溫洪濤 李夏瑩 楊洋 陳子言 丁一佳 張秀杰 張瑞英

（1. 黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全研究所，哈爾濱 150086；2. 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部科技發(fā)展中心，北京 100176）

2018 年全球轉(zhuǎn)基因作物種植面積已達(dá)1.917 億hm2，其中玉米面積僅次于大豆，占5 890 萬hm2［1］。據(jù)國(guó)際農(nóng)業(yè)生物技術(shù)應(yīng)用服務(wù)組織（ISAAA）統(tǒng)計(jì)，目前全球已商業(yè)化的31 種轉(zhuǎn)基因作物的轉(zhuǎn)化體數(shù)量已達(dá)到517 種，其中玉米轉(zhuǎn)化體237 種［2］，超過1/3，其種類最多也最復(fù)雜。不斷涌現(xiàn)的新型轉(zhuǎn)基因玉米品系給監(jiān)管工作帶來了巨大挑戰(zhàn)。

在轉(zhuǎn)基因作物商業(yè)化的二十幾年間，雖然針對(duì)轉(zhuǎn)基因成分的篩查已經(jīng)開發(fā)出如酶聯(lián)免疫吸附（Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（Loop-mediated isothermal amplification，LAMP）、核酸序列依賴性擴(kuò)增（Nuleic and sequerce based amplipicain，NASBA）、重組酶聚合酶擴(kuò)增（Recombinase polymerase amplification，RPA） 等 大量的新型檢測(cè)技術(shù)，但從成本、適用性、準(zhǔn)確性與通量等多方面綜合考慮，目前世界范圍內(nèi)主流的轉(zhuǎn)基因檢測(cè)手段依然是傳統(tǒng)的、以核酸為目標(biāo)的PCR方法［3-6］。

面對(duì)復(fù)雜的玉米轉(zhuǎn)化事件，近年來一些研究機(jī)構(gòu)有針對(duì)性的研發(fā)出基于PCR 方法的篩查策略。張海波等［7-8］分別使用定性和定量PCR 方法建立了以P-CaMV35S 和T-NOS 序列為目標(biāo)的轉(zhuǎn)基因玉米定性檢測(cè)方法，吳明生等［9］研發(fā)了以P-CaMV35S、T-NOS和Bar 基因?yàn)槟繕?biāo)的轉(zhuǎn)基因玉米三重實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法；Frederic 等［10］測(cè)試了6 種啟動(dòng)子和4 終止子在不同轉(zhuǎn)基因作物中的特異性，包含7 種不同的玉米轉(zhuǎn)化體。

當(dāng)前，絕大多數(shù)篩查策略均以P-CaMV35S 和T-NOS 為主要目標(biāo)序列，這是由于它們是目前轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品中使用率和覆蓋度最高的兩種元件［11］，然而為了提高啟動(dòng)子的效率，P-CaMV35S 一直在不斷被改造，許多研究人員詳細(xì)比對(duì)過不同類型的P-CaMV35S，并對(duì)已有的特異性引物進(jìn)行了驗(yàn)證，這些研究結(jié)果顯示大量轉(zhuǎn)化事件中所用的P-CaMV35S 序列都不完全一致的，這種差異造成相同的引物在不同轉(zhuǎn)化事件中檢測(cè)效率有很大不同，有時(shí)會(huì)嚴(yán)重影響對(duì)檢測(cè)結(jié)果的判定［12-14］。所有常見的轉(zhuǎn)基因元件和功能基因在不同轉(zhuǎn)化事件中都存在這種序列差異問題，因此為了使檢測(cè)結(jié)果更加真實(shí)可靠，有必要在進(jìn)行篩查策略研發(fā)的時(shí)候?qū)D(zhuǎn)基因材料進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室驗(yàn)證工作，而不僅僅是對(duì)數(shù)據(jù)的分析整理。本研究基于此目的，利用常見的9 種目標(biāo)元件或基因?qū)?2 種玉米轉(zhuǎn)化事件進(jìn)行了實(shí)時(shí)熒光PCR 方法的驗(yàn)證，同時(shí)還開發(fā)出了可配套使用的陽(yáng)性質(zhì)粒分子。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料與試劑 本研究共使用了32 種轉(zhuǎn)基因玉米材料，具體信息見表1。

