(摘譯)

(1.貴陽市花溪第一中學(xué)， 貴陽 550025； 2.貴州大學(xué)農(nóng)學(xué)院， 貴陽 550025)

1 前 言

自CRISPR/Cas9首次在植物中應(yīng)用以來，在幾乎所有已實(shí)驗(yàn)物種中都是有效的[1-4]。植物中常用它在特定位點(diǎn)引入雙鏈斷裂(DSB)，再由宿主細(xì)胞的非同源末端連接(NHEJ)機(jī)制修復(fù)，從而導(dǎo)致一些核苷酸插入或缺失，若這些核苷酸位于靶基因編碼區(qū)，可能造成功能喪失[5]。

化膿鏈球菌的Cas 9是一種RNA引導(dǎo)的核酸內(nèi)切酶，與CRISPR(成簇規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列)II型適應(yīng)性免疫系統(tǒng)有關(guān)[6]；該細(xì)菌利用Cas 9/gRNA復(fù)合物識別并切割外來DNA。gRNA由兩個(gè)獨(dú)立的RNA分子組成，它們先雜交然后再與Cas 9結(jié)合；2個(gè)RNA分子已經(jīng)成功作為基因組編輯的單鏈向?qū)NA(sgRNA)[7]。通過剪切sgRNA的5′端(前間隔序列)，使其與靶位點(diǎn)互補(bǔ)，并為Cas 9加上核定位信號，可以在植物或其它真核基因組的特定位點(diǎn)引入DSB。

sgRNA靶點(diǎn)特異的5′端前間隔序列只有20個(gè)核苷酸，不論什么靶位點(diǎn)，它的其余部分都是一樣的(圖1)。Cas 9/sgRNA復(fù)合體能夠查詢基因組序列，并在匹配處引入DSB。sgRNA功能的關(guān)鍵決定因素是同源基因組序列是否緊接NGG，其通常被稱為原間隔基序(Protospacer adjacent motif，PAM)。如果在基因組中發(fā)現(xiàn)23個(gè)堿基序列(20個(gè)來自sgRNA和PAM)，那么核酸內(nèi)切酶將切割DNA。在高等真核植物中，最主要的修復(fù)機(jī)制是NHEJ，盡管許多修復(fù)將完全恢復(fù)至野生型，但有些修復(fù)將導(dǎo)致核苷酸的缺失或插入。

由于負(fù)責(zé)靶向的sgRNA長度較短，難以確保該序列(尤其較大基因組中)不存在其它脫靶位點(diǎn)。脫靶位點(diǎn)和原型間隔區(qū)之間錯配，也會導(dǎo)致脫靶突變[5]。使用這23個(gè)核苷酸序列(Protospacer和PAM)進(jìn)行BLAST搜索大麥基因組，及利用其它CRISPR/Cas9在線專用工具盡可能降低脫靶現(xiàn)象。

使用根癌農(nóng)桿菌攜帶的T-DNA穩(wěn)定轉(zhuǎn)化大麥?zhǔn)且粋€(gè)有效方法[8]。使用4個(gè)轉(zhuǎn)錄盒(1個(gè)抗潮霉素盒、1個(gè)Cas 9核定位表達(dá)盒、2個(gè)小麥U 6啟動子驅(qū)動靶點(diǎn)特異性sgRNA轉(zhuǎn)錄盒)，及將含T-DNA雙元載體的農(nóng)桿菌接種未成熟胚可以引入CRISPR/Cas9靶點(diǎn)突變；發(fā)現(xiàn)只有部分sgRNA是有效的，且誘變效率因sgRNA不同存在很大差異。為了篩選有效的sgRNAs投入了大量工作[9，10]，這雖然與哺乳動物基因組有關(guān)，但可能很好地應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因大麥。所以，為了使所需轉(zhuǎn)基因系數(shù)量最小化，優(yōu)選含一對sgRNA的雙元載體。

每個(gè)靶基因含2個(gè)雙元sgRNA載體，每個(gè)載體含一對特異sgRNA，每個(gè)靶基因總共有4個(gè)sgRNA。即使效率最低情況下，只1/4 sgRNA具有功能，目前已全部完成了15個(gè)靶基因的敲除。在許多情況下，2、3或4個(gè)sgRNAs具有活性。使用雙元sgRNA載體的另一個(gè)潛在優(yōu)勢是若2個(gè)sgRNAs都有活性，通常會刪除整個(gè)序列[11]，如整個(gè)外顯子。

注：(A)Cas 9/sgRNA復(fù)合物在染色體DNA上定位目標(biāo)序列。sgRNA(黑體字母)5′端的20個(gè)核苷酸(前間隔序列)與染色體的上鏈互補(bǔ)，后面緊接著的是PAM，可使Cas 9產(chǎn)生DSB。無論什么靶序列，sgRNA的非可變部分(鏤空字母)都保持不變。(B)DSB由NHEJ機(jī)制修復(fù)，導(dǎo)致較小的插入和缺失。

