曹興林　惲君雯　陳麗　宋偉　　侯繼波　馮磊　徐業(yè)芬

摘要：為了建立高品質(zhì)的犬腎（MDCK）單克隆細胞系，使用CRISPR/Cas9技術(shù)實現(xiàn)MDCK細胞IFN-β1基因的敲除，構(gòu)建細胞培養(yǎng)禽流感病毒（AIV）增殖體系。首先，根據(jù)CRISPR/Cas9系統(tǒng)的技術(shù)要求構(gòu)建了Cas9表達載體和sgRNA載體;然后，用3種載體共轉(zhuǎn)染MDCK細胞，通過GFP陽性特征分選單細胞克隆，單細胞克隆培養(yǎng)在96孔板中。通過PCR擴增和對IFN-β1靶序列進行測序，確定了陽性MDCK單細胞克隆中IFN-β1的敲除。結(jié)果成功構(gòu)建了具有IFN-β1敲除的MDCK單細胞克隆細胞系，與原始細胞相比，該細胞系的病毒增殖能力提高。

關(guān)鍵詞：CRISPR/Cas9;犬腎（MDCK）細胞;IFN-β1;禽流感病毒（AIV）;增毒能力

中圖分類號： S852.65+7文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2020）07-0059-06

禽流感（AI）是由禽流感病毒（AIV）引起的禽類烈性傳染病，由于其血清型多，易發(fā)生變異[1-3]，給國際養(yǎng)禽業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失，而且在人類公共衛(wèi)生上也造成重大影響[4-7]，從而引起了研究人員的高度關(guān)注。犬腎（MDCK）細胞是目前用于禽流感病毒增殖主要的宿主細胞[8-9]。有研究表明，當禽流感病毒在MDCK細胞中的連續(xù)傳代時，其增殖效率呈現(xiàn)出逐漸下降的趨勢。甚至在連續(xù)增殖到某一代次時，禽流感病毒的增殖效率會出現(xiàn)斷崖式下降。造成這一情況的原因目前尚不明確，但與子代病毒粒子中缺陷型病毒粒子占比的逐漸增加有關(guān)。而這種缺陷型病毒粒子的生成又與宿主細胞Ⅰ型干擾素介導(dǎo)的宿主細胞天然免疫拮抗病毒增殖有關(guān)。有關(guān)文獻表明，IFN-β1在禽流感病毒感染MDCK細胞的過程中可以誘發(fā)細胞產(chǎn)生天然免疫拮抗病毒增殖的信號通路，在病毒吸附、轉(zhuǎn)運、逆轉(zhuǎn)錄、復(fù)制以及芽殖等多個過程對病毒的增殖進行干擾。同時釋放到胞外的IFN-β1可通過細胞膜上的干擾素識別受體[10-11]，激活未被禽流感病毒感染的正常細胞的天然免疫系統(tǒng)，使得禽流感病毒在細胞間的傳播受到抑制。

CRISPR是細菌和古細菌用來對抗入侵病毒及外源 DNA 的免疫防御系統(tǒng)。因其機構(gòu)為成簇規(guī)律性間隔短回文重復(fù)序列，被命名為CRISPR[12]。目前CRISPR/Cas9已經(jīng)成為第三代基因編輯手段，較傳統(tǒng)基因編輯工具鋅指核酸酶（ZFNs）和轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)核酸酶（TALENs）而言，CRISPR/Cas9操作簡便、突變率高[13-15]。CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)已成功應(yīng)用于各種體外和體內(nèi)基因敲除模型的建立，成為重要的基因工程技術(shù)手段[16-18]。

綜上所述，通過基因工程手段敲除MDCK細胞的干擾素IFN-β1基因編碼片段，去除細胞的主要天然免疫信號傳遞分子，為提高禽流感病毒在MDCK細胞中的增殖效率提供新思路和新種質(zhì)資源。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗材料 MDCK細胞購自ATCC-CCL34、AIV-H9亞型病毒：A/chicken/Jiangsu/02/09（簡稱JS02），由國家獸用生物制品工程技術(shù)研究中心分離、保藏;pCMV-MCS-IRES-eGFP、pUC-sgRNA-cloning載體由國家獸用生物制品工程技術(shù)研究中心實驗室構(gòu)建提供。

