蔡碧蓮，文亦磊，羅偉生

1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)(南寧 530001)；2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院(南寧530023)

肝纖維化是由多種因素引起的肝細胞損傷或壞死，致使肝臟內(nèi)纖維結(jié)締組織發(fā)生異常增生，肝細胞內(nèi)外基質(zhì)異常沉積。據(jù)文獻記載[1]，引起肝纖維化的因素包括：肝細胞發(fā)生炎癥反應(yīng)、藥物毒性損害、肝臟感染、肝臟血流異常、先天性異常和代謝障礙、膽汁流動受阻等，這些因素均可導(dǎo)致膠原纖維合成、沉積、降解、吸收之間的動態(tài)平衡遭到破壞，導(dǎo)致肝纖維化的發(fā)生、發(fā)展。肝纖維化是各種肝病發(fā)展成肝硬化的必然經(jīng)過的病程過程。

建立高效、穩(wěn)定的動物肝纖維化模型是進一步開展臨床藥物研究的重要前提。本實驗擬采用經(jīng)典皮下注射四氯化碳溶液和皮下注射四氯化碳溶液復(fù)合灌胃無水乙醇兩種復(fù)制模型進行比較研究，探討兩種方法優(yōu)劣及造模前期和過程中的注意事項，為肝纖維化動物實驗選擇最佳造模方法提供依據(jù)，現(xiàn)總結(jié)如下。

材料與方法

1 材 料

1.1 實驗動物：SD大鼠30只，雄性，清潔級。體質(zhì)量80～100 g，由湖南醫(yī)科大學(xué)購進，實驗動物許可證號：SCXK(湘)2014-0011，墊料、飼料均由蘇州新區(qū)楓橋凈化設(shè)備有限公司提供，實驗場所由廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院實驗動物中心提供。飼養(yǎng)條件：溫度23～25℃，空氣濕度50%～60%。用標(biāo)準(zhǔn)大鼠箱飼養(yǎng)，每箱5只，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后開始造模。

1.2 主要試劑：四氯化碳[CCl4，批號：(津)XK-13-011-00034]；橄欖油；4%組織細胞固定液(批號：20190403)；水合氯醛(批號：181120)；丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)測定試劑盒(批號：2001-0367)；天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)測定試劑盒(批號：2001-0367)；無水乙醇；75%醫(yī)用酒精；生理鹽水。

2 研究方法

2.1 肝纖維化模型建立：將30只SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機分為三組：正常對照組10只、四氯化碳溶液復(fù)合乙醇組、10只四氯化碳溶液組10只。正常對照組：常規(guī)喂養(yǎng)。四氯化碳溶液復(fù)合乙醇組：用40%四氯化碳懸溶液(體積比為四氯化碳溶液∶橄欖油=2∶3)四肢皮下注射，劑量為0.3 ml/kg，2次/周，并從實驗第2周開始經(jīng)口灌胃無水乙醇，劑量為1 ml/kg，隔天1次造模。四氯化碳溶液組：用40%四氯化碳懸溶液(體積比為四氯化碳溶液∶橄欖油=2∶3)四肢皮下注射，劑量為0.3 ml/kg，2次/周。大鼠每周稱體質(zhì)量1次，并按體質(zhì)量增長而相應(yīng)調(diào)整造模藥物的劑量。

2.2 血生化檢查：造模第10周結(jié)束后，禁食24 h，腹腔注射劑量為0.3 ml/kg水合氯醛進行麻醉，麻醉成功后立即打開腹腔，腹主動脈采血，按照試劑盒說明書檢測丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天冬門氨酸氨基轉(zhuǎn)氨酶(AST)含量。

2.3 組織染色及病理分級：肝組織標(biāo)本以4%組織細胞固定液固定、石蠟包埋，制作5 μm組織切片，進行HE及Masson染色。顯微鏡下進行觀察，肝纖維化病理分級標(biāo)準(zhǔn)參考[2]：S0級：無纖維化；S1級：部分門管區(qū)有纖維增生，有或無短的纖維隔膜；S2級：大多數(shù)門管區(qū)有纖維增生，有或無短的纖維隔膜；S3級：大多數(shù)門管區(qū)有纖維增生，偶見門管區(qū)以纖維橋連；S4級：門管區(qū)纖維橋連，同時伴有明顯的纖維橋連(門管與門管之間及門管與中心靜脈之間)；S5級：明顯的橋連[門管與門管和(或)門管與中心靜脈之間]，偶見結(jié)節(jié)(不完全硬化)；S6級：可能或明確的肝硬化。

