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        豬皮膠原肽-鋅螯合物的制備工藝研究

        2020-06-11 03:26:24吳家勁邊智杰朱悅張學(xué)濤龐荔丹高鵬
        山東科學(xué) 2020年3期
        關(guān)鍵詞:螯合物豬皮螯合

        吳家勁,邊智杰,朱悅,張學(xué)濤,龐荔丹,高鵬

        (山東中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院,山東 濟南 250355)

        豬皮為豬科動物的皮膚,可藥食兩用。在工業(yè)應(yīng)用中,由于豬皮存在必需氨基酸的構(gòu)成欠缺、人體條件下難消化、蛋白質(zhì)生物效價低等缺點[1],除一部分應(yīng)用于皮革生產(chǎn)外,豬皮原料只有20%轉(zhuǎn)化為成品,其他大部分都變成了固體廢棄物,這極大地浪費了資源,并且嚴重污染環(huán)境[2]。豬皮蛋白質(zhì)含量豐富,降解后形成的膠原多肽,不僅具有較高的消化吸收性,還有保護胃黏膜以及降血壓、抗?jié)?、提高骨骼強度、促進皮膚膠原代謝等生理功能[3]。

        鋅是人體必需的微量元素之一,對人體健康狀況有重要的調(diào)控作用,被醫(yī)學(xué)和營養(yǎng)學(xué)界譽為“智能元素”[4]。鋅與小肽螯合形成的小肽螯合鋅具有特殊的單環(huán)螯合結(jié)構(gòu),與氨基酸螯合鋅相比,小肽螯合鋅更利于吸收,且穩(wěn)定性更強,具有良好的補鋅、抗菌、抗氧化以及提高機體免疫力的效果[5-7],極大提高了生物學(xué)效價。

        目前肽-鋅螯合物的研究大多集中在水產(chǎn)動物蛋白與鋅的螯合物上,主要有牡蠣肽鋅螯合物[8]、羅非魚鱗膠原肽鋅螯合物[9]、克氏原螯蝦殼肽鋅螯合物[10]、細點圓趾蟹肉酶解肽鋅螯合物[11]、鰱魚蛋白小肽鋅螯合物[12]等,但是對豬皮膠原肽螯合鋅的研究較少。

        本研究以豬皮為原料,采用響應(yīng)面法對豬皮膠原肽(以下簡稱豬皮肽)和硫酸鋅的螯合工藝進行考察優(yōu)化,旨在進行豬皮的深入開發(fā)研究,為今后的豬皮高值化加工利用提供理論基礎(chǔ)。

        1 儀器與材料

        1.1 試驗儀器

        PHB-4型pH計(上海雷磁儀器有限公司);HH-2型數(shù)顯恒溫水浴鍋(上海力辰邦西儀器科技公司);RE-52型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮科技有限公司);FC5513型高速離心機(上海奧豪斯離心機有限公司);JB-2型恒溫磁力攪拌器(上海雷磁儀器有限公司);HX-10型真空冷凍干燥機(上海圣科儀器有限公司);UV-1780紫外可見分光光度計(日本島津儀器有限公司)。

        1.2 試驗材料

        新鮮豬皮(濟南金鑼肉食廠);堿性蛋白酶(2000 U/mg)、菠蘿蛋白酶(2000 U/mg)(上海佛森生物科技有限公司);牛血清白蛋白(上海源葉生物科技有限公司);其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

        2 試驗方法

        2.1 豬皮肽的制備

        豬皮肽的制備方法參照文獻[13]。

        2.1.1 去雜

        取新鮮豬皮,刮去皮下雜質(zhì),-10 ℃冷凍24 h,剪刀剪成碎塊(D≤2 mm、L≤1 cm)。

        2.1.2 脫脂

        取豬皮碎塊,加入5倍量(即豬皮碎塊質(zhì)量的5倍)且質(zhì)量分數(shù)為0.3%的氫氧化鈉溶液脫脂8 h,濾去堿液,水洗至近中性,得脫脂豬皮。

        2.1.3 酶解

        脫脂豬皮勻漿8 min,加8倍量水加熱煮沸15 min,冷卻至55 ℃,轉(zhuǎn)移至旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器,加入脫脂豬皮質(zhì)量1%的堿性蛋白酶,55 ℃保溫酶解1 h,后加入1%菠蘿蛋白酶,55 ℃保溫酶解3 h,酶解液加熱煮沸15 min滅酶,過濾,濾液冷藏約12 h,離心,取上清液減壓濃縮,冷凍干燥后即得豬皮酶解原液凍干粉。

