代泳波 熊銳

硼酸（硼砂）曾作為食品防腐劑和膨松劑被用于水產(chǎn)品、肉制品及面食制品等食品中，但由于其具有較強(qiáng)毒性而被禁用，原衛(wèi)生部發(fā)布的《食品中可能違法添加的非食用物質(zhì)和易濫用的食品添加劑名單（第1-5批匯總）》中明確將硼酸與硼砂列入食品中可能違法添加的非食用物質(zhì)名單，即任何食品中不得檢出。食品中硼酸與硼砂檢測(cè)方法依據(jù)《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中硼酸的測(cè)定》（GB 5009.275-2016），其原理為通過(guò)乙基己二醇-三氯甲烷溶液對(duì)樣品中的硼酸（硼砂）進(jìn)行快速的富集、萃取，除去共存鹽類(lèi)的影響，利用硫酸與姜黃混合生成的質(zhì)子化姜黃與硼酸反應(yīng)生成紅色產(chǎn)物，溶液顏色的深淺與樣品中硼酸（硼砂）含量成正比，通過(guò)分光光度計(jì)定量測(cè)定樣品中硼酸（硼砂）的含量。但在實(shí)際樣品檢測(cè)過(guò)程中有時(shí)會(huì)出現(xiàn)同一濃度標(biāo)準(zhǔn)品的顯色深淺有差異且標(biāo)準(zhǔn)曲線線性不好的情況，為探究導(dǎo)致顯色不穩(wěn)定的原因，按照實(shí)驗(yàn)步驟，根據(jù)日常檢測(cè)過(guò)程中可能出現(xiàn)的因素逐步進(jìn)行原因分析并設(shè)計(jì)以下實(shí)驗(yàn)。

一、實(shí)驗(yàn)材料

1.試劑：蒸餾水，無(wú)水乙醇（AR），冰醋酸（AR），三氯甲烷（AR），2-乙基-1，3-己二醇（AR），硼酸標(biāo)準(zhǔn)溶液（500μg/mL）。

2.儀器、器皿：雙光束紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（TU1900北京普析通用儀器有限責(zé)任公司），渦旋振蕩器（EYELA上海愛(ài)朗儀器有限公司），千分之一電子天平（JY203上海浦春計(jì)量?jī)x器有限公司），50ml塑料離心管，100mL塑料容量瓶，200mL塑料燒杯，快速濾紙。

二、實(shí)驗(yàn)方法及結(jié)果分析

1.不同姜黃色素對(duì)顯色的影響。GB 5009.275-2016中提到的顯色劑為姜黃色素，姜黃色素是以姜黃素為主的一種黃色略帶酸性的二苯基庚烴物質(zhì)的統(tǒng)稱(chēng)，主要包括姜黃素（C21H20O6，分子量368，約占70%）、脫甲氧基姜黃素（C20H18O5，分子量338，約占15%）和雙脫甲氧基姜黃素（C19H16O4，分子量308，約占10%），及四氫姜黃素、脫甲氧基四氫姜黃素、雙脫甲氧基四氫姜黃素。檢驗(yàn)過(guò)程中會(huì)使用到不同品牌的姜黃色素，為驗(yàn)證不同姜黃色素對(duì)顯色的影響，在其他試劑及實(shí)驗(yàn)條件一致的情況下，使用5種姜黃色素做顯色劑分別做標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)比。試驗(yàn)結(jié)果如下。

根據(jù)圖1數(shù)據(jù)可知，不同的姜黃色素，除了四氫姜黃素不顯色外，其他色素均能顯色且標(biāo)準(zhǔn)曲線均成直線，整體吸光度值略有差異。根據(jù)表3的數(shù)據(jù)可知，在能顯色的色素中，不含硼酸時(shí)除進(jìn)口姜黃素顯紅色外，其他姜黃素均為黃色，吸光度值差異不大；含有硼酸時(shí)，相同濃度下雙去甲氧基姜黃素顯色最淺，進(jìn)口姜黃素顯色最深，含甲氧基多的姜黃色素顏色深于含甲氧基少的姜黃色素，國(guó)產(chǎn)和進(jìn)口的姜黃素顯色深淺也不一樣。因此在日常檢測(cè)過(guò)程中出現(xiàn)顯色不一致的情況，主要原因是使用了不同品牌的姜黃素，但只要使用能顯色的姜黃色素，均能保證標(biāo)準(zhǔn)曲線線性正常，不會(huì)導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果不穩(wěn)定。