快速質(zhì)粒小提試劑盒 康為世紀(jì)；DNeasy Plant Mini Kit 植物DNA 提取試劑盒 Qiagen 公司；內(nèi)切酶 NEB 公司；質(zhì)粒合成 通用公司；iTaq Universal Probes Supermix 實(shí) 時(shí) 熒 光PCR 試 劑 盒 及PCR 板 Bio-Rad 公司；QuantStudioTM3D Digital PCR 20K Chip Kit v2 數(shù)字PCR 芯片套裝、QuantStudioTM3D Digital PCR Master Mix v2 數(shù)字PCR 酶試劑盒 Thermo Fisher Scientific 公司。Easy Dilution TAKARA 公司。

表1 轉(zhuǎn)基因材料來源

1.1.2 儀器與設(shè)備 Nanodrop ND-2000 核酸定量?jī)x、QuantStudio 7 實(shí) 時(shí) 熒 光PCR 儀、ProFlex PCR 儀、QuantStudioTM3D 數(shù)字PCR 儀 Thermo Fisher Scientific公司；VX-200 旋渦混勻儀 Labnet 公司；5424R 臺(tái)式離心機(jī) Eppendorf 公司；H2O3-PRO 金屬浴 北京卡尤迪公司。

1.2 方法

1.2.1 DNA 提取 轉(zhuǎn)基因材料的基因組DNA 提取方法參照試劑盒說明書。

1.2.2 元件/基因的確定 查詢ISAAA、轉(zhuǎn)基因檢測(cè) 數(shù) 據(jù) 庫(kù)（GMDD，http：//gmdd.sjtu.edu.cn/）、 改性活性生物體登記數(shù)據(jù)庫(kù)（LMO，http：//bch.cbd.int/database/organisms/）等網(wǎng)站提供的信息，對(duì)已經(jīng)商業(yè)化及可能商業(yè)化的玉米轉(zhuǎn)化體進(jìn)行分子特征的分析研究，比對(duì)各種元件和基因出現(xiàn)的頻率。

1.2.3 引物及探針 實(shí)時(shí)熒光PCR 方法和普通PCR相比其特異性更高，反應(yīng)后不需要電泳檢測(cè)，能有效的避免出現(xiàn)污染，加之可以使用384 通道，使其通量和效率得到極大提升，隨著試劑耗材成本的下降，未來必將逐漸取代普通PCR 成為主流檢測(cè)手段，因此本研究方案中全部使用實(shí)時(shí)熒光PCR 方法。結(jié)合日常檢測(cè)中的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，最終選出了同一種元件/基因中覆蓋范圍更廣、適用性更高的引物探針組合。本研究中所涉及的引物和探針均由Thermo Fisher Scientific 公司合成，具體序列及所使用的熒光標(biāo)記見表2，所有探針5′端用6-羧基熒光素（FAM）標(biāo)記，3′端用黑洞猝滅基團(tuán)（BHQ1）標(biāo)記。

1.2.4 實(shí)時(shí)熒光PCR 反應(yīng)體系和程序 總體系為15 μL，其中iTaq Universal Probes Supermix 7.5 μL、正向引物0.5 μmol/L、反向引物0.5 μmol/L、探針0.25 μmol/L、模板DNA 為每個(gè)反應(yīng)體系中50 ng，用雙蒸水將總體積補(bǔ)足至15 μL；反應(yīng)程序?yàn)?5℃預(yù)變性10 min；95℃變性15 s，60℃退火延伸60 s，共40 個(gè)循環(huán)；在第二階段的退火延伸（60℃）時(shí)段收集熒光信號(hào)。

表2 引物和探針信息

1.2.5 陽(yáng)性質(zhì)粒構(gòu)建 根據(jù)查詢數(shù)據(jù)庫(kù)獲得的P-CaMV35S、T-NOS、Bar基 因、Pat基 因、Cp4-epsps基因、NPTⅡ基因、cry1A基因、P-Rice actin、phy 結(jié)構(gòu)特異性片段連同玉米內(nèi)標(biāo)基因zSSIIb共10種目標(biāo)元件/基因的序列，經(jīng)過人工合成并克隆到質(zhì)粒載體pUC18 中。

