姜 曌，徐 典，李 力△

1．空軍軍醫(yī)大學西京醫(yī)院神經內科(西安710032)；2．空軍軍醫(yī)大學口腔醫(yī)院綜合科(西安710032)

視神經脊髓炎譜系疾病(Neuromyelitis optica spectrum disorders,NMOSD)是一種中樞神經系統(tǒng)的自身免疫性疾病，該病病情兇險且容易復發(fā)，給患者的神經系統(tǒng)造成嚴重的功能損傷。在NMOSD的治療中，維護階段的治療尤為重要。有綜述指出，維護期B細胞數(shù)量超過總淋巴細胞計數(shù)的0.1%時NMOSD易復發(fā)，推薦以CD20+B細胞、CD19+/CD27+B細胞的數(shù)量來判斷NMOSD復發(fā)的可能性[1]。目前在臨床中使用利妥昔單抗(Rituximab，RTX)來治療NMOSD效果較好。雖然該藥物是CD20+淋巴細胞的抑制劑，但是在臨床發(fā)現(xiàn)使用該藥物的患者單核細胞比例、CD19+B細胞和CD19+/CD27+B細胞的數(shù)量均會下降，而這些數(shù)據(jù)被認為是NMOSD發(fā)作或復發(fā)的指標。目前在中國患者人群中，上述免疫細胞的比值對于NMOSD發(fā)作的閾值鮮有報道。本研究旨在回顧NMOSD患者發(fā)病時上述免疫細胞的監(jiān)測數(shù)據(jù)及其隨著利妥昔單抗治療后的變化，以期確定適合中國人群的NMOSD復發(fā)指標和治療方案。

對象與方法

1 研究對象 本研究屬于回顧性隊列研究，通過西京醫(yī)院電子病例系統(tǒng)查閱、過濾并收集NMOSD復發(fā)患者的基本信息、影像學資料、實驗室檢查數(shù)據(jù)、用藥方案、治療效果等臨床資料。本研究已通過西京醫(yī)院倫理委員會討論并獲準進行。最終共收集到2016年1月至2018年4月在空軍軍醫(yī)大學西京醫(yī)院神經內科住院治療的NMOSD復發(fā)患者18例，其中男性3例，女性15例；年齡16～64歲，復發(fā)時發(fā)病時間≤1周，平均年齡(38.9±14.8)歲。病例納入標準：①年齡15～70歲；②臨床表現(xiàn)符合2015版NMOSD診斷共識[2]；③患者及其家屬在充分了解病情、治療方案及可能出現(xiàn)的醫(yī)療結局的前提下，同意參與研究與并簽署知情同意書；④患者基本資料、各項檢查結果及治療效果等臨床資料完整。排除標準：①患有其他自身免疫疾病；②入院前3個月內已經接受糖皮質激素、免疫球蛋白或免疫抑制劑治療；③患有重癥肌無力、癲癇、腦血管疾病、顱內感染性疾病、神經系統(tǒng)腫瘤等。

2 研究方法

2.1 實驗室檢查：入院后清晨采集空腹靜脈血，檢測分析單核細胞比例、CD19+B細胞比例、CD19+/CD27+B細胞比值。完成腰穿檢查，采用間接免疫熒光法(Indirect immunofluorescence，IIF)試劑盒(德國歐蒙公司)，主要檢查血清及腦脊液水通道蛋白-4抗體(AQP4-IgG)、腦脊液白蛋白/血清白蛋白(Cerebrospinal/serum albuminratio,QALB)、24 h鞘內IgG合成率等生化指標。

2.2 神經影像學檢查：入院期間接受頭顱、頸椎、腰椎MRI及其增強檢查，完善視覺誘發(fā)電位(Visual evoked potential,VEP)和腦干聽覺誘發(fā)電位(Brain stem auditory evoked potential,BAEP)檢查。

2.3 治療方案：對癥支持治療的同時積極進行免疫治療，具體方案為：甲強龍1 g/d，連續(xù)5 d；靜脈注射免疫球蛋白(Intravenous immunoglobulin，IVIG)0.4 g/(kg·d),連續(xù)5 d；二線免疫治療方案為：利妥昔單抗(Rituximab，RTX)，劑量為每周375 mg/m2，持續(xù)進行4周。

結 果

1 各項免疫細胞檢查及分析結果 患者入院時進行單核細胞比例、CD19+B細胞比例和CD19+/CD27+B細胞比例檢查，見表1。因CD19+B細胞比例和CD19+/CD27+B細胞比例差異較大，故采取負對數(shù)轉換后進行95%可信區(qū)間的單尾分析。根據(jù)目前樣本量分析，患者復發(fā)時CD19+B細胞比例的95%可信區(qū)間下限值為0.0060，CD19+/CD27+B細胞比例的95%可信區(qū)間下限值為0.0115。見表2。

