劉翔宇，王凌云

山東省濟(jì)寧市第一人民醫(yī)院消化內(nèi)科(濟(jì)寧 272000)

肝纖維化是肝臟對(duì)反復(fù)發(fā)生的慢性肝損傷的治愈過程，包括病毒感染、膽汁淤積性肝病、酗酒、非酒精性脂肪性肝炎、非酒精性脂肪肝以及一些藥物的副作用[1-3]。其特點(diǎn)是細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)過度沉積，形成纖維性瘢痕，引起肝功能障礙，可能發(fā)展為肝硬化和肝癌。幸運(yùn)的是，如果去除主要的致病因素，肝纖維化是一個(gè)可逆的過程，但這總是困難和費(fèi)時(shí)的。目前治療肝纖維化最有效的方法是肝移植。然而，由于器官供體的限制，肝移植并不普及。因此，有必要尋找一種新的治療肝纖維化的藥物，以減輕肝功能障礙和減少并發(fā)癥[4-5]。

對(duì)肝纖維化的發(fā)病機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)，肝星狀細(xì)胞(Hepatic stellate cell， HSCs)的活化是其發(fā)病的關(guān)鍵。在健康的肝臟中，HSCs定位于Disse空間，具有靜止表型(qHSCs)[4]；當(dāng)肝臟損傷刺激后，Kupffer細(xì)胞和其他間充質(zhì)細(xì)胞被激活并分泌多種促纖維化細(xì)胞因子，包括轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(TGF-β1)、血小板衍生生長(zhǎng)因子(PDGF)和表皮生長(zhǎng)因子(EGF)，導(dǎo)致肝星狀細(xì)胞的激活。激活的HSCs (aHSCs)經(jīng)過一系列的活化反應(yīng)，導(dǎo)致ECM過度積聚和肝纖維化[6]。除ECM沉積外，肝損傷與血管生成有關(guān)。此外，由于組織缺氧，血管生成和纖維生成總是與慢性肝病并行發(fā)展。病理性血管生成加劇了結(jié)構(gòu)紊亂，而不是緩解。據(jù)報(bào)道，酪氨酸激酶抑制劑，如舒尼替尼或索拉非尼抑制血管生成，可改善嚙齒類動(dòng)物的肝纖維化。因此，血管生成也是治療肝纖維化的重要靶點(diǎn)[7]。

環(huán)杷明是一種從藜蘆屬植物中提取的甾體生物堿，在大量的臨床前研究中顯示出了良好的抗癌作用。它是Hedgehog (HH)信號(hào)通路的抑制劑。HH信號(hào)通路的異常激活導(dǎo)致了多種人類疾病的發(fā)生，如結(jié)直腸癌、肺癌和乳腺癌[8]。臨床上我們發(fā)現(xiàn)環(huán)杷明對(duì)肝纖維化具有調(diào)控作用，但具體調(diào)控作用機(jī)制不清楚。因此本研究的目的在于闡明環(huán)杷明對(duì)肝纖維化的調(diào)控作用機(jī)制。

材料和方法

1 材 料 戊巴比妥鈉鹽、環(huán)杷明、磷酸鹽緩沖液(PBS)、維生素D3、白藜蘆醇、姜黃素購(gòu)買于Sigma-Aldrich (Merck KGaA)。無水乙醇、二甲苯、Masson染液套裝、分化液、HE染液、 中性樹膠、CCl4購(gòu)于中國(guó)國(guó)藥控股國(guó)際公司。GAPDH、α-SMA、CollagenⅠ、TGF-β1、ALT試劑盒和AST試劑盒購(gòu)于SANTACRUZ BIOTECHNOLOGY。

2 研究方法

2.1 肝纖維化小鼠模型構(gòu)建和藥物干預(yù)：準(zhǔn)備20% CCl4的油劑溶液(CCl4∶橄欖油=1∶4)，3 d一次對(duì)小鼠進(jìn)行皮下注射，注射量按5 ml/kg進(jìn)行，連續(xù)4周；對(duì)照組注射同等劑量橄欖油溶劑。

