任善茂 王溫慧 陶勇

（江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院，泰州 225300）

血凝素樣氧化低密度脂蛋白受體1（Lectin-like oxidized low-density lipoprotein-receptor-l，OLR1） 是一種C 型血凝素家族的氧化型低密度脂蛋白受體，屬于Ⅱ型單鏈跨膜糖蛋白，主要在胎盤、肺、骨髓等組織豐富表達(dá)，在心臟、骨骼肌、卵巢等組織中也有少量表達(dá)［1-2］。目前，相關(guān)研究報道主要集中在OLR1基因多態(tài)性與人類心血管疾病和奶牛產(chǎn)奶性狀等方面［3-7］。劉旭等［3］采用PCR-LDR 法檢測了動脈粥樣硬化性腦梗死患者群體OLR1基因3′端G501C 位點多態(tài)性，發(fā)現(xiàn)病例組CC+GC 基因型、GC 基因型頻率顯著地高于對照組，從而推測該多態(tài)位點可能與動脈粥樣硬化性腦梗死相關(guān)。Wang 等［5］首次探討了OLR1基因SNPs 對非白種人遲發(fā)性阿爾茨海默病的影響，在中國漢族人群并沒有兩者之間存在任何顯著性差異。Khatib 等［7］通過基因組測序技術(shù)在奶牛試驗群體中發(fā)現(xiàn)了8 個OLR1基因SNPs，其中3′-UTR 區(qū)域8 232 bp 處SNP 對脂肪產(chǎn)量和乳脂率有顯著影響，AA 基因型個體的OLR1 表 達(dá)降低。

蘇姜豬是一個通過國家畜禽遺傳資源委員會審定的國家級新品種豬，培育過程中采用了現(xiàn)代分子遺傳育種技術(shù)，其親本為地方品種姜曲海豬、國外引進(jìn)品種杜洛克豬［8］。目前，關(guān)于蘇姜豬的研究主要集中在生產(chǎn)性能、屠宰測定、基因表達(dá)等方面［9-11］，而有關(guān)候選基因多態(tài)性與生產(chǎn)性能、肉質(zhì)性狀等指標(biāo)相關(guān)的研究報道較少［12-13］。為了尋找與蘇姜豬肉質(zhì)性狀相關(guān)的遺傳標(biāo)記，本試驗采用PCR-RFLP 技術(shù)檢測OLR1 基因PstⅠ酶切片斷多態(tài)性，統(tǒng)計該多態(tài)位點的群體遺傳參數(shù)，分析基因型與肉品指標(biāo)間的相關(guān)關(guān)系，以期為分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)在蘇姜豬持續(xù)選育中的應(yīng)用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

江蘇蘇姜種豬有限公司提供日齡相近、體重?zé)o顯著差異的育肥期蘇姜豬800 頭，公母各半，飼糧營養(yǎng)水平和飼養(yǎng)管理方式一致。無菌采集所有試驗用蘇姜豬耳組織樣后按照KAPA 試劑盒說明書提取組織DNA，采用Scan Drop 100 超微量核酸蛋白測定儀檢測DNA 濃度和純度，稀釋后-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 肉質(zhì)性狀測定 試驗豬體重達(dá)到100±5 kg時，每種基因型選取8 頭進(jìn)行屠宰，從左半側(cè)胴體倒數(shù)第3-4 胸椎向后采集背最長肌20-30 cm，按照“NY/T 821-2004 豬肌肉品質(zhì)測定技術(shù)規(guī)范”測定pH24、失水率、大理石紋、肉色等肉質(zhì)指標(biāo)。其中肉色采用5 分制比色板評分法和WSC-S 色差儀法兩種方法測定，色差儀測定亮度（L*）、紅值（a*）和黃值（b*）。

1.2.2 PCR 擴(kuò)增 根據(jù)郭咪咪等［14］研究成果，由上海生工有限公司合成一對引物，擴(kuò)增OLR1基因第5 內(nèi)含子內(nèi)583 bp 片段。引物序列分別為：上游5′-CGGTG GAAGA GCATT TGT-3′；下 游5′-ACCTT GGGTC AGGCA CTT-3′。PCR 擴(kuò)增反應(yīng)體系包括：DNA 模板2.5 μL，2×Taq PCR Mix 12.5 μL，上下游引物（10 μmol/L）各1.0 μL，加dd H2O 至總體積25.0 μL。PCR 反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性6 min；94℃變性40 s，53℃退火40 s，72℃延伸50 s，總計35 個循環(huán)；72℃延伸10 min，4℃保存。PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察擴(kuò)增效果。

