翁丹楓，黎三艷，唐堅(jiān)清，陳余朋，李國(guó)平，張 聲

骨髓組織富含鈣鹽，故制片前需要脫鈣處理，脫鈣不全或脫鈣過(guò)度均可影響骨髓組織切片的H-E染色或免疫組織化學(xué)染色效果，降低病理診斷的準(zhǔn)確率。筆者前期配制了一種適合骨髓組織脫鈣的改良EDTA脫鈣液，可在24 h內(nèi)使骨髓組織脫鈣完全，有利于提高骨髓疾病診斷的準(zhǔn)確性[1]。為提高工作效率，同時(shí)避免人工操作誤差，使脫鈣過(guò)程穩(wěn)定，本研究嘗試將MYR SS-30全自動(dòng)染色機(jī)改造應(yīng)用于骨髓組織的EDTA脫鈣處理中，并探討最佳的EDTA脫鈣程序和脫鈣時(shí)間，以便使后期臨床工作流程標(biāo)準(zhǔn)化、規(guī)范化。

1 臨床資料

1.1一般資料 選取2017年11月-2018年3月由病理科接收的不同部位惡性骨腫瘤標(biāo)本30例，男性19例，女性11例，年齡(28±9)歲(6～47歲)。骨腫瘤部位：股骨21例，肱骨6例，脛骨3例。

1.2方法

1.2.1儀器與試劑 全自動(dòng)染色機(jī)(MYR SS-30，廣州維格斯公司)；脫水機(jī)(Pathcenter，美國(guó)Thermo公司)；多功能染色機(jī)(ST5020，德國(guó)Leica公司)；全自動(dòng)免疫組織化學(xué)染色機(jī)(Autostainer Link 48，丹麥Dako公司)。40%甲醛(上海東懿化學(xué)試劑有限公司)；10%中性福爾馬林固定液；改良EDTA脫鈣液。

1.2.2配制改良EDTA脫鈣液(pH為7.0) 取250 g的EDTA-2Na，溶于1 350 mL磷酸鹽緩沖液中(0.01 mol/L，pH為7.2～7.4)，待溶液徹底溶解后加入40%甲醛150 mL，加入氫氧化鈉調(diào)節(jié)溶液pH值至7.0[1]。

1.2.3脫鈣處理 每例骨腫瘤標(biāo)本均用直徑為0.2 cm的骨髓穿刺針在松質(zhì)骨部位穿刺長(zhǎng)1 cm的骨髓組織5條，隨機(jī)各取1條骨髓組織放入已做好分組標(biāo)記的包埋盒中：A組為手工EDTA脫鈣組，室溫下脫鈣時(shí)間為24 h；B組為全自動(dòng)染色機(jī)EDTA脫鈣組，室溫下脫鈣時(shí)間分別為16，18，20及22 h。

1.2.4脫鈣機(jī)(改造后的全自動(dòng)染色機(jī))操作步驟 先將穿刺好的骨髓組織塊放入配套的改造的染色架(圖1)，再放入染色機(jī)的進(jìn)口位，染色機(jī)試劑缸位如圖2所示，根據(jù)不同脫鈣時(shí)間選擇相應(yīng)脫鈣程序(表1)，脫鈣結(jié)束后，染色機(jī)發(fā)出提示音提醒，即可直接上機(jī)進(jìn)入脫水程序。

1.2.5H-E染色及免疫組織化學(xué)染色 切片行常規(guī)H-E染色，免疫組織化學(xué)染色采用EnVision兩步法。由兩名高級(jí)職稱(chēng)病理醫(yī)師閱片判定H-E染色及免疫組織化學(xué)染色效果。

表1 MYR SS-30染色機(jī)脫鈣程序(16 h)

Tab 1 Decalcification procedure of MYR SS-30 staining machine (16 h)