1.2.6 陽(yáng)性質(zhì)粒測(cè)序及純度驗(yàn)證 將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)運(yùn)至大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，挑取單克隆測(cè)序驗(yàn)證后提取質(zhì)粒。用紫外分光光度法測(cè)定 純化后的質(zhì)粒在 A230、A260和A280處的吸光值。純凈dsDNA 的A260/A280應(yīng)為1.8-2.0，而A260/A230應(yīng)在2.0 左右。

1.2.7 陽(yáng)性質(zhì)粒數(shù)字PCR 拷貝數(shù)測(cè)試 將陽(yáng)性質(zhì)粒進(jìn)行梯度濃度稀釋，使用數(shù)字PCR 進(jìn)行拷貝數(shù)定量，數(shù)字PCR 反應(yīng)包括5 個(gè)步驟：體系配制、樣品加載及芯片密封、PCR 擴(kuò)增、芯片讀取及分析。反應(yīng)體系為：1×3D Digital PCR Master Mix v2，正反向引物終濃度均為0.50 μmol/L，探針終濃度0.27 μmol/L，模板DNA 2 μL，雙蒸水補(bǔ)足至14.5 μL。配置好的體系通過上樣儀自動(dòng)加載到芯片各微孔中，體系加載完成后使用Immersion Fluid 覆蓋芯片表面并將芯片密封，將芯片放置于平板PCR 儀上進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增程序：96℃，10 min 預(yù)變性；98℃變性30 s，60℃退火2 min，共40 個(gè)循環(huán)。

1.2.8 陽(yáng)性質(zhì)粒實(shí)時(shí)熒光PCR 可替代性測(cè)試 將數(shù)字PCR 驗(yàn)證過的質(zhì)粒進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR 可替代性測(cè)試，反應(yīng)程序和體系見1.2.4。

2 結(jié)果

2.1 篩查元件/基因的確定

經(jīng)過數(shù)據(jù)庫(kù)的查詢和比對(duì)，共發(fā)現(xiàn)237 種玉米轉(zhuǎn)化體，其中包含53 種獨(dú)立性狀轉(zhuǎn)化體和184 種復(fù)合性狀轉(zhuǎn)化體；同時(shí)，據(jù)統(tǒng)計(jì)我國(guó)處在申請(qǐng)安全證書和和生產(chǎn)性試驗(yàn)階段的轉(zhuǎn)基因玉米轉(zhuǎn)化體數(shù)量已達(dá)到48 種，國(guó)內(nèi)外總計(jì)有285 種轉(zhuǎn)化體。

通過對(duì)元件/基因使用率及國(guó)內(nèi)外檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)方法的研究，最終確定了9 個(gè)外源元件/基因的篩查策略，分別是：P-CaMV35S、T-NOS、Bar基因、Pat基因、Cp4-epsps基因、NPTⅡ基因、cry1A基因、P-Rice actin、phy 結(jié)構(gòu)特異性片段，按照數(shù)據(jù)庫(kù)提供的信息推測(cè)，使用這9 種元件/基因策略可以篩查出包括復(fù)合性狀在內(nèi)的261 種轉(zhuǎn)基因玉米，覆蓋了全部285 種玉米轉(zhuǎn)化體的91.6%。

2.2 實(shí)時(shí)熒光PCR方法對(duì)不同轉(zhuǎn)基因玉米材料的篩查測(cè)試

為驗(yàn)證9 種元件/基因篩選策略是否適合對(duì)玉米中的轉(zhuǎn)基因成分進(jìn)行篩查，利用表2 中所述引物探針對(duì)實(shí)驗(yàn)室前期收集到的32 種玉米轉(zhuǎn)化體進(jìn)行驗(yàn)證。首先提取32 種材料的DNA，根據(jù)其標(biāo)注含量進(jìn)行稀釋，使DNA 溶液中轉(zhuǎn)基因成分的相對(duì)含量全部達(dá)到1%，之后進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR 實(shí)驗(yàn)，測(cè)試結(jié)果見表3。