1.2.3 PCR-RFLP-PstⅠ酶切分析 符合要求的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用PstⅠ內(nèi)切酶（賽默飛世爾科技有限公司，中國）進(jìn)行酶切，酶切反應(yīng)體系包括1×Buffer 1.5 μL，限制性內(nèi)切酶0.2 μL（5 U），PCR 產(chǎn)物5 μL，加dd H2O 至15 μL。37℃酶切反應(yīng)3 h。用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測經(jīng)過限制性內(nèi)切酶PstⅠ酶切的產(chǎn)物，并在凝膠成像系統(tǒng)下判斷基因型。

1.2.4 統(tǒng)計分析

1.2.4.1 分析OLR1基因多態(tài)位點的群體遺傳參數(shù) 參照劉海霞等［15］研究結(jié)果計算蘇姜豬試驗群體純合度（H0）、雜合度（He）、有效等位基因數(shù)（Ne）、多態(tài)信息含量（PIC）等OLR1 基因多態(tài)位點的群體遺傳參數(shù)。

純合度計算公式：

式中H0為基因位點的純合度，Pi為第i 個等位基因的頻率，n 為某個位點的等位基因數(shù)。雜合度計算公式：

有效等位基因數(shù)計算公式：

多態(tài)信息含量計算公式：

式中n 為等位基因數(shù)目，Pi和Pj分別為第i 和第j個等位基因在群體中的頻率。

1.2.4.2OLR1基因型與肉質(zhì)性狀間的關(guān)聯(lián)分析 采用SPSS 16.0 統(tǒng)計軟件中GLM 過程進(jìn)行最小二乘方差分析，比較蘇姜豬試驗群體中OLR1基因型對肉質(zhì)性狀的影響。由于試驗群體來自于相同豬場、相同品種，屠宰日齡與體重相近，所以去掉場效應(yīng)、年齡效應(yīng)和品種效應(yīng)，采用簡化模型Y=μ+Dl+Rm+elm，式中Y為肉質(zhì)指標(biāo)實際測量值，Dl為性別效應(yīng)，Rm為基因型效應(yīng)，elm為隨機(jī)殘差效應(yīng)。

2 結(jié)果

2.1 蘇姜豬OLR1基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物

蘇姜豬試驗群體OLR1基因第5 內(nèi)含子目標(biāo)片段的PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物電泳檢測結(jié)果見圖1。圖1 顯示本次試驗中OLR1基因PCR 產(chǎn)物的特異性好，擴(kuò)增片段的大小與目標(biāo)片段一致（583 bp），可以直接用來做后續(xù)的RFLP 分析。

圖1 蘇姜豬OLR1 基因PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物

2.2 蘇姜豬OLR1基因PCR-RFLP檢測分型

蘇姜豬試驗群體OLR1基因目標(biāo)片斷PCRRFLP-PstⅠ酶切分析電泳檢測結(jié)果見圖2。從圖2可見，OLR1基因PCR 產(chǎn)物在蘇姜豬試驗群體中檢測到了PstⅠ酶切多態(tài)性，存在CC、CD 和DD 3 種基因型。

圖2 蘇姜豬OLR1 基因PCR-RFLP-Pst Ⅰ分析結(jié)果

2.3 蘇姜豬OLR1基因遺傳多態(tài)性分析

2.3.1 等位基因和基因型頻率OLR1基因PCRRFLP-PstⅠ酶切多態(tài)位點等位基因和基因型頻率的統(tǒng)計結(jié)果見表1。由表1 可知，OLR1基因PCRRFLP-PstⅠ多態(tài)位點統(tǒng)計在蘇姜豬試驗群體中的優(yōu)勢基因型為CC，C 為優(yōu)勢等位基因。

表1 蘇姜豬OLR1 基因基因型頻率和基因頻率

2.3.2 群體遺傳純合度、雜合度等遺傳參數(shù)分析 蘇姜豬試驗群體H0、He、Ne及PIC等群體遺傳參數(shù)統(tǒng)計結(jié)果見表2。由表2 可知，蘇姜豬試驗群體純合度較高，達(dá)到了0.67，多態(tài)信息含量為0.27，呈現(xiàn)中度多態(tài)。

表2 蘇姜豬OLR1 基因多態(tài)位點的群體遺傳參數(shù)

2.4 蘇姜豬OLR1基因型與肉質(zhì)性狀的關(guān)聯(lián)分析

蘇姜豬OLR1基因PCR-RFLP-PstⅠ酶切多態(tài)位點基因型與個體間肉質(zhì)性狀的關(guān)聯(lián)分析結(jié)果見表3。由表3 可知，CC 型個體肌肉失水率、大理石紋均顯著高于DD 型（P＜0.05），CD 和DD 型個體用色差儀測得的黃值b*存在著顯著差異（P＜0.05），其余指標(biāo)間的差異均不顯著（P＞0.05）。