        2.2 酶解原液凍干粉肽含量的測定

        采用福林酚比色法[14],以牛血清白蛋白溶液為對照品,記錄對照品濃度和吸光度,數(shù)據(jù)進行線性回歸分析,計算凍干粉中的膠原肽質(zhì)量分數(shù)。標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=16.883X+0.229 6(R2=0.993 8),計算得豬皮肽的質(zhì)量分數(shù)為66.92%。

        2.3 螯合工藝

        螯合工藝為:新鮮豬皮→豬皮酶解液→豬皮肽→測肽含量→調(diào)pH→加一定比例硫酸鋅→恒溫持續(xù)攪拌螯合→無水乙醇沉淀→離心→定溫減壓干燥→肽鋅螯合物。

        2.4 豬皮肽-鋅螯合單因素試驗

        2.5 豬皮肽-鋅螯合響應(yīng)面試驗設(shè)計

        在單因素試驗基礎(chǔ)上,使用Design-Expert.V8.0.6.1軟件,進行4因素3水平的響應(yīng)面分析試驗,以螯合率為指標(biāo),考察豬皮肽-鋅質(zhì)量比(x1)、螯合pH(x2)、螯合溫度(x3)、螯合時間(x4)對螯合工藝的影響。響應(yīng)面試驗因素水平編碼見表1。

        表1 響應(yīng)面試驗因素水平編碼表Table 1 Response surface method factor level

        2.6 螯合率的測定

        采用乙二胺四乙酸(EDTA)絡(luò)合滴定法[15]。稱取一定量的豬皮肽螯合鋅粉末,置于100 mL燒杯中,加50 mL水和數(shù)滴6 mol/L的鹽酸,超聲至溶解完全,冷卻定容至100 mL,取10 mL于三角瓶,加入10 mL NH3-NH4Cl( pH=10)緩沖液,鉻黑T指示劑2~3滴,用0.02 mol/L Na2EDTA溶液滴定至由酒紅色變?yōu)樗{色,記錄滴定消耗毫升數(shù),每份樣品溶液平行測定3次,取平均值,計算鋅離子螯合率。

        (1)

        (2)

        式中:M1為小肽螯合鋅中鋅離子的質(zhì)量;c為EDTA標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度,mol/L;V0為空白試驗消耗Na2EDTA的體積,mL;V1為測定時平均消耗Na2EDTA的體積,mL。

        3 結(jié)果與分析

        3.1 單因素試驗結(jié)果分析

        3.1.1 螯合溫度對螯合率的影響

        由圖1可知,溫度升高,螯合率先增加后減??;0~50 ℃時,兩者呈正相關(guān)關(guān)系,最適溫度在50 ℃附近,此時螯合率最大;大于50 ℃,溫度升高,螯合率隨之減小,可能因溫度偏高,致使部分螯合物結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性[16]變差,部分螯合物分解使螯合率有所下降,所以最佳螯合溫度為50 ℃。

        圖1 螯合溫度對螯合率的影響Fig. 1 Effect of temperature on chelating rate

        3.1.2 螯合時間對螯合率的影響

        由圖2可知,隨著反應(yīng)的進行,螯合率先迅速增大后趨于不變。在0~50 min范圍內(nèi),肽鋅反應(yīng)物濃度和接觸面積都比較大,所以前期反應(yīng)速度較快;但隨著反應(yīng)物濃度的下降,反應(yīng)逐漸接近飽和,所以反應(yīng)后期螯合率趨于不再增加,說明50 min時螯合反應(yīng)已基本完成。在螯合時間為50 min時,螯合率趨于平穩(wěn),可作為最佳螯合時間。

        圖2 螯合時間對螯合率的影響Fig. 2 Effect of time on chelating rate

        3.1.3 螯合pH對螯合率的影響

        由圖3可知,pH增大,螯合率隨之先上升后下降。pH<7.0時,螯合率隨pH增大一直增加,在pH=7.0時,螯合率最大。當(dāng)pH>7.0時,鋅離子會發(fā)生沉淀,導(dǎo)致游離的鋅離子減少,因此螯合率隨pH增大一直減小。由此可見,肽鋅螯合物的等電點可能在pH=7.0附近,此時酸堿對螯合物的影響較小[17],所以最佳螯合pH為7.0。

        圖3 螯合pH對螯合率的影響Fig. 3 Effect of pH on chelating rate

        3.1.4 豬皮肽-鋅質(zhì)量比對螯合率的影響

        圖4 豬皮肽-鋅質(zhì)量比對螯合率的影響Fig. 4 Effect of mass ratio of pigskin peptide and zinc on chelating rate