結(jié) 果

1 大鼠一般情況 造模期間，正常對照組均表現(xiàn)活潑，毛發(fā)光澤，進食正常，大小便正常，體質(zhì)量增長速度較快；四氯化碳溶液復(fù)合乙醇組大鼠活動度尚可，精神一般，反應(yīng)稍減弱，肌肉松弛，毛發(fā)較稀疏，食欲尚可，便少，體質(zhì)量緩慢增加；四氯化碳溶液組大鼠行為激進，精神煩躁，毛發(fā)枯黃，食欲尚可，便少，體質(zhì)量緩慢增加。

2 不同造模方式的成功率和死亡率 各組造模大鼠均為10只，其中正常對照組、四氯化碳溶液復(fù)合乙醇組、四氯化碳溶液組造模大鼠非正常死亡分別為0只、2只及3只，死亡率分別為0%、20%、30%；各組造模周期結(jié)束后處死各組大鼠，HE及Masson染色發(fā)現(xiàn)正常對照組、四氯化碳溶液復(fù)合乙醇組、四氯化碳溶液組分別有0只、5只、3只大鼠肝組織達到了S5級以上(含S5級)，成功率分別為0%、50%及30%；其中推測大鼠死亡原因是注射部位經(jīng)久不愈、潰爛、感染而亡，或大鼠之間撕咬致死。見表1。

表1 各組大鼠用藥后死亡及肝纖維化情況(只)

3 肝功能檢測結(jié)果 各組造模周期結(jié)束后，四氯化碳溶液復(fù)合乙醇組、四氯化碳溶液組大鼠血清ALT、AST的含量較正常對照組升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；四氯化碳溶液復(fù)合乙醇組大鼠血清ALT、AST的含量與四氯化碳溶液組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，但其含量較四氯化碳溶液組有明顯升高。見表2。

注：與正常對照組比較，*P<0.05

4 肉眼及鏡下對大鼠肝纖維化病變觀察 各組造模周期結(jié)束后，打開大鼠腹腔，肉眼觀察發(fā)現(xiàn)正常對照組大鼠無腹水，無腸系膜上血管增粗，肝臟表面光滑，質(zhì)地柔軟，邊緣鈍化。鏡下HE及Masson染色可見肝細胞索排列整齊，無炎細胞浸潤，無脂肪變性，肝小葉結(jié)構(gòu)無明顯異常，肝血竇以中心靜脈為中心呈放射狀分布(圖1、2)；肉眼觀察發(fā)現(xiàn)四氯化碳溶液復(fù)合乙醇組(ISHAK評分達S5級)大鼠出現(xiàn)腹水，腸系膜上血管增粗，肝臟外觀偏暗紅色，質(zhì)地較硬，肝臟表面凹凸不平，小結(jié)節(jié)樣改變，HE染色見正常肝細胞索排列紊亂，正常肝小葉結(jié)構(gòu)破壞并有明顯的橋連，門管與門管及門管與中心靜脈之間可見有假小葉形成，甚至肝硬化形成。Masson染色可見匯管區(qū)膠原纖維明顯增生，包繞正常肝組織，假小葉形成(圖3、4)；肉眼觀察四氯化碳溶液組發(fā)現(xiàn)大鼠腹水不多，腸系膜上血管稍增粗，肝臟表面較光滑，質(zhì)地較柔軟，鏡下HE及Masson染色可見肝細胞索排列紊亂，伴少量炎細胞浸潤，正常肝小葉結(jié)構(gòu)被破壞并有纖維間隔形成，部分可見有假小葉形成(圖5、6)。