3 討論

日本學(xué)者Swamura 最早在1997 年在牛主動脈內(nèi)發(fā)現(xiàn)了氧化低密度脂蛋白受體-1（OLRl），主要存在于血管等內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)，能特異性的結(jié)合、吞隨、降解氧化低密度脂蛋白［16］。OLRl基因在脾、腎、肺、肝等血管比較豐富的器官中高度表達(dá)，而在心臟、卵巢中等器官中的表達(dá)量很少［17］。目前對ORL1基因的研究主要集中在人、牛等方面，在豬中研究報道較少［18-21］。Chui 等［18］研究發(fā)現(xiàn)人體血液中膽固醇含量隨著ORL1 表達(dá)量的增加而提高，攝取的游離脂肪酸和脂滴中甘油三酯也隨之升高，這些研究結(jié)果表明OLR1基因與甘油三酯儲存及肥胖產(chǎn)生的關(guān)聯(lián)程度較高。李托等［19］在秦川牛群體中研究發(fā)現(xiàn)OLR1基因存在能夠被PstI限制性酶識別的g.10497C＞A 突變，存在AA、AC 和CC 三種基因型，CC 基因型秦川牛個體的眼肌面積和眼肌深度均顯著地高于其他兩種基因型個體。劉春偉等［20］克隆測序后分析得到豬OLR1基因編碼區(qū)全長為825 bp（GenBank 序列號EU122440），編碼273 個氨基酸，豬OLR1基因與牛同源性高達(dá)84%，其次與人、大鼠、小鼠的同源性分別是79%、51%和27%。郭咪咪等［14］通過RT-PCR 分析發(fā)現(xiàn)豬OLR1基因在不同組織間的表達(dá)差異很大（心臟內(nèi)表達(dá)量最高），在背脂中表達(dá)呈現(xiàn)出明顯的品種差異。

表3 蘇姜豬OLR1 基因不同基因型與肉質(zhì)性狀間的關(guān)聯(lián)分析

本研究在蘇姜豬試驗群體中發(fā)現(xiàn)OLR1基因PstⅠ酶切位點多態(tài)性，測得C、D 兩個等位基因，CC、CD、DD 三種基因型。根據(jù)郭咪咪等［21］研究結(jié)果，該多態(tài)位點為位于OLR1基因第5 內(nèi)含子內(nèi)的 C52T 突變，因此該多態(tài)位點并不會導(dǎo)致所編輯的氨基酸突變，但是否會影響OLR1基因的表達(dá)還有待深入研究。該多態(tài)位點在蘇姜豬試驗群體的多態(tài)信息含量（PIC）為0.27，呈現(xiàn)出中度多態(tài)，由此可見蘇姜豬群體具備進(jìn)一步選育的潛力。郭咪咪等［21］在長白豬、大白豬、梅山豬等中外試驗豬群體中均未檢測到酶切基因型的純合個體，不同基因型在大白×梅山F2 代雜交商品豬的肉色指標(biāo)間也不存在顯著或極顯著的差異。但在本研究中卻發(fā)現(xiàn)OLR1 基因不同基因型個體在失水率、大理石紋、色差儀測得的肉色黃值b*指標(biāo)間均存在顯著差異。這些研究結(jié)論的差異可能與蘇姜豬的遺傳背景有關(guān)。蘇姜豬是以姜曲海豬、楓涇豬、杜洛克豬為親本培育而成的新品種豬，分別含有姜曲海豬血統(tǒng)18.75%、楓涇豬血統(tǒng)18.75%和杜洛克豬血統(tǒng)62.5%［22］，因此杜洛克豬是否是導(dǎo)致蘇姜豬OLR1 基因酶切基因型純合個體出現(xiàn)的原因還有待驗證。中國地方豬種肉質(zhì)優(yōu)良，大理石紋豐富，肌內(nèi)脂肪含量高達(dá)3%以上，有的甚至達(dá)到6%-7%［23］，蘇姜豬也具有我國地方豬種姜曲海豬肉質(zhì)優(yōu)良的特性［24］。因此，從本研究中OLR1 基因與肉質(zhì)性狀關(guān)聯(lián)性分析得出，目前可以通過提高蘇姜豬群體中CC 基因型個體的頻率來增加肌肉大理石紋含量，從而達(dá)到改善肉質(zhì)的目的，這也為蘇姜豬肉質(zhì)性狀的分子輔助選育提供了參考 依據(jù)。

4 結(jié)論

本試驗在蘇姜豬試驗群體OLR1基因第5 內(nèi)含子內(nèi)檢測到一個PCR-RFLP-PstⅠ多態(tài)位點，存在C、D 兩個等位基因，CC、CD、DD 三種基因型，其中C 為優(yōu)勢等位基因，CC 為優(yōu)勢基因型。關(guān)聯(lián)分析表明，該多態(tài)位點不同基因型與失水率、大理石紋、肉色等肉質(zhì)指標(biāo)間差異顯著。因此，本試驗檢測到的PCR-RFLP-PstⅠ多態(tài)位點可作為肉質(zhì)性狀候選基因在蘇姜豬的持續(xù)選育中加以應(yīng)用。