃水浴鍋滅活補體30 min；經(jīng)0.22 μm濾菌膜過濾除菌，置于-80 ℃冰箱備用。

1.4 細胞培養(yǎng)將對數(shù)生長期細胞分為正常對照組、模型組、陰性對照組和藥物干預組。正常對照組采用含5%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)大鼠腎成纖維細胞NRK-49F；模型組用含有10 ng/ml TGF-β1的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)NRK-49F細胞，誘導纖維化；陰性對照組用含有10%模型組大鼠血清和10 ng/ml TGF-β1的培養(yǎng)基培養(yǎng)NRK-49F細胞；藥物干預組用含有10%治療組大鼠的含藥血清和10 ng/ml TGF-β1的培養(yǎng)基培養(yǎng)NRK-49F細胞。顯微鏡下觀察各組細胞形態(tài)。

1.5 CCK8檢測各組細胞增殖取各組NRK-49F細胞，置37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)48 h。待細胞培養(yǎng)至設定時間后，每孔加入10 μl CCK8，37 ℃培養(yǎng)4 h；酶標儀450 nm處測定各孔吸光值 (optical density，OD)，計算細胞存活率=(OD實驗孔-OD空白孔)/(OD對照孔-OD空白孔)，每組重復6次。

1.6 流式細胞儀檢測各組細胞周期分布將各組對數(shù)期細胞，1 000 r/min離心5 min，制成單細胞懸液，加入1 ml 75%乙醇、-20 ℃固定24 h，加入0.4 μl PI(30 mg/ml)混合，避光孵育30 min，流式細胞儀檢測細胞周期，ModFit LT分析并擬合計算各時期細胞百分比。Western blot檢測細胞周期相關蛋白Cyclin D1的表達，每組重復6次。

1.7 RT-PCR檢測各組細胞TGF-β1/Smad信號通路轉錄水平的表達取各組對數(shù)生長期細胞，TRIzol法提取各組細胞的總RNA，采用紫外分光光度計確定RNA濃度，經(jīng)反轉錄試劑盒合成cDNA，進行實時定量PCR反應，以GAPDH作為內(nèi)參，反應引物、體系和條件參考已有文獻[6]，每組重復6次。

1.8 Western blot檢測各組細胞TGF-β1/Smad信號通路蛋白表達水平取各組對數(shù)生長期細胞，采用細胞裂解液提取總蛋白， BCA法進行蛋白定量，取50 ng蛋白進行SDS-PAGE凝膠電泳，電轉膜至PVDF膜，室溫密封2 h，采用TBST洗膜并加一抗Collagen Ⅰ、α-SMA、p-Smad2、Smad2、p-Smad3、Smad3(稀釋比例均為1 ∶ 1 000)，于4 ℃孵育過夜，TBST洗膜加HRP標記的二抗IgG(稀釋比例均為1 ∶ 5 000)，于室溫下孵育2 h。再用ECL化學發(fā)光顯示，收集影像，用凝膠圖像處理系統(tǒng)分析對比條帶強弱，選用β-actin作為內(nèi)參，每組重復6次。

2 結果

2.1 各組大鼠NRK-49F細胞的形態(tài)正常對照組NRK-49F細胞排列緊密，呈長梭形；模型組和陰性對照組NRK-49F細胞體積增大，呈短梭或多角形，胞核增大呈圓形或橢圓形；藥物干預組NRK-49F細胞生長狀態(tài)接近正常對照組。見圖1。

2.2 百令膠囊聯(lián)合GSH對大鼠NRK-49F細胞增殖的影響CCK8實驗顯示，與正常對照組比較，模型組和陰性對照組NRK-49F細胞的增殖活性增加(P<0.05)；與陰性對照組比較，藥物干預組NRK-49F細胞的增殖活性下降(P<0.05)。Western blot 顯示，與正常對照組比較，模型組和陰性對照組NRK-49F細胞PCNA的表達上調(P<0.05)；與陰性對照組比較，藥物干預組NRK-49F細胞PCNA的表達下調(P<0.05)。見圖2、表1。

圖1 各組大鼠NRK-49F細胞的形態(tài) ×100

A：正常對照組；B：模型組；C：陰性對照組；D：藥物干預組

圖2 Western blot法檢測各組NRK-49F細胞PCNA蛋白的表達

表1 百令膠囊聯(lián)合GSH對大鼠NRK-49F細胞增殖的影響

與正常對照組比較：*P<0.05；與陰性對照組比較：#P<0.05

2.3 百令膠囊聯(lián)合GSH對大鼠NRK-49F細胞周期的影響流式細胞術檢測顯示，與正常對照組比較，模型組和陰性對照組NRK-49F細胞G0/G1期細胞減少(P<0.05)，S期細胞增加(P<0.05)；與陰性對照組比較，藥物干預組NRK-49F細胞G0/G1期細胞增加(P<0.05)，S期細胞減少(P<0.05)。Western blot 檢測顯示，與正常對照組比較，模型組和陰性對照組NRK-49F細胞Cyclin D1的表達上調(P<0.05)；與陰性對照組比較，藥物干預組NRK-49F細胞Cyclin D1的表達下調(P<0.05)。見圖3、表2。

圖3 Western blot法檢測各組NRK-49F細胞Cyclin D1蛋白的表達

2.4 百令膠囊聯(lián)合GSH對TGF-β1/Smad信號通

表2 百令膠囊聯(lián)合GSH對大鼠NRK-49F細胞周期的影響

與正常對照組比較：*P<0.05；與陰性對照組比較：#P<0.05

路表達的影響Western blot 檢測顯示，與正常對照組比較，模型組和陰性對照組NRK-49F細胞Collagen Ⅰ、α-SMA、p-Smad2/Smad2、p-Smad3/Smad3的表達上調(P<0.05)；與陰性對照組比較，藥物干預組NRK-49F細胞Collagen Ⅰ、α-SMA、p-Smad2/Smad2、p-Smad3/Smad3的表達下調(P<0.05)。見圖4、表3。