討 論

據(jù)統(tǒng)計，在我國肝纖維化常以乙型或丙型病毒性肝炎遷延不愈所致[3]，其中約有20%～30%慢性肝炎患者最終會發(fā)展為嚴(yán)重的肝纖維化或肝硬化病變。研究發(fā)現(xiàn)，星狀細胞(HSC)是肝纖維化形成的關(guān)鍵。HSC活化后不僅細胞大量增殖，而且還表現(xiàn)為細胞個體分泌纖維能力增強，大量生成細胞外基質(zhì)(ECM)，并可自分泌TGF β1等細胞因子，維持自身活化狀態(tài)[4]。因此建立高效的肝纖維化動物模型對臨床研究有著重要意義?，F(xiàn)在誘導(dǎo)肝纖維的動物模型很多，因方法不同，所產(chǎn)生的機制不同，病理生理改變也不同。是否能成功地構(gòu)建大鼠肝纖維化模型對于研究肝纖維化的發(fā)病機制、發(fā)病經(jīng)過及如何治療肝纖維化的重要前提條件。實驗者通過以下方法構(gòu)建大鼠肝纖維化模型，如：運用刀豆素A[5]，進行膽管結(jié)扎術(shù)[6-7]，注射豬血清或人血白蛋白[8-9]，利用血吸蟲感染[10-11]，采用酒精[12]、四氯化碳灌胃[13]。這些實驗方式分別會引起免疫性肝損害、膽汁淤積、自身免疫性肝纖維化、感染、中毒性肝損害，從而形成肝纖維化模型。免疫誘導(dǎo)性肝纖維化模型持續(xù)時間明顯長于肝毒性(如CCl4所制模型)誘導(dǎo)所致的肝纖維化模型。由于人類的慢性乙、丙型肝炎所致的肝纖維化多為免疫性損傷。因此，此種方法所造模型更接近于慢性病毒性肝炎所致的肝纖維化[14]。CCl4所構(gòu)建的肝纖維化動物模型是這些方法中造價成本相對低廉且實施方法相對簡易，并且是最經(jīng)典、最早、運用最廣泛、也最受歡迎的方法之一。

本文所探討的兩種不同造模方法，在誘導(dǎo)肝纖維化過程中，產(chǎn)生機制如下：①據(jù)有關(guān)文獻報道[15]，四氯化碳作為一種選擇性肝毒性藥物，在肝細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，經(jīng)肝微粒體內(nèi)氧化酶的激活而產(chǎn)生自由基·CCl3，與肝細胞內(nèi)大分子發(fā)生共價結(jié)合，產(chǎn)生活性氧自由基和脂質(zhì)過氧化，致使正常肝細胞受到破壞，狄氏間隙內(nèi)的儲脂細胞釋放Ⅳ型膠原酶，該酶可降解Ⅳ型膠原，促進肝纖維化形成。②乙醇在肝臟通過乙醇脫氫酶和微粒體乙醇氧化酶系統(tǒng)進行氧化代謝產(chǎn)生毒性代謝產(chǎn)物乙醛。通過多種途徑如肝細胞損害、誘導(dǎo)免疫反應(yīng)、抑制三羧酸循環(huán)等損害肝臟結(jié)構(gòu)和破壞肝臟功能，刺激膠原蛋白形成。膠原蛋白的合成是促進肝纖維化的發(fā)生原因之一[16]。在乙醇致肝細胞損傷作用下用四氯化碳能加速肝細胞壞死，縮短造模時間[17]。從血清生化指標(biāo)分析：ALT升高，提示肝細胞損傷、細胞膜通透性增強。AST增高則反映肝細胞線粒體損傷。造模結(jié)束后，雖然四氯化碳溶液復(fù)合乙醇組大鼠血清ALT和AST的含量與四氯化碳溶液組大鼠血清ALT和AST的含量比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，但前者較后者有明顯的升高。從死亡率和成模率分析：四氯化碳溶液復(fù)合乙醇組大鼠死亡率較四氯化碳溶液組低，肝纖維化分期達5級以上(含S5級)的成模率，四氯化碳溶液復(fù)合乙醇組大鼠較四氯化碳溶液組高。由此可推斷：四氯化碳溶液復(fù)合乙醇組構(gòu)建肝纖維化模型具有以下優(yōu)點：①肝纖維化程度較理想；②構(gòu)建肝纖維化周期短；③操作相對簡便；④大鼠死亡率低。

在構(gòu)建肝纖維化模型中，筆者體會：①掌握熟練的操作技巧，避免將四氯化碳溶液注射至血管內(nèi)；②開始實驗的大鼠體重應(yīng)控制在100 g左右，方便抓持大鼠，減少大鼠掙扎；③后期大鼠體重可達300～400 g，可用易拉罐，將大鼠套入其中，減少大鼠掙扎、傷人；④選用大鼠四肢皮下注射，輪替注射，可減少注射部位感染；⑤造模過程嚴(yán)格把控大鼠飼料投喂量，若投喂量過多后期大鼠肥碩，脂肪肝程度加重，不利于進一步研究。