步驟缸位試劑時(shí)間(min∶s)抖動(dòng)(s)上下震蕩(次)11,210%中性福爾馬林(裝載)30∶00(×2)1(×2)10(×2)23,4蒸餾水30∶00(×2)1(×2)10(×2)35EDTA59∶59110410空白缸00∶010055,6EDTA59∶59(×2)1(×2)10(×2)610空白缸00∶010076,7EDTA59∶59(×2)1(×2)10(×2)810空白缸00∶010097,8EDTA59∶59(×2)1(×2)10(×2)1010空白缸00∶0100118,9EDTA59∶59(×2)1(×2)10(×2)1210空白缸00∶0100139,11EDTA59∶59(×2)1(×2)10(×2)1410空白缸00∶01001511,12EDTA59∶59(×2)1(×2)10(×2)1610空白缸00∶01001712,13EDTA59∶59(×2)1(×2)10(×2)1810空白缸00∶01001913EDTA59∶591102014蒸餾水15∶001102115,1670%酒精(卸載)00∶0100

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗(yàn)或Fisher確切概率法，P<0.05為差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1H-E染色結(jié)果 EDTA手工脫鈣和全自動(dòng)染色機(jī)EDTA脫鈣液脫鈣骨髓組織形態(tài)完整，胞核和胞質(zhì)層次分明，染色均勻，色質(zhì)鮮艷，對(duì)比度好(圖3)；全自動(dòng)染色機(jī)EDTA脫鈣，16 h組28例H-E染色效果佳，而18，20及22 h組30例H-E染色效果均佳，與手工EDTA脫鈣H-E染色效果差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.2免疫組織化學(xué)染色結(jié)果 經(jīng)手工EDTA脫鈣及全自動(dòng)染色機(jī)EDTA脫鈣骨髓組織免疫組織化學(xué)染色陽(yáng)性定位準(zhǔn)確(圖4)；經(jīng)手工EDTA脫鈣與全自動(dòng)染色機(jī)EDTA脫鈣時(shí)間分別為16，18，20及22 h骨髓組織相比，Kappa，Ki-67，Lambda和MPO 4個(gè)抗體表達(dá)陽(yáng)性率差別均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，表2)；經(jīng)全自動(dòng)染色機(jī)EDTA不同脫鈣時(shí)間骨髓組織在上述指標(biāo)免疫組織化學(xué)表達(dá)差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，表3)。

表2 不同脫鈣處理骨髓免疫組織化學(xué)染色

Tab 2 Immunohistochemical expression under different decalcification procedures

染色機(jī)EDTA脫鈣(16 h)手工EDTA脫鈣高表達(dá)低表達(dá)Kappa 高表達(dá)254 低表達(dá)10Ki-67 高表達(dá)253 低表達(dá)11Lambda 高表達(dá)251 低表達(dá)04MPO 高表達(dá)271 低表達(dá)02

表3 改造染色機(jī)EDTA不同脫鈣時(shí)間免疫組織化學(xué)表達(dá)

Tab 3 Immunohistochemical expression under EDTA decalcification with different time via modified staining machine

t脫鈣/hKappa高表達(dá)低表達(dá)Ki-67高表達(dá)低表達(dá)Lambda高表達(dá)低表達(dá)MPO高表達(dá)低表達(dá)16264273246282182912822642822030027327328222291273273291

3 討 論

骨腫瘤的骨髓組織中含有大量的鈣鹽，脫鈣是應(yīng)用化學(xué)或物理的方法將骨組織成分中的鈣鹽與膠原纖維分離后棄去鈣鹽，保留完整的膠質(zhì)纖維成分[2]。EDTA是一種優(yōu)良的脫鈣劑，對(duì)骨組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)和抗原性破壞較小。因此，常用于需要脫鈣的免疫組織化學(xué)染色[3]。EDTA脫鈣液在4%～16%濃度中以10%和13%濃度的脫鈣效果最好，在20 ℃條件下，骨松質(zhì)需要3～3.5 d脫鈣完成。本實(shí)驗(yàn)選用濃度為13%的EDTA，手工操作脫鈣時(shí)間為24 h，但實(shí)際工作中經(jīng)常遇到?jīng)]有及時(shí)中止脫鈣而造成病理診斷周期延長(zhǎng)，增加了患者的等待時(shí)間，不能很好地滿足臨床診療需要。而經(jīng)改造的全自動(dòng)染色機(jī)脫鈣的骨髓組織最短16 h可脫鈣完成，且高效、穩(wěn)定，保證了骨髓標(biāo)本脫鈣處理的規(guī)范化。