第4周開始，對(duì)模型組分別進(jìn)行環(huán)杷明5或10 mg/(kg·d)皮下注射、維生素D33 ng/(100g·d)皮下注射、白藜蘆醇200 mg/(kg·d)灌胃、姜黃素 400 mg/(kg·d)灌胃。第8周，戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉小鼠，眼眶取血后常溫放置30 min，1800 r/min離心5 min取上清，冷凍-80℃保存；取肝組織分別進(jìn)行4%多聚甲醛固定和-80℃冷凍保存。

2.2 生化指標(biāo)檢測(cè):小鼠血清ALT和AST檢測(cè)按照說明書進(jìn)行操作。

2.3 免疫組化檢測(cè):對(duì)固定的肝臟組織進(jìn)行切片和石蠟包埋，并切成4 μm厚的切片，進(jìn)行CD31、α-SMA和Masson染色。顯微鏡鏡檢，圖像采集分析。

2.4 Western blotting:提取總蛋白，標(biāo)定后進(jìn)行SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉，然后進(jìn)行VEGF、CD31、α-SMA、CollagenⅠ和TGF-β1染色，對(duì)結(jié)果進(jìn)行拍照、收集、分析。GAPDH為內(nèi)參蛋白。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 連續(xù)變量用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。使用Graph Pad Prism軟件5.0版(Graph Pad,La Jolla,CA,USA)對(duì)多組比較進(jìn)行單向方差分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 環(huán)杷明可顯著抑制CCl4誘導(dǎo)的肝損傷和纖維化 對(duì)導(dǎo)致肝損傷的血清標(biāo)記蛋白ALT和AST進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，相對(duì)對(duì)照組，CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化小鼠模型血清中ALT和AST表達(dá)上調(diào)，環(huán)杷明、維生素D3、白藜蘆醇、姜黃素等治療后均可抑制ALT和AST表達(dá)(P<0.001)，其中環(huán)杷明治療效果最好，且環(huán)杷明10 mg/kg濃度治療效果好于5 mg/kg。提示環(huán)杷明治療可顯著降低CCl4誘導(dǎo)的小鼠肝損傷，如圖1A和1B所示。對(duì)肝組織進(jìn)行Masson染色發(fā)現(xiàn)，CCl4誘導(dǎo)下顯著促進(jìn)了膠原蛋白沉積，環(huán)杷明、維生素D3、白藜蘆醇、姜黃素等治療后均可抑制膠原蛋白沉積，其中環(huán)杷明治療效果最好，且環(huán)杷明10 mg/kg濃度治療效果好于5 mg/kg。提示環(huán)杷明治療可顯著降低CCl4誘導(dǎo)的小鼠肝纖維化。如圖1C所示。

2 環(huán)杷明可顯著抑制肝星狀細(xì)胞激活和肝血管生成 對(duì)肝組織中血管形成標(biāo)記蛋白CD31進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，相對(duì)對(duì)照組，CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化小鼠模型肝組織中CD31表達(dá)上調(diào)，環(huán)杷明治療后可顯著抑制肝組織中CD31表達(dá)，且環(huán)杷明10 mg/kg濃度治療效果好于5 mg/kg (P<0.001)。如圖2A和2B所示。對(duì)導(dǎo)致肝損纖維化的肝星狀細(xì)胞激活標(biāo)記蛋白α-SMA進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，相對(duì)對(duì)照組，CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化小鼠模型肝組織中α-SMA表達(dá)上調(diào)，環(huán)杷明治療后可顯著抑制肝組織中α-SMA表達(dá)，且環(huán)杷明10 mg/kg濃度治療效果好于5 mg/kg。如圖2A和2C所示(P<0.001)。提示環(huán)杷明治療可顯著降低CCl4誘導(dǎo)的小鼠肝組織中血管生成和肝星狀細(xì)胞激活。

圖1 ELISA檢測(cè)血清中ALT(A)、AST(B) 表達(dá)及肝組織纖維化(C)

圖2 免疫組化檢測(cè)肝組織中CD31、α-SMA表達(dá)(A)及對(duì)CD31(B)、α-SMA(C)相對(duì)表達(dá)量的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