        3.2 豬皮肽-鋅螯合工藝響應(yīng)面優(yōu)化試驗

        3.2.1 響應(yīng)面試驗結(jié)果與方差分析

        根據(jù) Box-Benhnken試驗設(shè)計原理,以肽鋅螯合率為響應(yīng)指標(biāo),以螯合肽-鋅質(zhì)量比(x1)、pH(x2)、溫度(x3)、時間(x4)為響應(yīng)變量,進行響應(yīng)面優(yōu)化試驗,響應(yīng)面組合試驗設(shè)計及結(jié)果見表2,方差分析見表3。

        表2 響應(yīng)面組合設(shè)計試驗及結(jié)果Table 2 Design and result of response surface method combination

        續(xù)表2

        表3 回歸模型方差分析結(jié)果Table 3 Variance analysis results of regression model

        注:P<0.05,表明差異顯著;P<0.01,表明差異極其顯著。

        4個因素與指標(biāo)螯合率之間的響應(yīng)面回歸模型為:y=69.32+4.30x1-4.19x2+2.98x3+2.26x4-2.18x1x2+0.28x1x3+0.35x1x4+0.44x2x3-0.39x2x4+0.45x3x4-9.22x12-9.15x22-6.34x32-4.31x42。

        由表3可知,模型P<0.000 1,表示該模型極顯著,失擬項P=0.073 1>0.05差異不顯著,回歸模型無失擬因素。模型R2=0.964 2,證明響應(yīng)面回歸模型與實際試驗擬合度較高,模型預(yù)測值與試驗實際測量值相關(guān)性較好,各因素與響應(yīng)值螯合率之間存在顯著的線性關(guān)系,可用于豬皮膠原肽-鋅螯合工藝的分析預(yù)測。各因素中一次項x1、x2、x3、x4均為顯著影響(P<0.05),其中豬皮肽-鋅質(zhì)量比和pH對螯合率的影響最為顯著,各因素對螯合率影響程度由大到小的順序為:豬皮肽-鋅質(zhì)量比,pH,溫度,時間。二次項x12、x22為極顯著影響(P<0.000 1),二次項x32、x42為顯著影響(P<0.05),交互項x1x2、x1x3、x1x4、x2x3、x2x4、x3x4的交互作用對螯合率的影響不是很顯著。

        3.2.2 響應(yīng)面分析

        圖5 各因素對螯合率影響的響應(yīng)曲面Fig. 5 The response surface for the chelating rate affected by various factors

        由圖5(d)可知,螯合pH與螯合溫度兩因素有較強的交互作用,螯合pH對螯合率的影響顯著。螯合pH對響應(yīng)值的影響大于螯合溫度。隨著螯合pH和螯合溫度的增加,螯合率逐漸增大然后減小。這與肽-鋅螯合物的等電點和穩(wěn)定性有關(guān),pH大于或小于7.0都不利于豬皮膠原肽-鋅螯合物的生成。所以當(dāng)螯合pH 7.0,螯合溫度50 ℃時,螯合率達到最大值。

        由圖5(e)可知,螯合pH與螯合時間兩因素有一定的交互作用,螯合pH對螯合率的影響較顯著。螯合pH對響應(yīng)值的影響大于螯合時間。隨著螯合pH和螯合時間的增加,螯合率逐漸增大然后減小,這與肽-鋅螯合物的等電點和螯合過程中水分的蒸發(fā)有關(guān)。當(dāng)螯合pH 7.0,螯合時間50 min時,螯合率達到最大值

        由圖5(f)可知,螯合溫度與螯合時間兩因素交互作用不顯著,對螯合率的影響作用較小。螯合溫度對響應(yīng)值的影響大于螯合時間。隨著螯合溫度和螯合時間的增加,螯合率逐漸增大然后減小,這與肽-鋅螯合物的穩(wěn)定性和螯合過程中水分的蒸發(fā)有關(guān)。當(dāng)螯合溫度50 ℃,螯合時間50 min時,螯合率達到最大值。

        綜合圖5(a~f)可知,豬皮肽-鋅質(zhì)量比和螯合pH對螯合率的影響最為顯著,螯合時間和溫度對螯合率的影響相比較小,豬皮肽-鋅質(zhì)量比和pH過高或過低都會導(dǎo)致螯合率降低,這與方差分析結(jié)果一致,表明模型顯著可行。

        3.3 最佳螯合工藝驗證試驗

        4 結(jié)論

        致謝:本文在山東中醫(yī)藥大學(xué)創(chuàng)新訓(xùn)練平臺上完成。感謝山東中醫(yī)藥大學(xué)的支持與幫助,感謝姜珊和王常噒的指導(dǎo)。

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