圖4 Western blot法檢測各組細胞TGF-β1/Smad信號通路相關蛋白的表達

2.5 百令膠囊聯(lián)合GSH對TGF-β1/Smad信號通路相關蛋白轉錄水平的影響RT-PCR檢測顯示，與正常對照組比較，模型組和陰性對照組NRK-49F細胞Collagen Ⅰ、α-SMA、Smad2、Smad3 mRNA的表達上調(P<0.05)；與陰性對照組比較，藥物干預組NRK-49F細胞Collagen Ⅰ、α-SMA、Smad2、Smad3 mRNA的表達下調(P<0.05)，見表4。

表3 百令膠囊聯(lián)合GSH對NRK-49F細胞TGF-β1/Smad信號通路的影響

與正常對照組比較：*P<0.05；與陰性對照組比較：#P<0.05

表4 百令膠囊聯(lián)合GSH對TGF-β1/Smad信號通路轉錄水平的影響

與正常對照組比較：*P<0.05；與陰性對照組比較：#P<0.05

3 討論

成纖維細胞在缺血、缺氧、炎癥等刺激下的過度活化、增殖是導致RIF的主要因素之一[7]。TGF-β1是RIF過程中的關鍵促纖維化因子，可以刺激腎小管上皮細胞產(chǎn)生細胞外基質，并抑制細胞外基質的降解，促進RIF[8]。本研究顯示，經(jīng)TGF-β1誘導的NRK-49F細胞呈短梭形或多角形，出現(xiàn)了細胞表型的轉變?；诒菊n題組前期研究[4]，百令膠囊聯(lián)合GSH可以有效抑制RIF的產(chǎn)生，保護腎臟組織。因此，本研究將體內(nèi)實驗與體外實驗相結合，采用大鼠百令膠囊加GSH含藥血清與NRK-49F細胞進行孵育，從細胞水平上分析其作用機制。本研究中，經(jīng)TGF-β1誘導的NRK-49F細胞存活率增加，百令膠囊聯(lián)合GSH含藥血清作用后可以抑制NRK-49F細胞過高的增殖活性，G1期細胞數(shù)量減少，S期細胞數(shù)量增加，且細胞增殖蛋白PCNA和細胞周期蛋白Cyclin D1的表達下降。PCNA是一種與細胞DNA合成相關的增殖細胞核抗原，在細胞增殖的過程中具有重要作用。Cyclin D1為G1期細胞周期素，能夠促進細胞通過G1/S檢查點。姚素花 等[9]的研究顯示，百令膠囊可以降低腹液透析患者的TGF-β1水平，抑制RIF。秦靜 等[10]的研究顯示，GSH可以抑制TGF-β1的表達，抑制肝組織的纖維化，本研究結果與之基本一致，提示百令膠囊聯(lián)合GSH可能通過抑制TGF-β1的表達，誘導細胞周期阻滯，抑制TGF-β1誘導的NRK-49F細胞增殖。

有研究[11-12]顯示，TGF-β/Smad信號通路在RIF的發(fā)生發(fā)展過程中具有重要作用。Smad蛋白是將TGF-β1從受體到細胞核內(nèi)的重要信號轉導分子，包括Smad2、Smad3、Smad4等，通過與其他DNA結合蛋白作用調節(jié)靶基因轉錄。當TGF-β在胞膜與其受體結合后，可磷酸化Smad2和Smad3，使其活化，而活化的Smad2、Smad3與Smad4結合共同形成一個三聚體，共同轉移到細胞核內(nèi)，進一步來調節(jié)下游效應分子α-SMA、基質金屬蛋白酶等，誘導RIF產(chǎn)生。本研究中，TGF-β1誘導的NRK-49F細胞Smad2和Smad3的磷酸化水平升高，α-SMA和Collagen I的表達上調，百令膠囊聯(lián)合GSH含藥血清作用后可以抑制Smad2和Smad3的磷酸化，下調α-SMA和Collagen I的表達，提示百令膠囊聯(lián)合GSH含藥血清可能通過抑制TGF-β1的表達，抑制Smad2和Smad3的磷酸化，抑制RIF。α-SMA是成纖維細胞轉化成肌成纖維細胞的標志，可以促進細胞外基質的分泌和沉積，促進RIF的發(fā)生。Collagen I是細胞外基質的主要成分，在RIF的病理過程中發(fā)揮了重要作用。熊有明 等[13]的研究顯示，百令膠囊可以抑制TGF-β1和Collagen Ⅳ的表達，延緩腎臟的纖維化過程。馬志敏 等[14]的研究顯示，GSH可以抑制TGF-β1、Smad的表達，抑制大鼠的肺纖維化，本研究結果與之基本一致，提示百令膠囊聯(lián)合GSH含藥血清可能通過抑制TGF-β1/Smad的表達，抑制細胞外基質的分泌，抑制RIF的發(fā)生發(fā)展。

綜上所述，百令膠囊聯(lián)合GSH含藥血清可能通過抑制TGF-β1/Smad信號通路，抑制細胞外基質的分泌，誘導細胞周期阻滯，抑制TGF-β1誘導的NRK-49F細胞的過度增殖，為臨床RIF的治療提供選擇依據(jù)，同時也為新藥物靶點的研發(fā)提供了一定的理論依據(jù)。