齊巧明，龍 旭，羅 鳳，高曉敏，雷亞婷，靳如意，郭 惠

(陜西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，陜西 咸陽 712046)

艾葉是菊科植物艾屬(ArtemisiaargyiLevl.et Vant.)的干燥葉，味辛、苦，無毒，歸肝、脾和腎經(jīng)[1-5]。艾葉主要分布在亞洲東部，如日本、蒙古，我國的華北、華東、華南、東北、陜西和甘肅等地[3,6]。艾葉富含多種生物活性成分，包括揮發(fā)油、甾萜類、有機(jī)酸、黃酮類和多糖等[5,7]。艾葉及其揮發(fā)油具有驅(qū)寒除濕、殺蟲止癢、鎮(zhèn)咳平喘、美白、通經(jīng)活絡(luò)、抗過敏、抗菌和安胎等功效，在醫(yī)藥、食品、香料及化學(xué)工業(yè)中應(yīng)用廣泛[5-10]。艾葉揮發(fā)油成分主要由脂肪類、萜類和芳香類化合物構(gòu)成，約100余種，主要為桉油精、側(cè)柏酮、龍腦、α-松油醇、β-松油烯、檸檬醛等[2,11]。目前對艾葉揮發(fā)油的研究主要集中于化學(xué)成分和藥理作用，但有關(guān)其抗氧化活性的研究鮮有報(bào)道。鑒于此，作者采用單因素實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面法優(yōu)化艾葉揮發(fā)油的共水蒸餾提取工藝，并通過測定艾葉揮發(fā)油對1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)自由基的清除率來評價(jià)其抗氧化性能，為艾葉揮發(fā)油資源的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料、試劑與儀器

艾葉，購于藥材市場。

液體石蠟、氯化鈉、無水乙醇，分析純，天津天力化學(xué)試劑有限公司；無水硫酸鈉，分析純，重慶茂業(yè)化學(xué)試劑有限公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)，分析純，Sigma-Aldrich公司。

JM-B10002型電子天平,諸暨超澤衡器設(shè)備有限公司；HX-200型粉碎機(jī)；HJ-3A型恒溫磁力攪拌器；電熱鼓風(fēng)干燥箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；UV1102型紫外可見分光光度計(jì)，日本島津；SHB-Ⅲ型循環(huán)水式多用真空泵。

1.2 艾葉揮發(fā)油的提取

將艾葉置于電熱鼓風(fēng)干燥箱中40 ℃干燥24 h，粉碎后過20目篩，備用。稱取一定量的艾葉粉末置于500 mL三頸燒瓶中，加入360 mL蒸餾水，浸泡一段時(shí)間，于100 ℃下回流一段時(shí)間；將提取液轉(zhuǎn)入分液漏斗中，加入2.0 g氯化鈉加速油水分離，靜置24 h；分層后將上層油相轉(zhuǎn)入燒杯中，加入1.0 g無水硫酸鈉進(jìn)行干燥處理，純化后稱重，按式(1)計(jì)算艾葉揮發(fā)油的提取率：

(1)

1.3 艾葉揮發(fā)油提取工藝優(yōu)化

1.3.1 單因素實(shí)驗(yàn)

1.3.1.1 浸泡時(shí)間

準(zhǔn)確稱取60.0 g艾葉粉末置于500 mL三頸燒瓶中，加入360 mL蒸餾水，分別浸泡0.5 h、1.0 h、1.5 h、2.0 h后于100 ℃回流3.0 h；將艾葉提取液轉(zhuǎn)入分液漏斗中，加入2.0 g氯化鈉加速油水分離，靜置24 h；分層后將上層油相轉(zhuǎn)入燒杯中，加入1.0 g無水硫酸鈉進(jìn)行干燥處理，得到艾葉揮發(fā)油，稱重。

1.3.1.2 料液比

分別按料液比(g∶mL，下同)1∶6、1∶8、1∶10、1∶12準(zhǔn)確稱取艾葉粉末置于500 mL三頸燒瓶中，加入適量蒸餾水，浸泡1.5 h后于100 ℃回流3.0 h；后續(xù)操作同1.3.1.1。

1.3.1.3 提取時(shí)間

準(zhǔn)確稱取60.0 g艾葉粉末置于500 mL三頸燒瓶中，加入360 mL蒸餾水，浸泡1.5 h后于100 ℃分別回流1.5 h、3.0 h、4.5 h、6.0 h；后續(xù)操作同1.3.1.1。

1.3.2 響應(yīng)面法實(shí)驗(yàn)

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取浸泡時(shí)間(A)、料液比(B)和提取時(shí)間(C)作為Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的3個(gè)因素，結(jié)合響應(yīng)面法的設(shè)計(jì)原理，采用3因素3水平的設(shè)計(jì)方案，選取3個(gè)零點(diǎn)，共15組實(shí)驗(yàn)，響應(yīng)面法實(shí)驗(yàn)的因素與水平見表1。

