閔濤，劉少丹，辛國斌，張大明，

（1.山西醫(yī)科大學(xué)法醫(yī)學(xué)院，山西 太原 030001；2.迪安鑒定科學(xué)研究院，浙江 杭州 310000；3.北京市公安司法鑒定中心，北京 100192）

法醫(yī)毒物分析領(lǐng)域多為針對生物檢材中藥（毒）物的檢測，由于生物檢材中基質(zhì)的復(fù)雜性，使得定性結(jié)果的可靠性存在一定風(fēng)險，尤其是當(dāng)檢材中物質(zhì)的含量接近方法檢出限（limit of detection，LOD）時，如何對結(jié)果作出相對準(zhǔn)確的判定就尤為重要。隨著儀器分析技術(shù)的發(fā)展，人們對儀器靈敏度的要求越來越高，越來越多案件中的藥（毒）物依賴于液相色譜-質(zhì)譜的檢測。在液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（liquid chromatographytandem mass spectrometry，LC-MS/MS）檢測中，定性結(jié)果的主要判定依據(jù)一般包括絕對保留時間（retention time，RT）、相對保留時間（relative retention time，RRT）、信噪比（signal to noise ratio，S/N）、母/子離子對的選擇和離子豐度比等，其中待測樣品中分析物的保留時間和離子豐度比與質(zhì)量控制樣品之間的最大允許偏差是定性時重要的參考指標(biāo)。

關(guān)于LC-MS/MS檢測生物樣品中藥（毒）物的定性確認(rèn)指標(biāo)的規(guī)定，國內(nèi)外不同組織或機(jī)構(gòu)根據(jù)其檢測結(jié)果的用途不同，也給出了各自的判定指標(biāo)[1-18]。例如，就RT的偏差而言，除了歐盟委員會EU：SANTE/11945/2015[2]和世界反興奮劑機(jī)構(gòu)（World Anti-Doping Agency，WADA）[3]要求使用絕對偏差±0.1 min外，其余標(biāo)準(zhǔn)均要求使用相對偏差，并且對于判定指標(biāo)的允許偏差范圍也不盡相同。另外，對于離子豐度比的偏差，國內(nèi)相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)[9-18]均引用歐盟委員會EU：2002/657/EC協(xié)議[1]中的要求。同時，國內(nèi)外對生物檢材中藥（毒）物定性指標(biāo)的判定僅為指導(dǎo)性文件，相關(guān)文獻(xiàn)較少。因此，本研究將針對法醫(yī)毒物分析中普遍使用的LC-MS/MS定性分析技術(shù)，通過對血液中毒品類（甲基苯丙胺、嗎啡、氯胺酮）、苯二氮類（艾司唑侖、咪達(dá)唑侖、地西泮、氯硝西泮）和巴比妥類（苯巴比妥）共3大類8種常見藥（毒）物的檢測，探討8種常見藥（毒）物血液添加樣品的保留時間、離子豐度比的最大允許偏差，通過數(shù)據(jù)分析給出最大允許偏差的參考范圍，以期為血液中LC-MS/MS定性結(jié)果的判定提供實驗數(shù)據(jù)和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑

LC-20A高效液相色譜儀（日本島津公司），API 4000 Qtrap三重四極桿質(zhì)譜系統(tǒng)（美國AB Sciex公司），Purelab UHQ超純水儀（英國ELGA公司），BS110S電子分析天平（德國Sartorius公司）。

嗎啡、艾司唑侖、咪達(dá)唑侖、地西泮、氯硝西泮、苯巴比妥標(biāo)準(zhǔn)對照品粉末（純度≥99.7%，中國藥品生物制品檢定所），氯胺酮、甲基苯丙胺標(biāo)準(zhǔn)對照品溶液（1mg/mL，公安部物證鑒定中心），鹽酸雙苯戊二氨酯（SKF525A）和烯丙異丙巴比妥標(biāo)準(zhǔn)對照品粉末（純度≥99.8%，美國Sigma公司），乙腈、甲醇（色譜純，德國Merck公司），甲酸、甲酸銨（液相色譜級，美國Sigma公司）；流動相用水為過濾后的去離子水。

