秦穩(wěn)穩(wěn)，崔雪微，張 全，趙興壇，閆 梅，王旖旎，張孝林

(安徽科技學(xué)院生命與健康科學(xué)學(xué)院，安徽 鳳陽 233100)

幽門螺桿菌是革蘭氏陰性桿菌，世界上有50%以上的人口被幽門螺桿菌感染，幽門螺桿菌感染誘導(dǎo)胃炎、十二指腸和胃潰瘍發(fā)生[1]。世界衛(wèi)生組織已確定幽門螺桿菌為Ⅰ類致癌原。研究已證實(shí)，幽門螺桿菌感染導(dǎo)致胃癌發(fā)病率風(fēng)險(xiǎn)升高[2]。幽門螺桿菌感染現(xiàn)在治療主要是利用一種質(zhì)子泵結(jié)合兩種抗生素的三聯(lián)體治療，有一定的治療效果。但抗生素治療需口服大量抗生素和較長的治療周期，導(dǎo)致治療副作用大，病人的依從性差[3]。隨著幽門螺桿菌對抗生素耐藥菌株的不斷出現(xiàn)，用抗生素根治幽門螺桿菌成為重大的醫(yī)學(xué)難題[4]。幽門螺桿菌定植在胃黏膜其是一個(gè)及其酸性的環(huán)境，研究發(fā)現(xiàn)幽門螺桿菌實(shí)際對酸性環(huán)境是及其敏感在酸性環(huán)境是不能生存的。幽門螺桿菌能定植與胃黏膜和存活在酸性環(huán)境與幽門螺桿菌的強(qiáng)的尿素酶活性相關(guān)[5]。尿素酶是幽門螺桿菌的毒力因子，在幽門螺桿菌在黏膜的定植中起重要作用，同時(shí)，幽門螺桿菌在酸性環(huán)境中能存活，尿素酶分解尿素在幽門螺桿菌的周圍形成氨云，使幽門螺桿菌存活在弱堿性的環(huán)境中[6]。因此，尿素酶的抑制劑使幽門螺桿菌的尿素酶喪失活性，幽門螺桿菌不但不能產(chǎn)生存活所需的弱堿性環(huán)境，同時(shí)幽門螺桿菌也失去了在胃黏膜的定植能力。探索和發(fā)現(xiàn)新的具有穩(wěn)定性和低的毒性尿素酶抑制劑用于治療幽門螺桿菌具有重大的價(jià)值。研究發(fā)現(xiàn)一些植物含有的活性成分具有很強(qiáng)的尿素酶抑制作用[7]。前期我們對一些中藥的浸提物抑制尿素酶活性進(jìn)行篩選研究，發(fā)現(xiàn)檳榔浸提物對尿素酶活性具有抑制作用。同時(shí)發(fā)現(xiàn)浸提工藝對浸提物的抑制尿素酶活性有一定的影響。本研究對檳榔的浸提工藝進(jìn)行研究，為把檳榔進(jìn)一步應(yīng)用于防治幽門螺桿菌感染提供理論依據(jù)和技術(shù)方法。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 材料與試劑

檳榔(Areca catechu)購自鳳陽華佗大藥房(經(jīng)安徽科技學(xué)院藥學(xué)系毛斌斌老師鑒定為真品)；磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、氫氧化鈉、苯酚、次氯酸鈉、硝普鈉、尿素(均為AR級)、刀豆尿素酶、實(shí)驗(yàn)用水為蒸餾水。

1.2 儀 器

HH-8數(shù)顯恒溫水浴鍋，江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司；FA21048電子天平，上海市精密科學(xué)儀器總廠；型酶標(biāo)儀，美國MD全波長酶標(biāo)儀SpectraMax190；真空冷凍干燥機(jī)，德國Martin Christ公司。