表1響應(yīng)面法實(shí)驗(yàn)的因素與水平

Tab.1 Factors and levels of response surface methodologies

水平因素A.浸泡時(shí)間/hB.料液比/(g∶mL)C.提取時(shí)間/h-11.01∶123.001.51∶104.512.01∶86.0

1.4 抗氧化性能研究

DPPH自由基溶液的配制：精確稱取8.00 mg的DPPH標(biāo)準(zhǔn)品，用無水乙醇溶解并定容于100 mL棕色容量瓶中，搖勻，得質(zhì)量濃度為0.08 mg·mL-1的DPPH自由基溶液，冷藏備用。

準(zhǔn)確移取3.00 mL 0.08 mg·mL-1的DPPH自由基溶液于10 mL離心管中，加入3.00 mL無水乙醇混合均勻后，于516 nm處測定吸光度(A0)；分別移取3.00 mL 0.08 mg·mL-1的DPPH自由基溶液于6支10 mL離心管中，分別加入濃度為5.0 mg·mL-1、10.0 mg·mL-1、20.0 mg·mL-1、40.0 mg·mL-1、60.0 mg·mL-1、80.0 mg·mL-1的艾葉揮發(fā)油乙醇溶液3.00 mL，室溫靜置30 min，于516 nm處測定吸光度(A1)；分別移取3.00 mL無水乙醇于6支10 mL離心管中，加入不同濃度的艾葉揮發(fā)油溶液，在516 nm處測定吸光度(A2)。每個(gè)樣品重復(fù)測定3次，取平均值。按式(2)計(jì)算DPPH自由基清除率：

(2)

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 浸泡時(shí)間對艾葉揮發(fā)油提取率的影響(圖1)

圖1 浸泡時(shí)間對艾葉揮發(fā)油提取率的影響Fig.1 Effect of soaking time on extraction rate of Artemisia argyi volatile oil

從圖1可以看出，隨著浸泡時(shí)間的延長，艾葉揮發(fā)油提取率先升高后降低，當(dāng)浸泡時(shí)間達(dá)到1.5 h時(shí)，提取率最高，為0.67%。這是由于，水逐漸向艾葉內(nèi)部滲透，并以它為載體將揮發(fā)油逐步擴(kuò)散到艾葉表面，浸泡時(shí)間越長，擴(kuò)散越完全；但浸泡時(shí)間過長，內(nèi)部有效成分逐漸揮發(fā)損失，揮發(fā)油提取率反而下降。因此，確定最佳浸泡時(shí)間為1.5 h。

2.1.2 料液比對艾葉揮發(fā)油提取率的影響(圖2)

圖2 料液比對艾葉揮發(fā)油提取率的影響Fig.2 Effect of solid-liquid ratio on extraction rate of Artemisia argyi volatile oil

從圖2可以看出，隨著料液比的減小，即提取溶劑用量的增加，揮發(fā)油提取率先降低后升高而后再降低，當(dāng)料液比為1∶10時(shí)，提取率最高，達(dá)到0.75%，而當(dāng)料液比為1∶12時(shí)，提取率最低，為0.33%。這是由于，液料比過大時(shí)，溶劑用量相對過少，導(dǎo)致?lián)]發(fā)油提取不完全，提取率較低；但是若溶劑用量過多，揮發(fā)油在水中的溶解量增大，減少了揮發(fā)油的相對含量，也會(huì)導(dǎo)致?lián)]發(fā)油提取率降低。綜合考慮，確定最佳料液比為1∶10。

2.1.3 提取時(shí)間對艾葉揮發(fā)油提取率的影響(圖3)

圖3 提取時(shí)間對艾葉揮發(fā)油提取率的影響Fig.3 Effect of extraction time on extraction rate of Artemisia argyi volatile oil

從圖3可以看出，隨著提取時(shí)間的延長，艾葉揮發(fā)油提取率先升高后降低，當(dāng)提取時(shí)間為4.5 h時(shí)，揮發(fā)油提取率最高，為0.83%。這是由于，溶劑水將干燥的艾葉粉末浸潤并溶解出有效成分需要一定時(shí)間，延長提取時(shí)間有利于揮發(fā)油的提取，但在有效成分完全擴(kuò)散的前提下，繼續(xù)延長提取時(shí)間，反而會(huì)導(dǎo)致?lián)]發(fā)油中的有效成分揮發(fā)，提取率降低。因此，確定最佳提取時(shí)間為4.5 h。

2.2 響應(yīng)面法實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 響應(yīng)面法實(shí)驗(yàn)方案設(shè)計(jì)與結(jié)果(表2)

表2響應(yīng)面法實(shí)驗(yàn)方案設(shè)計(jì)與結(jié)果

Tab.2 Design and results of response surface methodologies

實(shí)驗(yàn)號(hào)A.浸泡時(shí)間B.料液比C.提取時(shí)間Y.提取率/%11010.7720000.8230000.834-1-100.6951100.8060110.7870-1-10.728-1010.7690-110.7810-1100.741110-10.761201-10.80130000.83141-100.7715-10-10.65