1.2 儀器條件

1.2.1 色譜條件

使用不同的色譜柱進(jìn)行分離，分別為：色譜柱1（毒品類），Atlantis HILIC Silica色譜柱（2.1mm×100mm，3.5μm，美國Waters公司）；色譜柱2（苯二氮類和巴比妥類），ZORBAX Eclipse Plus C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，3.5 μm，美國Agilent公司）。流動相A均為10 mmol/L甲酸銨水溶液（0.1%甲酸），流動相B均為乙腈（0.1%甲酸）。毒品類物質(zhì)洗脫梯度：0～2 min，95%B；2～7min，95%～88%B；7～9min，88%～50%B；9～11 min，95%B。苯二氮類藥物洗脫梯度：0～1min，10%B；1～5.5min，10%～50%B；5～8min，50%～70%B；8～10 min，10%B。巴比妥類藥物洗脫梯度：0～1min，10%B；1～3min，10%～50%B；3～8min，50%～85%B；8～10 min，10%B。進(jìn)樣量均為1 μL，流速均為0.4mL/min。

1.2.2 質(zhì)譜條件

使用電噴霧離子源（electrospray ionization，ESI）檢測，毒品類和苯二氮類藥（毒）物在正離子多反應(yīng)監(jiān)測（multiple reaction monitoring，MRM）模式下檢測，巴比妥類藥物在負(fù)離子MRM模式下檢測，相關(guān)參數(shù)見表1。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

分別精確稱量嗎啡、艾司唑侖、咪達(dá)唑侖、地西泮、氯硝西泮、苯巴比妥標(biāo)準(zhǔn)對照品，用甲醇配制成1 mg/mL的儲備液，置于-20℃冰箱中保存。使用時分別取適量稀釋成所需質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)對照品溶液。分別精確稱量SKF525A和烯丙異丙巴比妥標(biāo)準(zhǔn)對照品，用乙醇配制成100 μg/mL的儲備液，置于-20℃冰箱中保存。

1.4 樣品前處理

移取血液0.5mL，加入1mL乙腈-甲醇溶液（體積比為9∶1），超聲10min，4℃下以10397×g離心5min，取上清液200μL于進(jìn)樣小瓶備用。

根據(jù)預(yù)實驗結(jié)果，8種藥（毒）物L(fēng)OD和定量限（limit of quantitation，LOQ）的具體數(shù)值見表2。按照各藥（毒）物的檢測限，分別加入適量的上述8種藥（毒）物的標(biāo)準(zhǔn)對照品，配制8種藥（毒）物質(zhì)量濃度為LOD、2倍檢出限（2LOD）、LOQ、1.5倍定量限（1.5LOQ）、2LOQ、4LOQ、6LOQ的加標(biāo)血樣，內(nèi)標(biāo)SKF525A和烯丙異丙巴比妥的質(zhì)量濃度分別為10.0ng/mL和2.5μg/mL，每個質(zhì)量濃度平行操作18份。根據(jù)預(yù)實驗結(jié)果，毒品類物質(zhì)血液添加樣品的絕對回收率約為70%，苯二氮類和巴比妥類藥物血液添加樣品的絕對回收率約為75%，按照各類物質(zhì)的絕對回收率分別配制與血液添加樣品相對應(yīng)質(zhì)量濃度的含內(nèi)標(biāo)的甲醇標(biāo)準(zhǔn)稀釋液，每個質(zhì)量濃度平行操作6份。

表1 8種藥（毒）物的質(zhì)譜條件Tab.1 The mass spectrometry conditions of 8 drugs（poisons）

表2 血液添加樣本中8種藥（毒）物的LOD和LOQTab.2 LOD and LOQ of 8 drugs（poisons）in blood samples （ng/mL）

1.5 進(jìn)樣順序

按照每類物質(zhì)各自的色譜條件將3類藥（毒）物分別進(jìn)樣，每個色譜條件下進(jìn)3批次。一個批次包含7個質(zhì)量濃度，按照質(zhì)量濃度從低到高的順序進(jìn)樣，每個質(zhì)量濃度樣品以1個空白試劑、3個加標(biāo)血樣、1個相應(yīng)質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)對照品溶液為一組，一個批次進(jìn)2組。