1.3 方 法

1.3.1 正交實(shí)驗(yàn)考察的因素的確定

對檳榔浸提物抑制尿素酶活性的成分有較大影響的因素主要是浸提溫度、浸提時(shí)間和料液比。本研究以檳榔浸提物對尿素酶活性抑制率為指標(biāo)，以上述三因素為考察對象，設(shè)計(jì)正交實(shí)驗(yàn)，確立檳榔浸提物對尿素酶活性抑制作用的最佳浸提工藝條件。

1.3.2 檳榔浸提物對尿素酶活性的抑制作用——靛酚藍(lán)法

尿素酶活性的檢測主要利用尿素酶具有催化尿素生成氨的作用，檢測生成氨的量就可知道尿素酶的活性。氨在弱堿性溶液中能與次氯酸鈉發(fā)生反應(yīng)生成一氯胺，一氯銨在硝普鈉作為催化劑情況下與酚作用生成靛酚藍(lán)，靛酚藍(lán)的最大吸收波長是在625 nm處。本研究根據(jù)文獻(xiàn)[8]稍作改動(dòng)，按照下列方法測定浸提物對尿素酶活性的抑制率：

(1)溶液的配置

① 50 mM磷酸鉀緩沖液配制：KH2PO41.7015 g 溶于100 mL去離子水中；K2HPO42.1775 g溶于100 mL去離子水中；

② 兩溶液混合后定容至1000 mL；②溶液A的配制：0.5 g苯酚，2.5 mg硝普鈉溶于45 mL緩沖液中，定容至50 mL；

③ 溶液B的配制：0.25 g NaOH 0.42 mL 5%次氯酸鈉 溶于45 mL緩沖液中，定容至50 mL；

④ 300 mM尿素溶液的制備：1.8 g尿素溶于90 mL緩沖液，再定容至100 mL。

(2)1 mL反應(yīng)體系組成和抑制率測量

① 在1.5 mL的離心管中分別加入檳榔浸提物0.1 mL和生理鹽水0.1 mL(作為對照)然后再分別加入20 IU/mL尿素酶貯備液 0.05 mL，最終尿素酶在1 mL反應(yīng)體系濃度為1 IU/mL；小心混勻后在37 ℃ 溫浴10 min；

② 分別加入溶液A： 0.25 mL， 溶液B：0.25 mL；

③ 分別加入300 mM尿素貯備液0.1 mL，最終尿素的最終濃度為30 mM，每個(gè)試管加入緩沖液0.25 mL，小心混勻后在37 ℃ 溫浴30 min；

④ 分別取0.2 mL至96孔酶標(biāo)板，每個(gè)樣品作3個(gè)平行，在630 nm處檢測吸光度值后求平均值。對照組為A0，樣品檳榔浸提液組為A。

檳榔浸提液對尿素酶活性的抑制率按下列公式計(jì)算：

抑制率=(A0-A)/ A0×100%

1.3.3 檳榔浸提物對尿素酶活性抑制作用的單因素考察

1.3.3.1 影響浸提物抑制尿素酶活性的溫度實(shí)驗(yàn)

稱取2克檳榔分別加入5個(gè)錐形瓶，再向錐形瓶中加入42 mL去離子水(料液比1:21)，水浴溫度依次為70 ℃，75 ℃，80 ℃，85 ℃和90 ℃，提取時(shí)間120 min，浸提物進(jìn)行抽濾，把濾液真空冷干燥，用10 mL的去離子水進(jìn)行稀釋配置溶液，進(jìn)行尿素酶抑制率檢測。

1.3.3.2 影響浸提物抑制尿素酶活性的浸提時(shí)間實(shí)驗(yàn)

稱取2 g檳榔分別加入5個(gè)錐形瓶，向5個(gè)錐形瓶中加入42 mL去離子水(料液比1:21)，浸提溫度85 ℃，浸提時(shí)間為60 min，90 min，120 min，150 min，180 min，浸提物進(jìn)行抽濾，把濾液真空冷干燥，用10 mL的去離子水進(jìn)行稀釋配置溶液，進(jìn)行尿素酶抑制率檢測。

