任善茂 王溫慧 陶勇

（江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院，泰州 225300）

血凝素樣氧化低密度脂蛋白受體1（Lectin-like oxidized low-density lipoprotein-receptor-l，OLR1） 是一種C 型血凝素家族的氧化型低密度脂蛋白受體，屬于Ⅱ型單鏈跨膜糖蛋白，主要在胎盤、肺、骨髓等組織豐富表達(dá)，在心臟、骨骼肌、卵巢等組織中也有少量表達(dá)［1-2］。目前，相關(guān)研究報(bào)道主要集中在OLR1基因多態(tài)性與人類心血管疾病和奶牛產(chǎn)奶性狀等方面［3-7］。劉旭等［3］采用PCR-LDR 法檢測(cè)了動(dòng)脈粥樣硬化性腦梗死患者群體OLR1基因3′端G501C 位點(diǎn)多態(tài)性，發(fā)現(xiàn)病例組CC+GC 基因型、GC 基因型頻率顯著地高于對(duì)照組，從而推測(cè)該多態(tài)位點(diǎn)可能與動(dòng)脈粥樣硬化性腦梗死相關(guān)。Wang 等［5］首次探討了OLR1基因SNPs 對(duì)非白種人遲發(fā)性阿爾茨海默病的影響，在中國(guó)漢族人群并沒有兩者之間存在任何顯著性差異。Khatib 等［7］通過基因組測(cè)序技術(shù)在奶牛試驗(yàn)群體中發(fā)現(xiàn)了8 個(gè)OLR1基因SNPs，其中3′-UTR 區(qū)域8 232 bp 處SNP 對(duì)脂肪產(chǎn)量和乳脂率有顯著影響，AA 基因型個(gè)體的OLR1 表 達(dá)降低。

蘇姜豬是一個(gè)通過國(guó)家畜禽遺傳資源委員會(huì)審定的國(guó)家級(jí)新品種豬，培育過程中采用了現(xiàn)代分子遺傳育種技術(shù)，其親本為地方品種姜曲海豬、國(guó)外引進(jìn)品種杜洛克豬［8］。目前，關(guān)于蘇姜豬的研究主要集中在生產(chǎn)性能、屠宰測(cè)定、基因表達(dá)等方面［9-11］，而有關(guān)候選基因多態(tài)性與生產(chǎn)性能、肉質(zhì)性狀等指標(biāo)相關(guān)的研究報(bào)道較少［12-13］。為了尋找與蘇姜豬肉質(zhì)性狀相關(guān)的遺傳標(biāo)記，本試驗(yàn)采用PCR-RFLP 技術(shù)檢測(cè)OLR1 基因PstⅠ酶切片斷多態(tài)性，統(tǒng)計(jì)該多態(tài)位點(diǎn)的群體遺傳參數(shù)，分析基因型與肉品指標(biāo)間的相關(guān)關(guān)系，以期為分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)在蘇姜豬持續(xù)選育中的應(yīng)用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

江蘇蘇姜種豬有限公司提供日齡相近、體重?zé)o顯著差異的育肥期蘇姜豬800 頭，公母各半，飼糧營(yíng)養(yǎng)水平和飼養(yǎng)管理方式一致。無菌采集所有試驗(yàn)用蘇姜豬耳組織樣后按照KAPA 試劑盒說明書提取組織DNA，采用Scan Drop 100 超微量核酸蛋白測(cè)定儀檢測(cè)DNA 濃度和純度，稀釋后-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 肉質(zhì)性狀測(cè)定 試驗(yàn)豬體重達(dá)到100±5 kg時(shí)，每種基因型選取8 頭進(jìn)行屠宰，從左半側(cè)胴體倒數(shù)第3-4 胸椎向后采集背最長(zhǎng)肌20-30 cm，按照“NY/T 821-2004 豬肌肉品質(zhì)測(cè)定技術(shù)規(guī)范”測(cè)定pH24、失水率、大理石紋、肉色等肉質(zhì)指標(biāo)。其中肉色采用5 分制比色板評(píng)分法和WSC-S 色差儀法兩種方法測(cè)定，色差儀測(cè)定亮度（L*）、紅值（a*）和黃值（b*）。