2 實驗室檢查結果 18例患者中AQP4-IgG陽性患者14例，陰性患者4例，與性別相關(P=0.043)，與年齡分布未發(fā)現(xiàn)統(tǒng)計學關聯(lián)(P=0.307)。72.2% (13/18)的患者腦脊液白細胞均升高(>5×106/L)，其中11.1% ( 2/18) 患者腦脊液白細胞大于50×106/L。腦脊液蛋白平均56.2 mg/dl(3.2～243 mg /dl)。 9例患者( 9/18，50% ) 24 h鞘內 IgG合成率升高。在AQP4-IgG陽性患者中，顱內MRI檢查異常占78.6%(11/14)，脊髓MRI檢查異常者占71.4%(10/14)，兩者同時存在特征性病變者占到50.0%(7/14)；AQP4-IgG陰性患者4例，其中MRI檢查顱內特征性改變者占50.0%(2/4)，脊髓MRI檢查異常占75.0%(3/4)，兩者同時存在特征性病變者占25.0%(1/4)，典型影像學表現(xiàn)見圖1。VEP異常的患者占83.3%(15/18)，其中AQP4-IgG陽性患者為92.9%(13/14)，陰性患者為50.0%(2/4)；BAEP異?；颊咻^少，僅為16.7%(3/18)；VEP與BAEP均異?；颊邇H有1例。見表3。

表1 入組患者入院時各項免疫細胞檢查結果

表2 患者免疫細胞數(shù)據(jù)分析

注：*CD19+B細胞比例、CD19+/CD27+B細胞比例原始數(shù)據(jù)做負對數(shù)轉換后統(tǒng)計，為單尾95%可信區(qū)間下限值

表3 18例NMOSD復發(fā)患者臨床特點比較

注：ON：視神經炎

3 治療結果 全部18例患者在對癥治療和免疫治療的基礎上，均接受RTX治療，劑量為每周375 mg/m2，持續(xù)4周。治療結束時，有15例患者臨床癥狀明顯改善(15/18，83.3%)，3例患者(3/18，16.7%)臨床癥狀得到緩解。

4 隨訪時接受外周血免疫細胞細胞監(jiān)測結果 本研究18例患者中，有5例患者出院后接受了隨訪和復查，并在隨訪時接受外周血CD19+/CD27+B細胞檢測。具體如圖2所示，可見接受利妥昔單抗治療后的15 d內，患者外周血CD19+/CD27+B細胞比例顯著降低，治療結束時(距復發(fā)時1個月)，除1例外，其余患者CD19+/CD27+B細胞比例均降低至0.005以下；隨訪3個月時5例患者外周血CD19+/CD27+B細胞水平均無升高。

雙側大腦半球對稱，灰白質對比自然，腦橋背側見小片狀稍長T2信號影，F(xiàn)LAIR序列呈稍高信號，DWI序列呈稍高信號(A、B、D、E、F中白色箭頭)；第4、5頸椎脊髓可見信號改變(C中白色箭頭)

圖1 典型患者影像學表現(xiàn)

圖2 隨訪5例患者外周血內CD19+/CD27+B細胞比例變化

討 論

視神經脊髓炎(Neuromyelitis optica，NMO)是一種免疫介導的中樞神經系統(tǒng)(Central nervous system，CNS)炎性脫髓鞘疾病[3-4]。NMO臨床表現(xiàn)為嚴重的視神經炎(Optic neuritis,ON)和縱向延伸的長節(jié)段橫貫性脊髓炎(Longitudinally extensive transverse myelitis，LETM)，以青壯年女性多發(fā)，具有很高復發(fā)率及致殘率[5]。其病因主要與水通道蛋白4(Water channel aquaporin-4，AQP-4)抗體(AQP4-IgG)相關[6-7]。隨著臨床研究的深入，NMO的臨床特征不單單局限于視神經和脊髓表現(xiàn)，而是與室管膜周圍AQP-4高表達區(qū)域密切相關，呈現(xiàn)一系列中樞神經系統(tǒng)脫髓鞘病變疾病譜。國際NMO診斷小組將NMO相關的一系列癥候群命名為視神經脊髓炎譜系疾病(NMOSD)并制定了相應的診斷細則[2]。本病尚無特效藥物，是神經病學領域的研究重點疾病之一。