根據(jù)表4的驗(yàn)證結(jié)果來(lái)看，隨著標(biāo)準(zhǔn)品過(guò)濾液靜置時(shí)間的延長(zhǎng)，顯色略有加深，短時(shí)間內(nèi)吸光度值變化不大。因此在樣品檢測(cè)過(guò)程中，如果因?yàn)闄z測(cè)樣品過(guò)多導(dǎo)致樣品待測(cè)液靜置時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，并不會(huì)導(dǎo)致顯色異常。

3.濃硫酸對(duì)顯色的影響。濃硫酸在顯色過(guò)程中的作用是將姜黃素質(zhì)子化，再與硼酸發(fā)生顯色反應(yīng)。但是在日常檢測(cè)過(guò)程中使用的濃硫酸不能保證每次都是同一品牌、同一級(jí)別、同一批次，且濃硫酸在使用過(guò)程中避免不了與空氣接觸而吸收空氣中的水分。為驗(yàn)證濃硫酸對(duì)顯色的影響，特設(shè)計(jì)如下實(shí)驗(yàn)：

（1）使用不同品牌、不同級(jí)別及不同批次的濃硫酸，其他條件一致，僅檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)品吸光度值，驗(yàn)證數(shù)據(jù)見(jiàn)表5。根據(jù)表5的結(jié)果來(lái)看，無(wú)論是分析純、優(yōu)級(jí)純還是不同品牌的硫酸，對(duì)顯色不存在明顯的差異。

（2）使用同一品牌、同一批次但啟用時(shí)間不同的的濃硫酸，其他條件一致，僅檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)品吸光度值，驗(yàn)證數(shù)據(jù)見(jiàn)圖2。根據(jù)圖2的驗(yàn)證結(jié)果，使用的濃硫酸會(huì)隨啟用時(shí)間的延長(zhǎng)而導(dǎo)致顯色越來(lái)越淺。當(dāng)一瓶濃硫酸頻繁開(kāi)啟使用或使用周期太長(zhǎng)，就會(huì)導(dǎo)致顯色非常淺且標(biāo)準(zhǔn)曲線線性差，影響檢測(cè)結(jié)果。原因是高于70%濃硫酸都具有吸水性，頻繁使用的濃硫酸會(huì)在使用過(guò)程中吸收空氣中的水分導(dǎo)致濃度下降，如果在顯色過(guò)程中使用了此類(lèi)濃硫酸就會(huì)導(dǎo)致顯色異常。因此在檢測(cè)過(guò)程中要盡量選擇新開(kāi)啟或開(kāi)啟時(shí)間不長(zhǎng)的濃硫酸，從而保證檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確且穩(wěn)定。

4.顯色時(shí)間及顯色后靜置時(shí)間長(zhǎng)短對(duì)顯色的影響。根據(jù)GB 5009.275-2016中5.2中關(guān)于顯色的描述：“各取1.00mL過(guò)濾液于50mL塑料試管中，依次加入姜黃-冰乙酸溶液1.0mL、硫酸0.5mL，搖勻，靜置30min，加無(wú)水乙醇25mL，靜置10min。”其中對(duì)顯色時(shí)間要求30min，對(duì)定容后靜置時(shí)間要求10min，但是實(shí)際檢測(cè)過(guò)程中，當(dāng)檢測(cè)樣品數(shù)量較多時(shí)會(huì)出現(xiàn)實(shí)際顯色時(shí)間和靜置時(shí)間過(guò)長(zhǎng)的問(wèn)題，為驗(yàn)證該因素是否會(huì)對(duì)檢測(cè)結(jié)果造成影響，設(shè)計(jì)如下實(shí)驗(yàn)：

