林 旸，王 月，王海燕，高月麒，任風(fēng)芝，李曉露，張雪霞

(華北制藥集團(tuán)新藥研究開發(fā)有限責(zé)任公司 微生物藥物國家工程研究中心河北省工業(yè)微生物代謝工程技術(shù)研究中心，河北 石家莊 050015)

非達(dá)霉素(Fidaxomicin)是一種十八元環(huán)結(jié)構(gòu)的新型大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，屬于窄譜型抗菌藥物[1-2]。其抗菌作用機(jī)理新穎，通過抑制RNA聚合酶對(duì)抗艱難梭菌，能針對(duì)性地殺滅艱難梭菌，使腸道菌群恢復(fù)正常，從而降低艱難梭菌感染復(fù)發(fā)率[3]。與治療艱難梭菌感染的傳統(tǒng)藥物萬古霉素相比，非達(dá)霉素具有更強(qiáng)的療效和更低的復(fù)發(fā)率，而且該藥物交叉耐藥性低，不良反應(yīng)少，目前臨床試驗(yàn)中尚無非達(dá)霉素耐藥性的報(bào)道[4-6]。

非達(dá)霉素通過桔橙指孢囊菌發(fā)酵而得，屬于B類臺(tái)勾霉素，主要通過微生物發(fā)酵生產(chǎn)[7]。在菌種選育、發(fā)酵提取過程中，往往有大量樣品需要檢測，而中國藥典(2015年版)和美國藥典(USP 40)尚未將非達(dá)霉素收載。因此，建立快速、準(zhǔn)確、精密的分析方法對(duì)于非達(dá)霉素菌種選育和工藝研究尤為重要。近年來，國內(nèi)也有少量關(guān)于非達(dá)霉素定性分析方面的研究報(bào)道[8-9]，如江宏磊等[9]以甲醇-0.1%甲酸水溶液為流動(dòng)相進(jìn)行等度洗脫，非達(dá)霉素出峰時(shí)間在16～17 min，整個(gè)色譜采集周期為30 min，分析時(shí)間較長，不能滿足大批量樣品的處理，而且其線性范圍取值較窄，無法準(zhǔn)確測定后續(xù)樣品的含量。基于此，作者采用HPLC法測定非達(dá)霉素含量，擬為非達(dá)霉素菌種選育、發(fā)酵、提取過程樣品的含量及相關(guān)物質(zhì)分析提供一種簡便、快速、高效的方法。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 試劑與儀器

非達(dá)霉素發(fā)酵液，華北制藥集團(tuán)新藥研究開發(fā)有限責(zé)任公司；非達(dá)霉素標(biāo)準(zhǔn)品(含量99.2%)、去離子水，自制；乙腈(色譜純)，美國Merck公司；其它試劑均為國產(chǎn)分析純。

高效液相色譜儀(SPD-M20A 型紫外檢測器，LC-20AT型泵，SIL-20A型自動(dòng)進(jìn)樣器，CTO-10AS型柱溫箱)，日本Shimadzu公司；TGL-16G型高速離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠。

1.2 溶液的配制

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液

精密稱取非達(dá)霉素標(biāo)準(zhǔn)品25 mg，置于50 mL容量瓶中，乙醇溶解并定容，搖勻，制成0.5 mg·mL-1的非達(dá)霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液，冰箱內(nèi)保存，備用。

1.2.2 發(fā)酵液供試溶液

發(fā)酵液真空抽濾后，得到非達(dá)霉素菌絲體。將乙醇加入菌絲體中至發(fā)酵液體積，振蕩浸泡1 h，離心，浸提液經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾，即得發(fā)酵液供試溶液。非達(dá)霉素為胞內(nèi)產(chǎn)物，菌絲體中所占比例大于95%，故所測浸提液單位可以視為發(fā)酵液中的非達(dá)霉素含量。

1.3 色譜條件

Unitary C18色譜柱(4.6 mm×150 mm,5 μm)，流動(dòng)相為乙腈-0.05%乙酸水溶液(55∶45，體積比)，流速1.0 mL·min-1，檢測波長230 nm，柱溫35 ℃，進(jìn)樣量10 μL，進(jìn)樣時(shí)間10 min。

2 結(jié)果與討論

2.1 檢測波長的確定

稱取非達(dá)霉素標(biāo)準(zhǔn)品適量，加入甲醇溶解，制成含非達(dá)霉素20 μg·mL-1的供試溶液，用紫外分光光度計(jì)在200～800 nm范圍內(nèi)掃描，結(jié)果如圖1所示。

圖1 非達(dá)霉素的紫外吸收光譜Fig.1 Ultraviolet absorption spectrum of Fidaxomicin

由圖1可知，非達(dá)霉素在230 nm、266 nm處均有較大吸收峰，其中266 nm處的吸收較弱。因此，選擇230 nm作為檢測波長。

2.2 檢出限和定量限

將非達(dá)霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行逐步稀釋后，進(jìn)樣10 μL進(jìn)行測定。檢出限色譜峰信噪比S/N≈3，定量限色譜峰S/N≈10。測得非達(dá)霉素的檢出限為20 ng(相當(dāng)于進(jìn)樣量的0.4%)，定量限為60 ng(相當(dāng)于進(jìn)樣量的1.2%)。