本研究采用IIF試劑盒(德國歐蒙公司)，對患者腦脊液進行基于細胞底物(Cell based assay，CBA)和基于組織底物(Tissue based assay,TBA)聯(lián)合檢測，具有較高的敏感度和特異度，因而廣泛用于腦脊液中相關生化指標和抗體的檢測[8]。發(fā)現(xiàn)72.2% (13/18)的患者腦脊液白細胞升高(>5×106/L)，與Bergamaschi等[9]報道79%的腦脊液白細胞升高率接近，但目前的診療指南認為該項指標的變化不具備特異性，僅作為臨床參考。本研究77.8%(14/18)的NMOSD患者AQP4-IgG陽性，與Waters等人的研究一致[10]。AQP4-IgG陰性的患者通常被認為預后相對較好[11]。統(tǒng)計分析顯示，患者性別分布和VEP陽性檢出率均與AQP4-IgG陽性率呈正相關(P<0.05)，其他臨床特征與AQP4-IgG陽性率未發(fā)現(xiàn)有統(tǒng)計學聯(lián)系見表3，可能是因為本研究中AQP4-IgG陰性的患者數(shù)量太少，不足以說明患者臨床特征的分布規(guī)律。

NMOSD患者的典型MRI表現(xiàn)為病變節(jié)段可大于1/2視神經長度及視交叉。急性期時視神經增粗、強化，視神經鞘亦可見強化。慢性期可見視神經萎縮，呈現(xiàn)“雙軌征”。脊髓病變典型表現(xiàn)為較長的、縱向延伸的長節(jié)段橫貫性損害(超過三個椎體節(jié)段)，矢狀位多表現(xiàn)連續(xù)病變，多累及脊髓后索中央灰質和部分白質。急性期出現(xiàn)明顯腫脹，呈長T1長T2表現(xiàn)；慢性期脊髓呈現(xiàn)萎縮、空洞，長節(jié)段病變可轉變?yōu)椴贿B續(xù)的長T2信號[12]。張植等[13]研究發(fā)現(xiàn)，AQP4-IgG(+)患者中43.9%(43/98)存在顱內病灶，且脊髓病變多位于頸段，與Havla等[14]的研究類似。本研究中顱內(11/14，78.6%)及脊髓(10/14，71.4%)MRI檢查異常表現(xiàn)與我國NMOSD臨床診療指南中相關描述基本符合，但是MRI異常的發(fā)生率均高于上述國內外學者的研究，可能是由于本研究的對象均為NMOSD復發(fā)患者，再次發(fā)病時神經系統(tǒng)的影像學病變表現(xiàn)更為突出。

VEP可以檢查從視網膜到枕葉皮質的視覺神經通路的功能，其中P100的潛伏期延長反映了視神經軸突存在脫髓鞘病變，說明視神經的傳導速度變慢[15]，而波幅的改變反映病變的視神經傳導完全阻滯[16]。VEP的P100潛伏期幅度較小被認為是NMOSD的典型表現(xiàn)[17]。本研究中納入病例均為NMOSD復發(fā)病例，故MRI檢查發(fā)現(xiàn)視神經異常者，其VEP也均有不同程度的異常變化，并且VEP的異常與AQP4-IgG呈統(tǒng)計學關聯(lián)(P=0.043)，即AQP4-IgG陽性患者中VEP異常的比例更高。BAEP可以反映聽覺傳導通路是否完整及評價患者的聽力狀況。Ohnari等研究發(fā)現(xiàn)雖然部分NMOSD患者的BAEP正常，但是VEP存在明顯異常，提示VEP與BAEP聯(lián)合檢查有助于NMOSD的診斷[18]。本研究中，BAEP的異常與AQP4-IgG不具有統(tǒng)計學關聯(lián)(P=0.612)，BAEP異常的患者僅有3例(3/18,16.7%)，但是其中有一例患者AQP4-IgG陰性，MRI僅發(fā)現(xiàn)頸段脊髓連續(xù)病變；但VEP與BAEP同時出現(xiàn)異常，可能是受到MRI分辨率的限制，無法發(fā)現(xiàn)顱內異常，而VEP和BAEP檢查則可能同時發(fā)現(xiàn)異常，說明VEP聯(lián)合BAEP檢查對NMOSD的臨床診斷具有鑒別意義。

免疫細胞的表達水平對神經系統(tǒng)疾病，特別是對中樞神經系統(tǒng)自身免疫性疾病的嚴重程度和預后均有顯著影響[19-20]。所以針對B細胞介導的免疫過程，新型靶向免疫抑制藥物越來越多地被用來治療和預防NMOSD復發(fā)。RTX是針對B淋巴細胞特異性表面抗原CD20研制的人鼠嵌合的IgG1單克隆抗體，于2005年首次應用于預防NMO復發(fā)并取得良好的臨床效果[21]。但是RTX用于預防NMOSD復發(fā)的具體使用方法和用藥指征目前尚無定論[22]，主要有如下幾種方案：

第一種：每6～9個月用藥一次，劑量同初始治療[23]。此方案沒有檢查指標作為用藥依據(jù)，缺乏循證醫(yī)學證據(jù)支持，僅憑醫(yī)生經驗或患者的癥狀確定預防用藥時機，主觀性過大。