1.3.3.3 影響浸提物抑制尿素酶活性的料液比實(shí)驗(yàn)

稱取2 g檳榔分別加入5個(gè)錐形瓶，向5個(gè)錐形瓶中分別加入30 mL、36 mL、42 mL、48 mL、54 mL去離子水，相當(dāng)于料液比1:15,1:18,1:21,1:24,1:27，浸提溫度為85 ℃，浸提時(shí)間120 min, 浸提物進(jìn)行抽濾，把濾液真空冷干燥，用10 mL的去離子水進(jìn)行稀釋配置溶液，進(jìn)行尿素酶抑制率檢測。

1.3.4 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

依據(jù)1.3.3單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選取3個(gè)檳榔浸提物對尿素酶活性較好抑制率的浸提條件，確立單因素合適的3水平，設(shè)計(jì)3因素3水平正交實(shí)驗(yàn)獲得檳榔浸提物對尿素酶活性抑制率最佳浸提工藝條件。因素水平如表1所示，正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2所示。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)的結(jié)果

2.1.1 溫度對浸提物抑制尿素酶活性的影響

溫度對浸提物抑制尿素酶活性的影響如圖1所示。浸提溫度從70 ℃到85 ℃時(shí)隨著浸提溫度的升高浸提物對尿素酶活性逐漸增大，當(dāng)浸提溫度從85 ℃到90 ℃時(shí)，浸提物對尿素酶活性的抑制沒有增大反而有所下降。出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因可能是，開始隨著溫度的不斷升高有利于活性成分從檳榔中釋放，但活性成分對熱敏感，當(dāng)溫度過高時(shí)，部分活性成分受到破壞。因此檳榔浸提物具有較好抑制尿素酶活性的浸提溫度為85 ℃。

圖1 溫度對浸提物抑制尿素酶活性的影響Fig.1 Effect of extracts on inhabiting urease activity by temperature

2.1.2 浸提時(shí)間對浸提物抑制尿素酶活性的影響

浸提時(shí)間對浸提物抑制尿素酶活性的影響如圖2所示。浸提時(shí)間從60 min到120 min時(shí)隨著浸提時(shí)間的延長浸提物對尿素酶活性逐漸增大，當(dāng)浸提溫度從120 min到180 min時(shí)，浸提物對尿素酶活性的抑制沒有增大反而有所下降。出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因可能是，開始隨著浸提時(shí)間延長有利于活性成分從檳榔中釋放，當(dāng)時(shí)間繼續(xù)延長時(shí)，活性成分在120 min時(shí)已基本浸出，再繼續(xù)延長浸提時(shí)間反而部分活性成分被高溫破壞。進(jìn)一步證實(shí)檳榔浸提獲得活性成分可能對熱存在一定敏感性，因此檳榔浸提物具有較好抑制尿素酶活性的浸提時(shí)間為120 min。

圖2 時(shí)間對浸提物抑制尿素酶活性的影響Fig.2 Effect of extracts on inhabiting urease activity by time

2.1.3 料液比對浸提物抑制尿素酶活性的影響

料液比對浸提物抑制尿素酶活性的影響如圖3所示。浸提時(shí)間從1:15到1:27提取溶劑的量增加幾乎1倍。從圖3可以看出從1:15到1:21時(shí)，隨著料液比的增加浸提物對尿素酶活性逐漸增大，當(dāng)料液比從1:21到1:27時(shí)，浸提物對尿素酶活性的抑制沒有繼續(xù)明顯增大。出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因可能是，開始隨著料液比的增加有利于活性成分從檳榔中釋放，當(dāng)時(shí)間料液比繼續(xù)增大時(shí)，活性成分從檳榔中已基本全部浸出，再繼續(xù)增大料液比時(shí)浸提物對尿素酶的抑制率不再繼續(xù)增大?？紤]浸提物需蒸發(fā)、濃縮、干燥，溶劑量越多成本越高，因此檳榔浸提物具有較好抑制尿素酶活性的料液比為1:21。