本研究將全自動(dòng)染色機(jī)應(yīng)用于EDTA骨髓組織脫鈣前進(jìn)行了如下改造：(1)將染色機(jī)配套染色架相鄰兩個(gè)片槽之間的間隔鋸掉，使之能夠裝載組織包埋盒，改造后的架子可同時(shí)裝載10個(gè)包埋盒；(2)將染色機(jī)入水口和排水口封閉改造成缸位，改造后有16個(gè)缸位可全部用于放置脫鈣所需液缸；(3)機(jī)子共有8個(gè)缸位放置EDTA脫鈣液，每缸限定的最長(zhǎng)停留時(shí)間為59 min 59 s，組織在所有脫鈣液缸中走完一遍僅8 h，又因脫鈣程序只能從起點(diǎn)到終點(diǎn)按順序而不能逆向運(yùn)行。因此，筆者在10號(hào)站點(diǎn)設(shè)置一個(gè)空缸，組織在每缸EDTA脫鈣液中停留時(shí)間達(dá)59 min 59 s后到空缸，停留1 s后回到原來(lái)的脫鈣液缸位繼續(xù)脫鈣，從而使可運(yùn)行的脫鈣時(shí)間加倍。

改造后的全自動(dòng)染色機(jī)用于脫鈣的優(yōu)點(diǎn)：(1)縮短脫鈣時(shí)間，脫鈣過(guò)程中組織隨染色架的上下震蕩加速脫鈣液滲入組織，脫鈣時(shí)間縮短至16 h，比傳統(tǒng)手工法快8 h；(2)增加可脫鈣時(shí)長(zhǎng)：空缸的設(shè)置使可運(yùn)行的脫鈣時(shí)間加倍；(3)防止脫鈣過(guò)度：脫鈣完成后的報(bào)警裝置能夠提醒操作人員及時(shí)進(jìn)行后續(xù)處理；(4)標(biāo)本處理量增多：改造后的染色機(jī)可同時(shí)運(yùn)行5個(gè)不同的脫鈣程序，最多可同時(shí)處理50個(gè)組織標(biāo)本；(5)減少環(huán)境污染：全自動(dòng)染色機(jī)脫鈣流程均在密閉的空間內(nèi)進(jìn)行，且配置了活性碳過(guò)濾系統(tǒng)，極大減少了化學(xué)試劑的環(huán)境污染和揮發(fā)性刺激，為技術(shù)員提供一個(gè)安全、健康、環(huán)保的工作環(huán)境；(6)配有備用電池：可以防止運(yùn)行過(guò)程中出現(xiàn)斷電現(xiàn)象。

全自動(dòng)染色機(jī)改造應(yīng)用于EDTA骨髓組織脫鈣時(shí)應(yīng)注意：(1)多個(gè)脫鈣程序同時(shí)運(yùn)行時(shí)，前一個(gè)程序運(yùn)行到第三缸的時(shí)候，后一個(gè)程序才可以開(kāi)始運(yùn)行，否則易導(dǎo)致染色機(jī)無(wú)法區(qū)分不同程序；(2)當(dāng)脫鈣達(dá)到200個(gè)蠟塊左右時(shí)更換EDTA脫鈣液，優(yōu)先更換5～9號(hào)缸脫鈣液，11～13號(hào)缸脫鈣液按順序前移，以保證脫鈣液純度的同時(shí)最大程度節(jié)約試劑；(3)當(dāng)有≥3個(gè)的程序同時(shí)運(yùn)行時(shí)，應(yīng)在脫鈣結(jié)束后盡快卸載取走組織直接進(jìn)入脫水模式，以免影響后續(xù)程序的運(yùn)行。

綜上所述，將全自動(dòng)染色機(jī)改造應(yīng)用于EDTA骨髓組織脫鈣操作簡(jiǎn)單，脫鈣時(shí)間短，組織的形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)和抗原活性完整保留，能夠滿足臨床快速診療的需要。應(yīng)用改造染色機(jī)脫鈣實(shí)現(xiàn)了機(jī)器取代人工操作的線性規(guī)范化流程，節(jié)省人力，且由于始終在封閉的環(huán)境中運(yùn)行，有效減少有毒化學(xué)試劑吸入的危害，有利于環(huán)保，值得在骨髓活檢組織等標(biāo)本處理過(guò)程中推廣應(yīng)用。