對回歸方程進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表3。

從表3可知，模型F值為21.22，P<0.01，說明二次回歸方程具有高度顯著性，模型與實(shí)驗(yàn)實(shí)際擬合度良好，實(shí)驗(yàn)誤差相對較小，能較好地反映艾葉揮發(fā)油提取率與浸泡時(shí)間、料液比和提取時(shí)間之間的關(guān)系。二次項(xiàng)中除浸泡時(shí)間與料液比的交互作用不顯著(P>0.05)外，其它作用均顯著。失擬項(xiàng)代表模型中的數(shù)據(jù)變異，該方程的失擬項(xiàng)F值為8.50>0.05，說明模型的擬合情況良好。根據(jù)F值和P值大小可知，各因素對揮發(fā)油提取率的影響大小依次為：浸泡時(shí)間>料液比=提取時(shí)間。

2.2.2 響應(yīng)面分析

采用Design-Expert軟件擬合分析浸泡時(shí)間、料液比和提取時(shí)間對揮發(fā)油提取率的交互作用三維響應(yīng)面圖，如圖4所示。

表3 方差分析結(jié)果

Tab.3 Results of variance analysis

注：**為高顯著水平(P≤0.01)，*為顯著水平(0.01

圖4 各因素交互作用對艾葉揮發(fā)油提取率影響的響應(yīng)面分析Fig.4 Response surface analysis for effect of interaction between each factor on extraction rate of Artemisia argyi volatile oil

響應(yīng)面圖和等高線圖能夠直觀地反映出各因素之間相互作用對響應(yīng)值的影響。等高線的形狀反映出交互效應(yīng)的強(qiáng)弱，橢圓形表示兩因素交互作用顯著，而圓形則表示兩因素交互作用較弱。從圖4可以看出，浸泡時(shí)間與料液比的交互作用、浸泡時(shí)間與提取時(shí)間的交互作用、料液比與提取時(shí)間的交互作用均顯著。經(jīng)Design-Expert軟件分析艾葉揮發(fā)油的最佳提取工藝條件為：浸泡時(shí)間1.628 h、料液比1∶8.85、提取時(shí)間4.611 h，在此條件下，艾葉揮發(fā)油提取率為0.836%。結(jié)合實(shí)際操作情況，將最佳提取工藝條件修正為：浸泡時(shí)間1.5 h、料液比1∶10、提取時(shí)間4.5 h。

2.2.3 工藝驗(yàn)證

在最佳提取工藝條件下進(jìn)行3次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，揮發(fā)油提取率分別為0.83%、0.82%和0.83%，相對平均偏差為0.52%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為0.70%，說明基于Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)獲得的最佳提取工藝參數(shù)可靠，具有實(shí)用價(jià)值。

2.3 艾葉揮發(fā)油的抗氧化性能

DPPH自由基是一種以氮為中心的自由基，作為一種穩(wěn)定的自由基，在紫外區(qū)300～400 nm之間具有強(qiáng)烈吸收，溶液呈深紫色，但被中和之后會(huì)變?yōu)闊o色或淺黃色。因此，本研究采用DPPH自由基清除率來考察艾葉揮發(fā)油的抗氧化性能。艾葉揮發(fā)油濃度對DPPH自由基清除率的影響如圖5所示。

圖5 艾葉揮發(fā)油濃度對DPPH自由基清除率的影響Fig.5 Effect of Artemisia argy volatile oil concentration on scavenging rate of DPPH free radicals

從圖5可以看出，艾葉揮發(fā)油濃度對DPPH自由基清除率的影響較大，呈一定的濃度依賴性。當(dāng)艾葉揮發(fā)油濃度為80 mg·mL-1時(shí)，DPPH自由基清除率最高，為39.12%。

3 結(jié)論

以艾葉揮發(fā)油提取率為考核指標(biāo)，采用單因素實(shí)驗(yàn)考察浸泡時(shí)間、料液比、提取時(shí)間等對艾葉揮發(fā)油提取率的影響，在此基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面法優(yōu)化艾葉揮發(fā)油的共水蒸餾提取工藝，并通過紫外分光光度法測定艾葉揮發(fā)油對DPPH自由基的清除率來評價(jià)其抗氧化性能。確定艾葉揮發(fā)油的最佳提取工藝條件為：浸泡時(shí)間1.5 h、料液比1∶10、提取時(shí)間4.5 h，在此條件下，艾葉揮發(fā)油提取率最高，為0.83%。當(dāng)艾葉揮發(fā)油濃度為80 mg·mL-1時(shí)，DPPH自由基清除率最高，為39.12%，表明艾葉揮發(fā)油具有一定的抗氧化活性。采用響應(yīng)面法對艾葉揮發(fā)油共水蒸餾法提取工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，可有效降低工藝操作條件的摸索次數(shù)，為艾葉類產(chǎn)品的進(jìn)一步開發(fā)奠定基礎(chǔ)。