1.1.2 試劑 DNA連接酶Solution Ⅰ、NheⅠ、XhoⅠ購于Takara Bio有限公司;限制性內(nèi)切酶BbsⅠ-HF購于NEB Labs;質(zhì)粒DNA提試劑盒，轉(zhuǎn)染試劑購于QIAGEN公司;FBS血清購于Thermoscientific;DMEM培養(yǎng)基來自本研究所;瓊脂粉Ager購于Biofroxx公司 ;氨芐，薄型瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒購于RENERAY Biochnology。

1.1.3 儀器梯度 PCR儀，Biometra公司;核酸電泳儀，全自動凝膠成像分析系統(tǒng)，上海天能公司;超微量紫外分光光度計，Nano Drop one;CO2細胞培養(yǎng)箱Thermo scientific;水浴鍋，低速離心機離心機，北京鼎昊源科技有限公司;高速離心機，Eppendorf公司。

1.2 方法

1.2.1 sgRNA引物的設(shè)計及構(gòu)建分析 犬IFN-β1的基因序列（Gene ID：481558），根據(jù)Cas9蛋白識別序列要求，并考慮序列的特異性以及可能的編輯脫靶效率，選取GCTCATGGCAAGAGCCATGGTGG為靶序列1，GATAATCTGTAAGTATATTAAGG為靶序列2。針對這2條靶序列，設(shè)計2對DNA oligo引物用于sgRNA表達載體的構(gòu)建，序列如下：sgRNA-1-F：5′-[JP9]CACCGGCTCATGGCAAGAGCCATGG-3′;sgRNA-1-R：5′-[JP9]AAACGCCATGGCTCTTGCCATGAGC-3′;sgRNA-2-F：5′-[JP9]CACCGGATAATCTGTAAGTATATTA-3′;sgRNA-2-R：5′-[JP9]AAACGTAATATACTTACAGATTATC-3′。2對靶序列引物分別經(jīng)退火處理，連接至經(jīng)BbsⅠ（購自NEB）處理的pUC-sgRNA-cloning載體，獲得pUC-sgRNA1和pUC-sgRNA2，用于后續(xù)轉(zhuǎn)染試驗。

1.2.2 pCas9-IRES-eGFP載體的構(gòu)建 根據(jù)犬的蛋白質(zhì)翻譯密碼子偏好性，優(yōu)化Cas9蛋白編碼序列，并在該序列2端各加入1條SV40病毒的NLS序列?；瘜W(xué)合成該序列（南京金斯瑞生物科技有限公司），用于載體構(gòu)建。PCR擴增Cas9片段（引物-F：5′-[JP9]GGGCTAGCATGGCCCCAAAGAAGAAG-3′;引物-R：5′-[JP9]GGCTCGAGCCCCAACCCCG-3′），產(chǎn)物經(jīng)NheⅠ和XhoⅠ處理。

1.2.3 細胞的轉(zhuǎn)染和分選 根據(jù)轉(zhuǎn)染試劑（Qiagen）的配制及使用說明，配制含有1.0 μg pCas9-IRES-GFP，各0.5 μg pUC-sgRNA1和pUC-sgRNA2的轉(zhuǎn)染復(fù)合物，經(jīng)轉(zhuǎn)染MDCK細胞后24 h，于熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染情況，對照細胞無綠色熒光，轉(zhuǎn)染細胞若轉(zhuǎn)染成功，即呈現(xiàn)綠色。轉(zhuǎn)染后48 h內(nèi)對轉(zhuǎn)染陽性細胞進行FACS細胞分選，將陽性細胞單克隆分選至含有10% FBS血清的MDCK細胞培養(yǎng)基中，設(shè)置每孔單個細胞克隆。置于正常培養(yǎng)環(huán)境下繼續(xù)培養(yǎng)1周待用。

1.2.4 單克隆細胞鑒定 待單細胞克隆恢復(fù)生長，制作細胞克隆復(fù)板，用于細胞克隆的繼續(xù)培養(yǎng)以及細胞克隆的基因組DNA的提取鑒定。針對犬IFN-β1基因序列合成PCR擴增引物F：5′-[JP9]ATGAAAGGGAGAACTGAAAGTGGG-3′和R：5′-[JP9]GTCAAGCATCGTCCATTCCGAGAG-3′。經(jīng)PCR擴增（98 ℃，30 s;98 ℃15 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 20 s，35個循環(huán);72 ℃10 min）。鑒定單克隆MDCK細胞的擴增片段，經(jīng)PCR產(chǎn)物測序結(jié)果，確定基因敲除的細胞克隆。