對于每個(gè)雙元載體，通常做20個(gè)轉(zhuǎn)基因系；然后，篩選T0系是否存在靶突變，從T0靶突變系獲得T1代。播種T1代種子，由于基因分離，可能在T1株系出現(xiàn)丟失了T-DNA的靶突變體。T1代也可能分離出在T0親本所得到的多種突變體，因此在T1代有可能獲得非轉(zhuǎn)基因的純合突變體。

植物中突變體篩選有多種方法，比如，限制性內(nèi)切酶/PCR法[12]。然而，發(fā)現(xiàn)將靶位點(diǎn)PCR擴(kuò)增子直接測序是一種快速、簡單且能輸出詳細(xì)信息的方法。Cas 9直接切割5′端與PAM間的20個(gè)堿基靶序列。如果存在插入或缺失序列，可能導(dǎo)致功能喪失，測序圖譜通常由此切點(diǎn)變成雙峰或三重峰(而野生型則是單峰)。另外，雙元sgRNA的2個(gè)sgRNAs都具有活性，且同時(shí)切割2個(gè)靶位點(diǎn)獲得較短的PCR擴(kuò)增子(約2個(gè)靶點(diǎn)之間的距離)；與野生型相比，可以通過瓊脂糖凝膠上條帶遷移率很容易鑒別片段大小的差異。

將含有插入或缺失突變的T0系保存，種植留種。插入片段應(yīng)與T-DNA分離，每個(gè)靶基因選取4個(gè)T0系進(jìn)入T1，每株系播種24株(共96株)，鑒定出大量無T-DNA的突變體。通過PCR鑒定不含T-DNA的T1植株，并可使用與T0相同的PCR/測序方法篩選無T-DNA、理想的純合突變體。

當(dāng)T-DNA以孟德爾方式從T1植株中分離時(shí)，靶突變通常不會丟失。若編輯發(fā)生在T0早期(如再生植物的原始細(xì)胞)，T1突變率可達(dá)100%；若編輯發(fā)生在T0后期，突變效果不如早期，在1個(gè)基因座上可能含2個(gè)以上等位基因。

2 材 料

2.1 目標(biāo)序列選擇

可在Deskgen.com、http://plants.ensembl.org/ndex.html、https://ics.hutton.ac.uk/morexGenes/blast_page.html等網(wǎng)站搜索序列。

表1 sgRNA靶點(diǎn)特異性寡核苷酸模板

注：黑體代表限制酶位點(diǎn)的黏性末端。示例中PAM靶序列用下劃線表示。

2.2 表達(dá)載體構(gòu)建

寡核苷酸、引物、質(zhì)粒、Bsa1、T 4連接酶、PCR儀、電感受態(tài)細(xì)胞、2 mm電穿孔試管、BioRad基因脈沖器Ⅱ、羧芐青霉素、IPTG、X-gal、質(zhì)粒提取試劑盒、BigDye?循環(huán)測序試劑盒、Esp3I和BpiI、大觀霉素、固體LB培養(yǎng)基、雜交緩沖液等。

2.3 大麥基因組DNA提取

緩沖液1(pH 7.5的Tris HCl 200 mM，250 mM NaCl，25 mM EDTA，0.5%SDS)，pH 8的Tris-EDTA(TE)等。

2.4 靶位點(diǎn)PCR擴(kuò)增和測序

2×PCR混合物、PCR儀、引物、瓊脂糖、10×TBE凝膠緩沖液、堿性磷酸酶(1 u/μL，65 ℃加熱滅活)、外切核酸酶Ⅰ(10 u/μL，80 ℃加熱滅活)等。

2.5 非轉(zhuǎn)基因突變株鑒定

微孔帶、2×PCR混合物、引物、PCR儀、DNA marker等。

3 方 法

3.1 大麥基因組靶序列選擇

1) 在靶基因第一個(gè)外顯子鑒別唯一的23 bp核苷酸序列，該序列應(yīng)符合GN 20 GG模板，并且可以出現(xiàn)在正義鏈或反義鏈上。檢查潛在的脫靶位點(diǎn)，以確保特異性突變。

2) 當(dāng)4個(gè)靶基因檢測了4個(gè)靶位點(diǎn)時(shí)，使用提取的基因組DNA模板設(shè)計(jì)和測試覆蓋靶位點(diǎn)的PCR擴(kuò)增子。PCR能擴(kuò)增清晰的單一條帶，純化后直接測序得到覆蓋靶區(qū)域的色譜圖。

3) 若步驟2已完成，開始構(gòu)建表達(dá)載體；若步驟2尚未完成，可在不同的區(qū)域或外顯子中選擇不同的靶序列。

3.2 表達(dá)載體構(gòu)建

1) 使用限制性內(nèi)切酶Bsa1或Esp3I克隆2個(gè)互補(bǔ)的寡核苷酸，向位置3或位置4引導(dǎo)受體添加1個(gè)合適的前間隔序列。按表1設(shè)計(jì)寡核苷酸序列(不包括PAM)。