3 環(huán)杷明可顯著抑制血管形成和纖維化相關(guān)蛋白表達(dá) 見圖3。相對(duì)對(duì)照組，CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化小鼠模型肝組織VEGF表達(dá)上調(diào)，環(huán)杷明可顯著抑制肝組織VEGF表達(dá)，且環(huán)杷明10 mg/kg療效好于5 mg/kg。對(duì)α-SMA、CollagenⅠ和TGF-β1檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，相對(duì)對(duì)照組，CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化小鼠模型肝組織中α-SMA、Collagen Ⅰ和TGF-β1表達(dá)上調(diào)，環(huán)杷明治療可顯著抑制肝組織中α-SMA、CollagenⅠ和TGF-β1表達(dá)，且環(huán)杷明10 mg/kg療效好于5 mg/kg。提示環(huán)杷明治療可顯著降低CCl4誘導(dǎo)的小鼠肝組織中血管生成和纖維化。

圖3 Western blot檢測(cè)肝組織中VEGF、α-SMA、CollagenⅠ和TGF-β1表達(dá)

討 論

肝纖維化是一個(gè)世界性的嚴(yán)重健康問題，因?yàn)楦卫w維化是一切慢性肝病的基礎(chǔ)，最終會(huì)發(fā)展為肝硬化，甚至是肝癌[9]。目前常見的纖維化方法有免疫抑制劑、抗炎因子、PPARγ受體激動(dòng)劑等[10]。在肝纖維化的發(fā)生發(fā)展和逆轉(zhuǎn)過程中，肝星狀細(xì)胞活化，成為肌成纖維細(xì)胞活化和增殖的最大貢獻(xiàn)者[11]。在正常肝臟中，肝星狀細(xì)胞維持ECM的產(chǎn)生和降解，維持ECM沉積的平衡，然而，在肝纖維化中，靜止?fàn)顟B(tài)下的肝星狀細(xì)胞過度激活成激活狀態(tài)的肝星狀細(xì)胞，導(dǎo)致了ECM的過度沉積，特別是膠原蛋白[12]。

HH信號(hào)通路由三種HH 配體即Sonic hedgehog(Shh)、India hedgehog(Ihh)和 Desert hedgehog(Dhh)，兩個(gè)跨膜受體蛋白Patched (Ptch)1 和Smoothened (Smo)，以及三個(gè)核轉(zhuǎn)錄因子Gli1、Gli2和 Gli3組成[13]。有實(shí)驗(yàn)表明，在HSC活化過程中HH信號(hào)通路被激活，而抑制HH信號(hào)的活性可導(dǎo)致HSC的增殖被抑制且分化過程被部分阻止[14]。同時(shí)活化的Gli還能通過激活PDGF、TGFβ/Smad等信號(hào)通路，促進(jìn)HSC的活化[14]。目前發(fā)現(xiàn)環(huán)杷明可抑制HH信號(hào)通路中的 Smo蛋白[13]；姜黃素能阻斷HH、ERK信號(hào)通路[15]；白藜蘆醇可抑制HH信號(hào)通路成員Gli1、Ptch和 cyclin D1mRNA的表達(dá)[16]，維生素D亦有抑制Hh信號(hào)通路致GLi1表達(dá)下調(diào)的作用[17]。

本課題研究發(fā)現(xiàn)，環(huán)杷明、維生素D3、白藜蘆醇和姜黃素均可有效降低CCl4誘導(dǎo)的小鼠的轉(zhuǎn)氨酶水平(AST、ALT)，同時(shí)抑制肝組織纖維化。證實(shí)環(huán)杷明抑制了VEGF介導(dǎo)的血管生成，同時(shí)環(huán)杷明可抑制TGF-β1等誘導(dǎo)的肝星狀細(xì)胞活化和ECM沉積，從而逆轉(zhuǎn)肝纖維化的進(jìn)展。有研究表明，環(huán)杷明的抗纖維化作用與其抑制HH信號(hào)通路有關(guān)，白藜蘆醇、姜黃素、維生素D3亦有抑制HH信號(hào)通路的作用。我們研究發(fā)現(xiàn)，環(huán)杷明的抗纖維化作用與劑量成正相關(guān)，高劑量的白藜蘆醇、姜黃素、維生素D3是否能提高抗纖維化的作用及在人體內(nèi)的合適劑量仍需進(jìn)一步研究。