2.3 系統(tǒng)適用性

分別精密量取10 μL非達(dá)霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液、發(fā)酵液供試溶液，進(jìn)樣測定，結(jié)果見圖2。

由圖2可知，在該色譜條件下，發(fā)酵液供試溶液與非達(dá)霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液出峰時(shí)間一致，峰型良好，表明非達(dá)霉素與有關(guān)物質(zhì)可以達(dá)到基線分離。

2.4 方法學(xué)驗(yàn)證

2.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線和線性關(guān)系

精密稱取非達(dá)霉素標(biāo)準(zhǔn)品100 mg，置于50 mL容量瓶中，乙醇溶解并定容至刻度，搖勻，然后逐級(jí)稀釋為濃度0.05 mg·mL-1、0.10 mg·mL-1、0.20 mg·mL-1、0.50 mg·mL-1、1.0 mg·mL-1、2.0 mg·mL-1的非達(dá)霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液，按1.3色譜條件分別進(jìn)樣，測定峰面積。以峰面積為縱坐標(biāo)(y)、進(jìn)樣濃度(x,mg·mL-1)為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為y=22973.2456x+480175.4222，相關(guān)系數(shù)R2=0.9991，截距1.0%。表明，非達(dá)霉素濃度在0.05～2.0 mg·mL-1范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

圖2 非達(dá)霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液(a)、發(fā)酵液供試溶液(b)的高效液相色譜Fig.2 HPLC spectra of Fidaxomicin standard solution(a) and fermentation broth test solution(b)

2.4.2 重復(fù)性

精密吸取同一批次發(fā)酵液，按1.2.2方法平行制備6份發(fā)酵液供試溶液，按1.3色譜條件進(jìn)行測定，測得非達(dá)霉素峰面積RSD為0.4%。表明該方法重復(fù)性好。

2.4.3 精密度

精密吸取同一批次發(fā)酵液，按1.2.2方法平行制備6份發(fā)酵液供試溶液，由不同分析人員使用不同儀器，連續(xù)進(jìn)樣6次，按1.3色譜條件進(jìn)行測定，測得非達(dá)霉素峰面積RSD為0.75%。表明該方法精密度良好。

2.4.4 耐用性

通過微調(diào)整柱溫、流速、流動(dòng)相中乙酸含量、波長(表1)，考察非達(dá)霉素測定結(jié)果不受影響的程度。要求不同色譜條件參數(shù)下，RSD≤2.0%。

表1色譜條件的變動(dòng)范圍

Tab.1 Range of variation of chromatographic conditions

參數(shù)色譜條件變動(dòng)范圍柱溫/℃3530,40流速/(mL·min-1)1.00.95,1.05流動(dòng)相中乙酸含量/%0.050.045,0.055波長/nm230228,232

結(jié)果發(fā)現(xiàn)，改變以上色譜參數(shù)時(shí)，所測樣品濃度幾乎不變，柱溫、流速、流動(dòng)相中乙酸含量、波長變化時(shí)，RSD分別為0.83%、1.6%、1.6%、1.2%，均符合要求。表明該方法在對(duì)色譜參數(shù)做微小變動(dòng)時(shí)，非達(dá)霉素測定結(jié)果所受影響較小。

2.4.5 穩(wěn)定性

取發(fā)酵液供試溶液于室溫下保存，每隔2 h取10 μL進(jìn)行測定，考察供試溶液在24 h內(nèi)的穩(wěn)定性。測得非達(dá)霉素峰面積RSD為0.27%，表明供試溶液室溫下放置24 h穩(wěn)定。

2.4.6 加標(biāo)回收率

分別精密稱取非達(dá)霉素標(biāo)準(zhǔn)品25 mg、50 mg、75 mg各3份，分別置于50 mL容量瓶中，用已知含量的浸提液溶解，各進(jìn)樣10 μL，測定峰面積，結(jié)果見表2。

表2非達(dá)霉素的加標(biāo)回收率

Tab.2 Adding standard recovery of Fidaxomicin

由表2可知，樣品平均加標(biāo)回收率為93.5%，RSD為0.8%。

2.5 非達(dá)霉素含量的測定

取3批發(fā)酵液供試溶液于樣品瓶中，按1.3色譜條件進(jìn)行測定，發(fā)酵液中非達(dá)霉素的出峰時(shí)間與標(biāo)準(zhǔn)品吻合，與其它有關(guān)物質(zhì)能有效分離。按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算非達(dá)霉素含量，結(jié)果見表3。

表3發(fā)酵液中非達(dá)霉素含量/(mg·mL-1)

Tab.3 Content of Fidaxomicin in fermentation broth/(mg·mL-1)

3 結(jié)論

建立了快速檢測非達(dá)霉素含量的HPLC方法，并對(duì)其進(jìn)行了方法學(xué)驗(yàn)證。結(jié)果表明，非達(dá)霉素濃度在 0.05～2.0 mg·mL-1范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)R2=0.9991；樣品平均加標(biāo)回收率為93.5%，RSD為0.8%。該方法精密性、重復(fù)性、穩(wěn)定性、耐用性良好，且操作簡單，快速有效，回收率良好，適用于含非達(dá)霉素樣品的檢測，解決了微生物發(fā)酵法產(chǎn)生大量樣品而檢測速度慢的問題，為進(jìn)一步優(yōu)化非達(dá)霉素生產(chǎn)工藝奠定了基礎(chǔ)。