1.6 數(shù)據(jù)處理

保留時間和離子豐度比的偏差是指待測樣品中該參數(shù)與同批次相同質(zhì)量濃度標(biāo)準(zhǔn)對照品之間的偏差。其中保留時間的偏差可分為絕對偏差（ΔRT）和相對偏差（ΔRRT）。ΔRT是指血液添加樣品中RT與標(biāo)準(zhǔn)對照品RT的差值；ΔRRT是指血液添加樣品中RRT和標(biāo)準(zhǔn)對照品RRT的差值與標(biāo)準(zhǔn)對照品RRT的比值。同樣，離子豐度比的偏差（ΔR）也包括絕對偏差（ΔR絕對）和相對偏差（ΔR相對），ΔR絕對是指血液添加樣品中離子豐度比與標(biāo)準(zhǔn)對照品離子豐度比的差值，ΔR相對是指ΔR絕對與標(biāo)準(zhǔn)對照品離子豐度比的比值。選擇標(biāo)準(zhǔn)對照品中離子豐度比相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）＜15%的質(zhì)量濃度作為分界點來討論離子豐度比的偏差。

本實驗共得到標(biāo)準(zhǔn)對照品336個數(shù)據(jù)，血樣添加樣品1 008個數(shù)據(jù)。剔除S/N＜3或因?qū)嶒灢僮骱蛢x器等因素造成的異常值57個，得到血樣添加樣品951個數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果

2.1 保留時間的偏差

2.1.1 RT的偏差

不同質(zhì)量濃度下8種藥（毒）物ΔRT的統(tǒng)計結(jié)果見圖1?？梢钥闯觯|(zhì)量濃度對其影響不大。

8種藥（毒）物在各自保留時間下的ΔRT統(tǒng)計結(jié)果見圖2?？梢钥闯?，8種藥（毒）物的出峰時間是不同的，但隨著保留時間的增加，其ΔRT值變化趨勢不明顯。在血液添加樣品的ΔRT中，有98.11%（933/951）在±0.05min內(nèi)，所有樣品的偏差都在±0.1min范圍內(nèi)。

2.1.2 RRT的偏差

不同質(zhì)量濃度下8種藥（毒）物ΔRRT的統(tǒng)計結(jié)果見圖3。血液添加樣品的ΔRRT中，有96.21%（915/951）在±0.4%范圍內(nèi)，所有樣品的偏差都在±1.0%范圍內(nèi)。

圖1 不同質(zhì)量濃度下8種藥（毒）物的ΔRTFig.1 ΔRT of 8 drugs（poisons）at different mass concentrations

圖2 8種藥（毒）物的ΔRTFig.2 ΔRT of 8 drugs（poisons）

圖3 不同質(zhì)量濃度下8種藥（毒）物的ΔRRTFig.3 ΔRRT of 8 drugs（poisons）at different mass concentrations

2.2 離子豐度比

2.2.1 母/子離子對的選擇及離子豐度比

以艾司唑侖為例，選擇295.0→267.0和295.0→205.3作為兩對母/子離子對進(jìn)行檢測。由于在MRM模式中，物質(zhì)的離子豐度比是指低豐度子離子與高豐度子離子之間豐度的比值，因此，艾司唑侖的離子豐度比約為0.53。艾司唑侖在不同質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)對照品和血液添加樣品中離子豐度比的檢測結(jié)果見表3。結(jié)果表明，不論是標(biāo)準(zhǔn)對照品還是血液添加樣品，艾司唑侖的離子豐度比在低質(zhì)量濃度時相對偏差較大，隨著質(zhì)量濃度的增加，偏差值呈現(xiàn)下降趨勢。在質(zhì)量濃度為LOQ及以上時，RSD均＜15%。其他7種物質(zhì)和艾司唑侖的RSD趨勢一致。

表3 艾司唑侖在不同質(zhì)量濃度標(biāo)準(zhǔn)對照品和血液添加樣品中離子豐度比的平均值和RSDTab.3 Average and RSD for ion abundance ratios of estazolam in standards and blood samples at different mass concentrations

2.2.2 離子豐度比偏差

2.2.2.1 偏差與離子豐度比的關(guān)系

8種藥（毒）物離子豐度比的ΔR絕對和ΔR相對見圖4～5?？梢钥闯?，在不同的離子豐度段內(nèi)，ΔR絕對和ΔR相對都沒有明顯的變化趨勢，因此，沒有將離子豐度比分段來統(tǒng)計最大允許誤差的必要性，可將8種藥（毒）物合在一起討論其最大允許偏差。