1.2.5 H9亞型禽流感病毒的增殖及血凝效價的測定

1.2.5.1 H9亞型禽流感病毒的增殖 MDCK母細胞、細胞克隆接種于6孔板中，待匯合度達到95%，以1%的接毒量加入H9亞型禽流感病毒JS02株，同時添加8 μg/mL的TPCK處理的胰蛋白酶用于病毒增殖，接毒3 d后反復(fù)凍融培養(yǎng)物，測定子代病毒HA效價。并按照上述接毒操作進行病毒的連續(xù)傳代，分別于不同代次測定病毒HA效價。

1.2.5.2 H9亞型病毒HA效價的檢測 采新鮮SPF公雞血，經(jīng)抗凝處理，以PBS清洗血球3次，配制成1%雞血球PBS液。在HA檢測96孔板上用定量稀釋器于每排各孔中加PBS 25 μL。以稀釋器吸取25 μL待測樣品于第一孔中，連續(xù)對倍稀釋該樣品至第11孔，棄去25 μL，第12孔不加樣品作為對照。每孔中補加25 μL PBS，然后每孔分別加入25 μL 1%雞血球PBS液，在振板器上振動20 s，室溫下作用30～40 min。作用結(jié)束后依據(jù)血球凝集程度判定反應(yīng)結(jié)果，以出現(xiàn)完全凝集的最大稀釋度為該樣品的血球凝集效價，以log2/25 μL來表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 pCas9-IRES-eGFP載體構(gòu)建

Cas9編碼序列的PCR產(chǎn)物核酸電泳結(jié)果如圖1-A所示，pCas9-IRES-eGFP載體經(jīng)NheⅠ和XhoⅠ雙酶切處理，產(chǎn)生4 227 bp和5 714 bp的2條片段，電泳結(jié)果如圖1-B所示，結(jié)果正確，pCas9-IRES-eGFP載體用于轉(zhuǎn)染試驗。

2.2 細胞轉(zhuǎn)染結(jié)果

瞬時轉(zhuǎn)染CRISPR/Cas9系統(tǒng)的3質(zhì)粒進入MDCK細胞24 h后，于熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染結(jié)果（圖2）。結(jié)果顯示，陰性對照MDCK細胞無綠色熒光，轉(zhuǎn)染后MDCK細胞呈現(xiàn)綠色熒光，圖2-B箭頭所指熒光代表轉(zhuǎn)染成功的MDCK細胞。

2.3 細胞流式分選

轉(zhuǎn)染48 h內(nèi)，以BD FACSDiva 8.0.1流式細胞儀進行細胞分選（圖3），綠色熒光表達強度最高（Top 1%～2%）的陽性MDCK細胞被分選至96孔板，形成單細胞克隆。

2.4 目標序列的PCR擴增及產(chǎn)物測序比對

待96孔板中單細胞克隆生長恢復(fù)，達到85%的生長匯合度，進行細胞復(fù)板操作。將復(fù)板后細胞克隆分別進行基因組DNA抽提及目標片段的PCR擴增，結(jié)果如圖4所示。對照細胞的擴增片段大小為767 bp，備選克隆的擴增片段如圖4中1～19號泳道所示。根據(jù)備選克隆的PCR擴增產(chǎn)物的條帶大小，將克隆1的250 bp左右條帶、克隆3的250 bp 左右條帶、克隆8的1 000 bp左右條帶、克隆10的250 bp左右條帶、克隆13的250 bp左右條帶、克隆14的250 bp左右條帶、克隆15的1 000 bp左右條帶、克隆16的250 bp左右條帶進行切膠回收并做PCR產(chǎn)物測序，與對照細胞的犬IFN-β1基因的編碼序列進行比對分析。DNA測序及比對結(jié)果如圖5所示，可見備選克隆中的IFN-β1基因編碼序列在2個靶向切割位點處出現(xiàn)了大片段的缺失或者大片段的隨機插入，說明對MDCK細胞進行IFN-β1基因序列的編輯改造是有效的。

2.5 IFN-β1編碼序列敲除陽性細胞克隆的生長能力比較

對備選陽性細胞克隆進行了生長能力比較，結(jié)果（表1）顯示，經(jīng)過CRISPR/Cas9系統(tǒng)操作之后的細胞克隆，生長能力有所差異，表現(xiàn)為生長速率減慢，最大細胞密度降低等。細胞克隆1、克隆3、克隆10、克隆14、克隆16的細胞生長速率相對較快，以這5株細胞克隆進行禽流感病毒的增殖比較試驗。