1.2.2 PCR 擴(kuò)增 根據(jù)郭咪咪等［14］研究成果，由上海生工有限公司合成一對(duì)引物，擴(kuò)增OLR1基因第5 內(nèi)含子內(nèi)583 bp 片段。引物序列分別為：上游5′-CGGTG GAAGA GCATT TGT-3′；下 游5′-ACCTT GGGTC AGGCA CTT-3′。PCR 擴(kuò)增反應(yīng)體系包括：DNA 模板2.5 μL，2×Taq PCR Mix 12.5 μL，上下游引物（10 μmol/L）各1.0 μL，加dd H2O 至總體積25.0 μL。PCR 反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性6 min；94℃變性40 s，53℃退火40 s，72℃延伸50 s，總計(jì)35 個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min，4℃保存。PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察擴(kuò)增效果。

1.2.3 PCR-RFLP-PstⅠ酶切分析 符合要求的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用PstⅠ內(nèi)切酶（賽默飛世爾科技有限公司，中國(guó)）進(jìn)行酶切，酶切反應(yīng)體系包括1×Buffer 1.5 μL，限制性內(nèi)切酶0.2 μL（5 U），PCR 產(chǎn)物5 μL，加dd H2O 至15 μL。37℃酶切反應(yīng)3 h。用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)經(jīng)過限制性內(nèi)切酶PstⅠ酶切的產(chǎn)物，并在凝膠成像系統(tǒng)下判斷基因型。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)分析

1.2.4.1 分析OLR1基因多態(tài)位點(diǎn)的群體遺傳參數(shù) 參照劉海霞等［15］研究結(jié)果計(jì)算蘇姜豬試驗(yàn)群體純合度（H0）、雜合度（He）、有效等位基因數(shù)（Ne）、多態(tài)信息含量（PIC）等OLR1 基因多態(tài)位點(diǎn)的群體遺傳參數(shù)。

純合度計(jì)算公式：

式中H0為基因位點(diǎn)的純合度，Pi為第i 個(gè)等位基因的頻率，n 為某個(gè)位點(diǎn)的等位基因數(shù)。雜合度計(jì)算公式：

有效等位基因數(shù)計(jì)算公式：

多態(tài)信息含量計(jì)算公式：

式中n 為等位基因數(shù)目，Pi和Pj分別為第i 和第j個(gè)等位基因在群體中的頻率。

1.2.4.2OLR1基因型與肉質(zhì)性狀間的關(guān)聯(lián)分析 采用SPSS 16.0 統(tǒng)計(jì)軟件中GLM 過程進(jìn)行最小二乘方差分析，比較蘇姜豬試驗(yàn)群體中OLR1基因型對(duì)肉質(zhì)性狀的影響。由于試驗(yàn)群體來自于相同豬場(chǎng)、相同品種，屠宰日齡與體重相近，所以去掉場(chǎng)效應(yīng)、年齡效應(yīng)和品種效應(yīng)，采用簡(jiǎn)化模型Y=μ+Dl+Rm+elm，式中Y為肉質(zhì)指標(biāo)實(shí)際測(cè)量值，Dl為性別效應(yīng)，Rm為基因型效應(yīng)，elm為隨機(jī)殘差效應(yīng)。

2 結(jié)果

2.1 蘇姜豬OLR1基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物

蘇姜豬試驗(yàn)群體OLR1基因第5 內(nèi)含子目標(biāo)片段的PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物電泳檢測(cè)結(jié)果見圖1。圖1 顯示本次試驗(yàn)中OLR1基因PCR 產(chǎn)物的特異性好，擴(kuò)增片段的大小與目標(biāo)片段一致（583 bp），可以直接用來做后續(xù)的RFLP 分析。