2) 互補(bǔ)寡核苷酸中加2μM雜交緩沖液，95 ℃保持3 min進(jìn)行雜交，然后自然冷卻至室溫。

3) PCR體系：100 ng位置3或位置4受體，1μL雜交的寡核苷酸對，1μL 10×T 4連接酶緩沖液，0.5μLBsa1或Esp3I，1μL T 4連接酶，加水至10μL?；旌衔镞M(jìn)行如下循環(huán):37 ℃，20 s；37 ℃，3 min，16 ℃，4 min，26個(gè)循環(huán)；50 ℃，5 min；80 ℃，5 min。

4) 將1μL混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，接種至含100 mg/L羧芐青霉素、0.1 mM IPTG，200μg/mL X-gal的LB瓊脂培養(yǎng)基上37 ℃過夜培養(yǎng)。約選3個(gè)白色菌斑分別在含羧芐青霉素的10 mL LB液體培養(yǎng)基中37 ℃培養(yǎng)過夜；提取質(zhì)粒DNA，并對質(zhì)粒進(jìn)行測序，檢測寡核苷酸對是否被正確重組。體系包含200 ng質(zhì)粒、1.5μL BigDye 3.1緩沖液、1μL 10μM引物、1μL BigDye 3.1，加水至6.5μL。進(jìn)行如下循環(huán)：96 ℃，1 min；96 ℃，10 s，50 ℃，5 s，25個(gè)循環(huán)；60 ℃，4 min。結(jié)合位點(diǎn)周圍的序列如下，轉(zhuǎn)錄的第1個(gè)堿基是從5′端G直接到NX 19，Ns表示原型間隔區(qū)序列，3′端的G表示sgRNA的非可變區(qū)段的開始。

5′-GCTTGCTGCATCAGACTTG(NX 19)GTTTTAGAG-3′

5) 完整的二元sgRNA載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌AGL 1菌株，再用以轉(zhuǎn)入大麥，待T0植株生長14周后，采集葉片提取DNA用于PCR/測序。

3.3 大麥基因組DNA提取

離心管中加入適量葉片，加入600μL緩沖液Ⅰ進(jìn)行研磨，離心10 min后取上清液，加入等體積丙二醇，離心20 min后，加入0.5 mL 70%乙醇洗滌沉淀，再次離心10 min，棄上清，沉淀風(fēng)干后溶解于100μL的TE中。

3.4 PCR和靶位點(diǎn)測序

1) 在http://bioinfo.ut.ee/primer 3-0.4.0/primer 3/上設(shè)計(jì)引物，用野生型DNA進(jìn)行檢測和優(yōu)化，以獲得清晰的特異擴(kuò)增產(chǎn)物。

2) 添加1μL基因組DNA，終濃度150 nM的引物，2×PCR混合物，20μL反應(yīng)體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

3) PCR擴(kuò)增結(jié)束后，取5μL進(jìn)行電泳檢測。大片段缺失突變體比野生型的條帶下移。

4) 15μL PCR產(chǎn)物加入1μL堿性磷酸酶(熱滅活)和1μL外切核酸酶Ⅰ(熱滅活)，37 ℃保持30 min后，80 ℃保持20 min；經(jīng)PCR擴(kuò)增后，送公司測序，將返回ABI文件供色譜檢查。

5) 靶位點(diǎn)處的片段插入或缺失可能從預(yù)期Cas 9切割點(diǎn)附近開始出現(xiàn)雙峰。

6) 播種突變體的T0系種子，在T1代繼續(xù)檢測突變體。

3.5 非轉(zhuǎn)基因突變系鑒定

1) 把每個(gè)T0株系收獲的40粒種子置于培養(yǎng)皿中潮濕濾紙上，4 ℃保存2 d后，放在24 ℃光照培養(yǎng)；種子發(fā)芽后(約4 d)移至大麥生長基質(zhì)(2∶2∶1堆肥∶珍珠巖∶砂礫)，白天15 ℃，夜間12 ℃，相對濕度80%，500μmoL/(m2·s-1)光照下培養(yǎng)，生長約1周后，提取葉片DNA。

2) 采用PCR/測序(方法同上)檢測插入或較大片段缺失突變體。這次由于染色體分離，很可能檢測到純合突變體。

3) 用含HptII編碼序列的特異引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以檢測T-DNA是否存在。取5μL PCR產(chǎn)物，當(dāng)T-DNA存在時(shí)，將擴(kuò)增107 bp的單一條帶，即T1系含轉(zhuǎn)基因；不含T-DNA但含靶點(diǎn)突變的T1系則為非轉(zhuǎn)基因突變體。此階段大多為純合突變，若僅鑒定出雜合突變或雙等位突變，則需進(jìn)入下一輪篩選。