2.6 IFN-β1編碼序列敲除陽性細胞克隆的病毒增殖能力比較

對細胞克隆1、克隆3、克隆10、克隆14、克隆16以及MDCK原始細胞的病毒增殖能力進行比較，結(jié)果（表2）表明，細胞克隆1表現(xiàn)出最好的病毒增殖效果，H9亞型禽流感病毒JS02株在該細胞克隆中獲得連續(xù)增殖的能力，HA效價逐步升高并維持在最高的水平。

3 結(jié)論與討論

先天免疫反應(yīng)是抵御病毒感染的第一道防線。宿主細胞內(nèi)的模式識別受體（PRR）感知病原體相關(guān)的分子模式，在觸發(fā)一系列信號級聯(lián)反應(yīng)后，宿主的防御機制被激活[19]。在病毒感染后，引起干擾素（IFN）的產(chǎn)生和分泌，這對先天免疫是至關(guān)重要的并且對適應(yīng)性免疫也具有深遠影響。干擾素信號傳導(dǎo)會誘導(dǎo)IFN刺激基因（ISG）的轉(zhuǎn)錄，其進一步加強機體對病毒感染的免疫應(yīng)答[20]。Ⅰ型干擾素的主要有抗病毒、抗寄生蟲、抗菌、抗腫瘤等功能，其中抗病毒是IFN-Ⅰ最重要的功能之一。IFN-β的表達增加并且延長了ISG的表達，IFN-β再作用于鄰近細胞，并通過正反饋機制增強Ⅰ型IFN的誘導(dǎo)表達[21]。對基于體外培養(yǎng)細胞作為增毒基質(zhì)的系統(tǒng)而言，獲得IFN-β基因敲除的細胞克隆，進而對培養(yǎng)群體產(chǎn)生均質(zhì)化，提高禽流感病毒的增殖能力和連續(xù)傳代效果，為解決當前禽流感細胞疫苗的生產(chǎn)瓶頸問題提供了一條新思路。

CRISPR/Cas系統(tǒng)是一種適應(yīng)性免疫系統(tǒng)，可保護細菌和古細菌免受噬菌體和質(zhì)粒的入侵[15]，是由sgRNA引導(dǎo)的CRISPR/Cas核酸酶系統(tǒng)，CRISPR/Cas9針對含有三核苷酸原間隔序列（PAM）并與sgRNA互補的基因組序列進行基因切割，從而實現(xiàn)基因編輯。在Cas9對靶位點進行切割后，產(chǎn)生的雙鏈斷裂（DSBs）可通過非同源末端連接（NHEJ）或同源重組定向修復(fù)（HDR）進行修復(fù)[22]。與ZFN7[23]和TALENs[23-24]技術(shù)相比，CRISPR/Cas9敲除位點的設(shè)計更容易、特異性高、高效且非常適合高通量和多重化的系統(tǒng);與RNAi相比，CRISPR/Cas敲除等位基因通常會導(dǎo)致更明顯的表型、更高的信噪比和更低的假陽性[25]。CRISPR/Cas9系統(tǒng)的簡便性、方便性和有效性使其被運用在包括基因組編輯、基因功能調(diào)查以及在動物細胞和人體細胞的基因治療等多個方面[26]。在原核生物CRISPR-Cas適應(yīng)性免疫系統(tǒng)中通過設(shè)計gRNA序列幾乎可以編輯任何類型細胞中的任一基因，從而實現(xiàn)敲除突變。

本試驗利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)成功構(gòu)建敲除了IFN-β1編碼序列的MDCK單細胞克隆。該克隆生長旺盛、病毒增殖能力維持較高水平，為禽流感病毒抗原的規(guī)模增殖及相關(guān)機理研究奠定了試驗基礎(chǔ)。根據(jù)CRISPR/Cas9系統(tǒng)進行基因編輯的優(yōu)勢，我們接下來將利用成功構(gòu)建的CRISPR/Cas9系統(tǒng)進行更多細胞基因上的改造。通過將CRISPR/Cas9技術(shù)與單細胞分析技術(shù)的進步相結(jié)合，在研究病毒感染細胞后的先天性免疫反應(yīng)，分析細胞免疫應(yīng)答時病毒與細胞關(guān)鍵免疫基因之間的相互依賴性，期望能對病毒與其宿主之間的關(guān)系提供新的見解。

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