圖4 8種藥（毒）物的ΔR絕對Fig.4 ΔRabsoluteof 8 drugs（poisons）

圖5 8種藥（毒）物的ΔR相對Fig.5 ΔRrelativeof 8 drugs（poisons）

2.2.2.2 離子豐度比的絕對偏差

不同質(zhì)量濃度下8種藥（毒）物的ΔR絕對見圖6。在低質(zhì)量濃度時，特別是在LOQ以下，ΔR絕對的值變化較大。隨著質(zhì)量濃度的增加，ΔR絕對趨于穩(wěn)定。因此，以質(zhì)量濃度LOQ為界限分開討論偏差范圍。

圖6 不同質(zhì)量濃度下8種藥（毒）物的ΔR絕對Fig.6 ΔRabsoluteof 8 drugs（poisons）at different mass concentrations

當(dāng)質(zhì)量濃度為LOD和2LOD時，有95.40%（249/261）的ΔR絕對在±35%范圍內(nèi)，所有的ΔR絕對都在±60%范圍內(nèi)，ΔR絕對的95%置信區(qū)間為（-37.64%，32.79%）。當(dāng)質(zhì)量濃度為LOQ及以上時，有94.20%（650/690）的ΔR絕對在±20%范圍內(nèi)，97.25%（671/690）的ΔR絕對在±25%范圍內(nèi)，ΔR絕對的95%置信區(qū)間為（-21.14%，21.73%）。

2.2.2.3 離子豐度比的相對偏差

不同質(zhì)量濃度下8種藥（毒）物的ΔR相對見圖7，可以看出質(zhì)量濃度也影響其偏差大小。因此，同樣以質(zhì)量濃度LOQ為界限分開討論偏差范圍。

圖7 不同質(zhì)量濃度下8種藥（毒）物的ΔR相對Fig.7 ΔRrelativeof 8 drugs（poisons）at different mass concentrations

當(dāng)質(zhì)量濃度為LOD和2LOD時，有95.02%（248/261）的ΔR相對在±50%范圍內(nèi)，ΔR相對的95%置信區(qū)間為（-48.64%，54.23%）。當(dāng)質(zhì)量濃度為LOQ及以上時，有96.38%（665/690）的ΔR相對在±40%范圍內(nèi)，ΔR相對的95%置信區(qū)間為（-32.12%，43.79%）。

3 討 論

在國內(nèi)外的指導(dǎo)文件中，部分指南或規(guī)范在定性時是將待測樣品與標(biāo)準(zhǔn)對照品進(jìn)行比較[1，4，6，9]，而另一部分標(biāo)準(zhǔn)則要求以空白檢材基質(zhì)添加作為參照[2-3，7-8，10-18]。在本研究中，因選擇的是將空白血液加標(biāo)作為待測樣品，考慮到基質(zhì)干擾和提取過程中的損失等問題，選擇標(biāo)準(zhǔn)對照品作為質(zhì)量控制樣品來研究保留時間和離子豐度比的偏差。

3.1 保留時間的判定

關(guān)于RT偏差的規(guī)定，國內(nèi)外多數(shù)指南或規(guī)范都采用相對偏差[1，4-18]，不同領(lǐng)域相對偏差的數(shù)值不盡相同。而相對偏差是指保留時間的絕對偏差與標(biāo)準(zhǔn)對照品中保留時間的比值。在本研究中，從圖2可以看出，物質(zhì)的保留時間不會影響其絕對偏差，因此，對ΔRT的判定推薦使用絕對偏差作為依據(jù)。國外一些研究如MOL等[19]和BERENDSEN等[20]也提出了此觀點，認(rèn)為保留時間的變化是相對獨立的，與保留時間本身的大小沒有顯著關(guān)系，建議ΔRT的范圍分別為±0.1min和±0.2min。指南[2-3]中規(guī)定ΔRT的判定范圍為±0.1 min，在本研究中，ΔRT有＞95%的測試結(jié)果在±0.05min，在指南[2-3]范圍內(nèi)。因此，就本研究的8種藥（毒）物而言，選擇±0.1min作為判定標(biāo)準(zhǔn)更為適宜。

歐盟委員會發(fā)布的EU：2002/657/EC[1]決議和歐洲毒理學(xué)和法庭化學(xué)協(xié)會（Society for Toxicological and Forensic Chemistry，GTFCh）2009年發(fā)布的《法庭毒物分析質(zhì)量控制指南》[5]中，規(guī)定ΔRRT的判定標(biāo)準(zhǔn)為±2.5%，WADA[3]給出的ΔRRT標(biāo)準(zhǔn)為±1%。本研究ΔRRT在±0.4%范圍內(nèi)，符合其規(guī)定。