圖1 蘇姜豬OLR1 基因PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物

2.2 蘇姜豬OLR1基因PCR-RFLP檢測(cè)分型

蘇姜豬試驗(yàn)群體OLR1基因目標(biāo)片斷PCRRFLP-PstⅠ酶切分析電泳檢測(cè)結(jié)果見圖2。從圖2可見，OLR1基因PCR 產(chǎn)物在蘇姜豬試驗(yàn)群體中檢測(cè)到了PstⅠ酶切多態(tài)性，存在CC、CD 和DD 3 種基因型。

圖2 蘇姜豬OLR1 基因PCR-RFLP-Pst Ⅰ分析結(jié)果

2.3 蘇姜豬OLR1基因遺傳多態(tài)性分析

2.3.1 等位基因和基因型頻率OLR1基因PCRRFLP-PstⅠ酶切多態(tài)位點(diǎn)等位基因和基因型頻率的統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表1。由表1 可知，OLR1基因PCRRFLP-PstⅠ多態(tài)位點(diǎn)統(tǒng)計(jì)在蘇姜豬試驗(yàn)群體中的優(yōu)勢(shì)基因型為CC，C 為優(yōu)勢(shì)等位基因。

表1 蘇姜豬OLR1 基因基因型頻率和基因頻率

2.3.2 群體遺傳純合度、雜合度等遺傳參數(shù)分析 蘇姜豬試驗(yàn)群體H0、He、Ne及PIC等群體遺傳參數(shù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表2。由表2 可知，蘇姜豬試驗(yàn)群體純合度較高，達(dá)到了0.67，多態(tài)信息含量為0.27，呈現(xiàn)中度多態(tài)。

表2 蘇姜豬OLR1 基因多態(tài)位點(diǎn)的群體遺傳參數(shù)

2.4 蘇姜豬OLR1基因型與肉質(zhì)性狀的關(guān)聯(lián)分析

蘇姜豬OLR1基因PCR-RFLP-PstⅠ酶切多態(tài)位點(diǎn)基因型與個(gè)體間肉質(zhì)性狀的關(guān)聯(lián)分析結(jié)果見表3。由表3 可知，CC 型個(gè)體肌肉失水率、大理石紋均顯著高于DD 型（P＜0.05），CD 和DD 型個(gè)體用色差儀測(cè)得的黃值b*存在著顯著差異（P＜0.05），其余指標(biāo)間的差異均不顯著（P＞0.05）。

3 討論

日本學(xué)者Swamura 最早在1997 年在牛主動(dòng)脈內(nèi)發(fā)現(xiàn)了氧化低密度脂蛋白受體-1（OLRl），主要存在于血管等內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)，能特異性的結(jié)合、吞隨、降解氧化低密度脂蛋白［16］。OLRl基因在脾、腎、肺、肝等血管比較豐富的器官中高度表達(dá)，而在心臟、卵巢中等器官中的表達(dá)量很少［17］。目前對(duì)ORL1基因的研究主要集中在人、牛等方面，在豬中研究報(bào)道較少［18-21］。Chui 等［18］研究發(fā)現(xiàn)人體血液中膽固醇含量隨著ORL1 表達(dá)量的增加而提高，攝取的游離脂肪酸和脂滴中甘油三酯也隨之升高，這些研究結(jié)果表明OLR1基因與甘油三酯儲(chǔ)存及肥胖產(chǎn)生的關(guān)聯(lián)程度較高。李托等［19］在秦川牛群體中研究發(fā)現(xiàn)OLR1基因存在能夠被PstI限制性酶識(shí)別的g.10497C＞A 突變，存在AA、AC 和CC 三種基因型，CC 基因型秦川牛個(gè)體的眼肌面積和眼肌深度均顯著地高于其他兩種基因型個(gè)體。劉春偉等［20］克隆測(cè)序后分析得到豬OLR1基因編碼區(qū)全長(zhǎng)為825 bp（GenBank 序列號(hào)EU122440），編碼273 個(gè)氨基酸，豬OLR1基因與牛同源性高達(dá)84%，其次與人、大鼠、小鼠的同源性分別是79%、51%和27%。郭咪咪等［14］通過RT-PCR 分析發(fā)現(xiàn)豬OLR1基因在不同組織間的表達(dá)差異很大（心臟內(nèi)表達(dá)量最高），在背脂中表達(dá)呈現(xiàn)出明顯的品種差異。