圖3 料液比對浸提物抑制尿素酶活性的影響Fig.3 Effect of extracts on inhabiting urease activity by material-liquid ratio

2.2 正交實(shí)驗(yàn)因素與水平的確立及結(jié)果

2.2.1 正交實(shí)驗(yàn)因素和水平確立

根據(jù)單因素獲得抑制尿素酶活性的浸提因素的浸提條件，設(shè)計(jì)下列正交實(shí)驗(yàn)各因素水平如表1所示。

表1 正交實(shí)驗(yàn)各因素水平Table 1 Factors and levels of orthogonal test

2.2.2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

按照1.3.2實(shí)驗(yàn)方法和單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果確立的3因素和3水平進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)，測得檳榔浸提物對尿素酶活性的抑制率結(jié)果如表2所示。根據(jù)表2對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，三個(gè)因素的極差R可知：檳榔浸提物對尿素酶活性抑制率在3因素中，浸提溫度A因素影響最大，其次是浸提浸提時(shí)間B因素影響較大，物料液比C因素在影響浸提物抑制尿素酶活性中最小。檳榔浸提物對尿素酶活性的抑制率的最佳浸提條件組合是A3B2C3，即浸提溫度85 ℃，浸提時(shí)間120 min及料液比為1:24的浸提條件下所獲得的檳榔浸提物對尿素酶活性的抑制率最大。浸提最佳組合條件A3B2C3不存在于正交實(shí)驗(yàn)表中，因此需進(jìn)一步做驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，以A3B2C3檳榔浸提物對尿素進(jìn)行3次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)求平均值，檳榔浸提物對尿素酶活性的抑制率可達(dá)到99.06%，說明檳榔浸提物對尿素酶活性有非常強(qiáng)的抑制功能。

表2 抑制率正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 The results of orthogonal test on inhabiting rate

3 結(jié) 論

文獻(xiàn)報(bào)道已證明抑制幽門螺桿菌尿素酶活性可殺滅幽門螺桿菌在胃中的定植[5]，尋找一種天然活性成分對尿素酶活性的作用，以期探究一種新的防治幽門螺桿菌在胃中定植的新方法具有重要的價(jià)值。現(xiàn)有的抗生素治療幽門螺桿菌時(shí)，幽門螺桿已產(chǎn)生了耐藥性，使抗生素治療幽門螺桿菌的根除率逐漸降低。另外，抗生素治療為了達(dá)到理想的治療效果，加大用藥劑量和延長用藥周期，這不但增加了用藥成本，也使抗生素對人體的副作用進(jìn)一步增大。檳榔是一種常見的中草藥，檳榔具有多種藥理學(xué)功能。檳榔具有驅(qū)蟲、消積、利氣利水、利濕除疸等功效。檳榔是許多中藥復(fù)方的組成成分，如四磨湯，檳榔四消丸，柴胡舒肝丸等，可以治療多種疾病[9]。歷代本草均未記載檳榔具有毒性，按藥典記載臨床劑量配伍使用檳榔飲片未見不良反應(yīng)報(bào)道[10]。本研究發(fā)現(xiàn)，檳榔浸提物對尿素酶活性有非常強(qiáng)的抑制作用幾乎達(dá)到100%，實(shí)驗(yàn)同時(shí)證實(shí)，檳榔浸提物的抑制尿素酶活性受到浸提溫度、浸提時(shí)間和料液比的影響，其中溫度影響最大，其次是浸提時(shí)間，料液比影響較小。檳榔具有多種生理活性成分，對尿素酶活性的抑制作用活性成分尚不明確，確定其對尿素酶活性抑制作用的具體有效成分和抑制機(jī)制有待作進(jìn)一步深入研究。