3.2 離子豐度比的判定

對于色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)中目標(biāo)物的定性依據(jù)，歐盟委員會在EU：2002/657/EC決議中規(guī)定，要求保留時間、母/子離子對的選擇和離子豐度比判定的總分值至少需達(dá)到4分[1]。對LC-MS/MS而言，除保留時間外，滿足這個條件就需要選擇兩對母/子離子對（表1）。

表4列出了國內(nèi)外不同領(lǐng)域LC-MS/MS檢測生物樣品中相關(guān)藥（毒）物ΔR的判定標(biāo)準(zhǔn)?？梢钥闯?，除文獻(xiàn)[2，4，6]外，多數(shù)標(biāo)準(zhǔn)都是將離子豐度比劃分為四段來討論偏差范圍，且?guī)缀醵疾捎孟鄬ζ钭鳛榕卸?biāo)準(zhǔn)，但不同領(lǐng)域給出的標(biāo)準(zhǔn)不盡相同[1，3，5，7-18]。而國內(nèi)2010年后通用的標(biāo)準(zhǔn)，如公共安全行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)或司法鑒定技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)[9-18]對于ΔR值的要求均是引用了歐盟EU：2002/657/EC標(biāo)準(zhǔn)[1]。

表4 不同領(lǐng)域生物樣品定性分析中LC-MS/MS離子豐度比偏差的判定標(biāo)準(zhǔn)Tab.4 Determination standards of deviation of ion abundance ratios in qualitative analysis of biological samples by LC-MS/MS in different fields

在本研究中，從圖4～5可以看出，離子豐度比不同時，偏差沒有太大差異，沒有必要分段來討論偏差。同時，在最新版的歐盟EU：SANTE/11945/2015標(biāo)準(zhǔn)[2]中，已經(jīng)不再分段來給出ΔR的最大允許值，而是直接給出了ΔR相對≤50%的判定指標(biāo)。另外，本研究結(jié)果還表明，離子豐度比的偏差與物質(zhì)的質(zhì)量濃度存在高度的關(guān)聯(lián)，隨著質(zhì)量濃度的增加其偏差呈減小趨勢，若不考慮質(zhì)量濃度，只給出一個較小的判定標(biāo)準(zhǔn)，當(dāng)質(zhì)量濃度較低時，可能會增加假陰性風(fēng)險。因此，應(yīng)按照不同的質(zhì)量濃度范圍來考慮合適的偏差范圍。

國外的一些相關(guān)研究也考慮到了質(zhì)量濃度的影響，如MOL等[19]認(rèn)為，ΔR相對應(yīng)為±20%，當(dāng)質(zhì)量濃度接近LOD時該范圍可以擴(kuò)大至±45%，BERENDSEN等[20]建議，將ΔR相對設(shè)為±50%較為合理。本研究結(jié)果也表明，采用已知添加作為定性分析的質(zhì)量控制手段時，質(zhì)量控制樣品的質(zhì)量濃度應(yīng)≥LOQ，此時標(biāo)準(zhǔn)對照品中離子豐度比的偏差較小，RSD＜15%。

綜合分析血液中8種藥（毒）物的保留時間和離子豐度比的偏差，建議RT偏差的判定范圍為±0.1min，RRT的偏差為±1.0%。對于離子豐度比的偏差，在本研究中建議以質(zhì)量濃度LOQ為界限：質(zhì)量濃度在LOQ及以上時，絕對偏差判定范圍為±20%，相對偏差為±40%；當(dāng)質(zhì)量濃度在LOQ以下（即質(zhì)量濃度為LOD和2LOD）時，絕對偏差和相對偏差可分別擴(kuò)展到±35%和±50%。另外，由于儀器本身的穩(wěn)定性和樣品基質(zhì)可能對保留時間和離子豐度比也有影響，更換不同的儀器、選擇不同的前處理方法或選擇不同的藥物可能都會得出不同的結(jié)論，因此本研究結(jié)果只針對本實驗所用儀器和提取方法，僅為法醫(yī)毒物分析鑒定中LCMS/MS定性結(jié)果的判定提供參考范圍和研究思路，下一步仍需開展大量研究來加以補(bǔ)充和驗證，以得到更為可靠的結(jié)果。