（1）僅做標(biāo)準(zhǔn)曲線，減少前后時(shí)間差，其他條件完全一致，分別將顯色時(shí)間設(shè)置為30-60min，查看顯色情況，實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證結(jié)果見(jiàn)表6。根據(jù)表6的驗(yàn)證數(shù)據(jù)，隨著顯色時(shí)間的延長(zhǎng)，吸光度值略有上升但整體變化不大。

（2）僅做標(biāo)準(zhǔn)曲線，減少前后時(shí)間差，其他條件完全一致，分別將顯色后靜置時(shí)間設(shè)置為10-60min，查看顯色情況，實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證結(jié)果見(jiàn)表7。根據(jù)表7的驗(yàn)證數(shù)據(jù)，定容后靜置時(shí)間超過(guò)10min，吸光度值幾乎沒(méi)有發(fā)生變化。因此檢測(cè)樣品數(shù)量較大導(dǎo)致顯色時(shí)間和顯色后靜置時(shí)間過(guò)長(zhǎng)并不會(huì)引起顯色異常，不會(huì)影響檢測(cè)結(jié)果。

5.檢測(cè)環(huán)境溫度對(duì)顯色的影響。三氯甲烷和冰醋酸具有刺激性，必須在通風(fēng)柜中進(jìn)行操作，而通風(fēng)柜中很難控制環(huán)境溫度，不同季節(jié)的環(huán)境溫度差異也較大。為驗(yàn)證在不同溫度下的顯色情況，特設(shè)計(jì)如下實(shí)驗(yàn)：將處理后的標(biāo)準(zhǔn)品過(guò)濾液和顯色所需濃硫酸、姜黃色素和定容用乙醇分別置于室溫下通風(fēng)柜（約20℃）、鼓風(fēng)冷藏柜（約5℃）和鼓風(fēng)恒溫箱（約35℃）中，在測(cè)量吸光度值前的操作全部置于各自溫度條件中進(jìn)行，顯色后測(cè)量吸光度值，實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證結(jié)果見(jiàn)表8。

根據(jù)表8的驗(yàn)證結(jié)果，在不同溫度下，同一濃度標(biāo)準(zhǔn)品過(guò)濾液吸光度值變化不大，因此不會(huì)出現(xiàn)因?yàn)榄h(huán)境溫度的不同而導(dǎo)致顯色異常。

綜合以上實(shí)驗(yàn)得出如下結(jié)論：按照G B 5009.275-2016檢測(cè)硼酸的過(guò)程中，出現(xiàn)顯色情況不一致是使用不了不同的姜黃色素，不同的姜黃色素顯色會(huì)有深淺差異，部分色素存在紅色本底，但不影響標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢測(cè)結(jié)果。而日常的檢測(cè)過(guò)程中可能遇到的樣品待測(cè)液靜置時(shí)間過(guò)長(zhǎng)、顯色反應(yīng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)、定容后靜置時(shí)間過(guò)長(zhǎng)、反應(yīng)溫度過(guò)低過(guò)高都不會(huì)對(duì)顯色造成明顯的影響。影響檢測(cè)結(jié)果穩(wěn)定性的因素是使用了不同濃度的濃硫酸，如果濃硫酸開(kāi)啟時(shí)間過(guò)長(zhǎng)且期間反復(fù)使用，會(huì)導(dǎo)致濃硫酸吸水而濃度下降，使用了濃度下降的濃硫酸進(jìn)行顯色反應(yīng)會(huì)導(dǎo)致顯色異常，造成檢測(cè)結(jié)果不穩(wěn)定。為保證檢測(cè)過(guò)程中顯色穩(wěn)定，需使用新開(kāi)啟的濃硫酸或開(kāi)啟后使用次數(shù)較少、保存良好的濃硫酸。