第二種：以外周血CD19+B細胞數(shù)量為參考。若CD19+B細胞比例≥0.01時，重復輸注RTX 100 mg/周，連續(xù)輸注3周[24]；或者發(fā)病時給予每周100 mg/m2，連用3周，后每2個月復查外周血CD19+B細胞數(shù)量，如超過0.01時，再給予100 mg/m2一次[25]。在本研究中，根據(jù)18例患者復發(fā)入院時CD19+B細胞比例最低值為0.001，經過統(tǒng)計學分析，復發(fā)時CD19+B細胞比例的95%可信區(qū)間最低為0.0105，與上述學者的研究結果相似，說明我國人群NMOSD患者的CD19+B細胞比例如果高于0.0105，其復發(fā)可能性大于95%。

第三種：以外周血CD19+/CD27+記憶性B細胞數(shù)量為用藥依據(jù)。按 375 mg/m2(體表面積)，靜脈滴注，每周1次，連用4周[26]。Kim SH等人對30例NMOSD復發(fā)患者進行了隨訪觀察：前2年，當外周血CD19+/CD27+記憶性B細胞比例超過0.0005時，給予RTX治療，劑量為375 mg/m2；在此之后，如外周血中CD19+/CD27+記憶性B細胞比例超過0.001則需要再給予RTX，劑量同前[27]。

本研究采用利妥昔單抗每周375 mg/m2，持續(xù)4周的治療方案。這也是目前被臨床采用較多的治療方案。治療結束時，有15例患者臨床癥狀明顯改善(15/18，83.3%)，3例患者(3/18，16.7%)臨床癥狀得到緩解。有5例患者接受了隨訪并進行了外周血CD19+/CD27+B細胞監(jiān)測。利妥昔單抗治療后的15 d內，患者外周血CD19+/CD27+B細胞比例顯著降低，治療結束時(距復發(fā)時1個月)，除1例外，其余患者CD19+/CD27+B細胞比例均降低至0.005以下，隨訪3個月后，5名患者的CD19+/CD27+B細胞比例均無升高。雖然本研究采用的RTX治療方案取得相對良好的治療效果，但是隨訪的患者數(shù)量較小，論證級別有限，所以目前利妥昔單抗治療 NMOSD 的治療劑量以及防止復發(fā)的治療時機均尚需進一步研究證實[22]。

自身反應性記憶性B細胞激活后產生抗原特異性反應，這種記憶效應可能持續(xù)很長時間，從而誘導NMOSD復發(fā)[28]。因此很多臨床研究關注于刪除記憶性B細胞。Kim SH等[29]研究發(fā)現(xiàn)，NMOSD復發(fā)多發(fā)生于CD19+/CD27+記憶性B細胞回升之后。隨訪5年后，絕對危險度降低率(Absolute risk reduction,ARR)由治療前的2.4±1.5下降為治療后的0.3±1.0；18例患者(60%)在5年的隨訪期內沒有復發(fā)；28例患者的致殘程度均無加重，且沒有觀察到嚴重的副作用出現(xiàn)。所以Kim SH等認為，在RTX治療中CD19+/CD27+記憶性B細胞比例可以作為NMOSD復發(fā)的參考指標。經過外周血B細胞刪除治療后，如CD19+/CD27+記憶性B細胞比例超過0.001，應及時給予RTX治療，以避免復發(fā)。本研究也以CD19+/CD27+記憶性B細胞比例作為判斷RTX是否需要重新輸注臨床依據(jù)，NMOSD患者復發(fā)時CD19+/CD27+B細胞比例的最低值為0.013，其95%可信區(qū)間的下限值為0.0115，與Kim SH等建議的0.001(即0.1%)差距較大?？赡苁且驗楸狙芯繉儆诨仡櫺匝芯浚虢M時患者已經出現(xiàn)NMOSD復發(fā)癥狀，此時CD19+/CD27+B細胞比例已經上升并超過了Kim SH等建議的0.001警戒值，加之樣本量較小，所以出現(xiàn)了近10倍的差異，但是這也充分說明CD19+/CD27+B細胞比例作為免疫系統(tǒng)表達增強的指標，對NMOSD復發(fā)的預警具有十分重要意義。

NMOSD患者外周血中相關淋巴細胞比例是疾病復發(fā)的重要參考指標，當外周血中CD19+/CD27+B細胞比例超過0.0115，或CD19+B細胞比例超過0.006，應采取免疫靶向藥物對相應淋巴細胞進行清除治療。以上指標可以作為臨床醫(yī)師治療NMOSD和預防復發(fā)的參考，使臨床醫(yī)師在制定治療方案時兼顧NMOSD復發(fā)的預防和患者經濟負擔的減輕。而目前針對RTX用于預防NMOSD復發(fā)的使用指征目前尚無明確共識，其檢測指標和啟動預防性用藥的閾值均有待于完善設計的臨床對照試驗加以論證。