表3 蘇姜豬OLR1 基因不同基因型與肉質(zhì)性狀間的關(guān)聯(lián)分析

本研究在蘇姜豬試驗(yàn)群體中發(fā)現(xiàn)OLR1基因PstⅠ酶切位點(diǎn)多態(tài)性，測(cè)得C、D 兩個(gè)等位基因，CC、CD、DD 三種基因型。根據(jù)郭咪咪等［21］研究結(jié)果，該多態(tài)位點(diǎn)為位于OLR1基因第5 內(nèi)含子內(nèi)的 C52T 突變，因此該多態(tài)位點(diǎn)并不會(huì)導(dǎo)致所編輯的氨基酸突變，但是否會(huì)影響OLR1基因的表達(dá)還有待深入研究。該多態(tài)位點(diǎn)在蘇姜豬試驗(yàn)群體的多態(tài)信息含量（PIC）為0.27，呈現(xiàn)出中度多態(tài)，由此可見蘇姜豬群體具備進(jìn)一步選育的潛力。郭咪咪等［21］在長(zhǎng)白豬、大白豬、梅山豬等中外試驗(yàn)豬群體中均未檢測(cè)到酶切基因型的純合個(gè)體，不同基因型在大白×梅山F2 代雜交商品豬的肉色指標(biāo)間也不存在顯著或極顯著的差異。但在本研究中卻發(fā)現(xiàn)OLR1 基因不同基因型個(gè)體在失水率、大理石紋、色差儀測(cè)得的肉色黃值b*指標(biāo)間均存在顯著差異。這些研究結(jié)論的差異可能與蘇姜豬的遺傳背景有關(guān)。蘇姜豬是以姜曲海豬、楓涇豬、杜洛克豬為親本培育而成的新品種豬，分別含有姜曲海豬血統(tǒng)18.75%、楓涇豬血統(tǒng)18.75%和杜洛克豬血統(tǒng)62.5%［22］，因此杜洛克豬是否是導(dǎo)致蘇姜豬OLR1 基因酶切基因型純合個(gè)體出現(xiàn)的原因還有待驗(yàn)證。中國(guó)地方豬種肉質(zhì)優(yōu)良，大理石紋豐富，肌內(nèi)脂肪含量高達(dá)3%以上，有的甚至達(dá)到6%-7%［23］，蘇姜豬也具有我國(guó)地方豬種姜曲海豬肉質(zhì)優(yōu)良的特性［24］。因此，從本研究中OLR1 基因與肉質(zhì)性狀關(guān)聯(lián)性分析得出，目前可以通過提高蘇姜豬群體中CC 基因型個(gè)體的頻率來增加肌肉大理石紋含量，從而達(dá)到改善肉質(zhì)的目的，這也為蘇姜豬肉質(zhì)性狀的分子輔助選育提供了參考 依據(jù)。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)在蘇姜豬試驗(yàn)群體OLR1基因第5 內(nèi)含子內(nèi)檢測(cè)到一個(gè)PCR-RFLP-PstⅠ多態(tài)位點(diǎn)，存在C、D 兩個(gè)等位基因，CC、CD、DD 三種基因型，其中C 為優(yōu)勢(shì)等位基因，CC 為優(yōu)勢(shì)基因型。關(guān)聯(lián)分析表明，該多態(tài)位點(diǎn)不同基因型與失水率、大理石紋、肉色等肉質(zhì)指標(biāo)間差異顯著。因此，本試驗(yàn)檢測(cè)到的PCR-RFLP-PstⅠ多態(tài)位點(diǎn)可作為肉質(zhì)性狀候選基因在蘇姜豬的持續(xù)選育中加以應(yīng)用。