表3 中1-20 號(hào)玉米轉(zhuǎn)化體樣品已獲得我國(guó)發(fā)放的轉(zhuǎn)基因生物安全證書，從測(cè)試結(jié)果中可以看出，除DAS-40278-9 外其余19 種轉(zhuǎn)化體可以被9 種元件的篩查方法完全覆蓋；21-32 號(hào)樣品尚未獲得我國(guó)發(fā)放的生物安全證書，其中21-24 號(hào)為國(guó)外商業(yè)化轉(zhuǎn)化體，25-32 號(hào)為國(guó)內(nèi)研發(fā)、處于申請(qǐng)證書或生產(chǎn)性試驗(yàn)階段的轉(zhuǎn)化體，其中VCO-01981-5 無法被本篩查方法覆蓋。

2.3 篩查陽(yáng)性質(zhì)粒分子的構(gòu)建和驗(yàn)證

將10 種元件/基因人工合成并克隆到pUC18 載體中，獲得篩查用陽(yáng)性質(zhì)粒分子pYMSC-1905（圖1），其總長(zhǎng)度為6 808 bp，由合成公司經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證與設(shè)計(jì)序列相符，且10 種目標(biāo)片段比值均為1。提取純化質(zhì)粒分子獲得了50 ng/μL 的樣品并在Nanodrop ND-2000 上進(jìn)行檢測(cè)，其A260/A280值為1.81，A260/A230為2.01，均符合紫外分光光度測(cè)試對(duì)DNA 純度的相關(guān)要求。

2.4 篩查陽(yáng)性質(zhì)粒分子數(shù)字PCR拷貝數(shù)測(cè)試

經(jīng)過初步計(jì)算和評(píng)估，將獲得的質(zhì)粒陽(yáng)性DNA樣品進(jìn)行梯度稀釋，使用10 種引物探針組合對(duì)其進(jìn)行拷貝數(shù)測(cè)試，最終顯示10 種目標(biāo)序列均獲得了良好的結(jié)果，其有效反應(yīng)孔數(shù)在15 000-17 000 cp/μL（圖2），符合數(shù)字PCR 反應(yīng)的相關(guān)參數(shù)要求，檢測(cè)出的陽(yáng)性質(zhì)粒分子濃度在600-1 000 cp/μL（表4）。

表3 不同轉(zhuǎn)基因玉米材料的篩查測(cè)試結(jié)果

圖1 玉米轉(zhuǎn)基因成分篩查陽(yáng)性質(zhì)粒pYMSC-1905 圖譜

2.5 篩查陽(yáng)性質(zhì)粒分子實(shí)時(shí)熒光PCR可替代性 測(cè)試

將數(shù)字PCR 測(cè)試的同一質(zhì)粒樣品進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR 反應(yīng)的可替代性測(cè)試，其檢測(cè)均獲得了正常的擴(kuò)增曲線（圖3），結(jié)果Ct 值均在36 以下（表5），與測(cè)試出的拷貝數(shù)具有良好的一致性，表明其可用作實(shí)時(shí)熒光PCR 檢測(cè)的陽(yáng)性對(duì)照使用。

3 討論

截 止2019 年11 月， 我 國(guó) 對(duì) 植 酸 酶 玉 米BVLA430101 發(fā)放了生產(chǎn)用安全證書，并且對(duì)20 種國(guó)外玉米轉(zhuǎn)化體發(fā)放了進(jìn)口用作加工原料安全證書，其中包括本次實(shí)驗(yàn)未參與驗(yàn)證的Bt11 X GA21，這21 種轉(zhuǎn)化體中除DAS-40278-9 外均可以被本方法 覆蓋。

圖2 陽(yáng)性質(zhì)粒分子3D-dPCR 驗(yàn)證熒光信號(hào)

表4 陽(yáng)性質(zhì)粒分子3D-dPCR 驗(yàn)證結(jié)果

圖3 陽(yáng)性質(zhì)粒分子實(shí)時(shí)熒光PCR 驗(yàn)證信號(hào)

表5 陽(yáng)性質(zhì)粒分子實(shí)時(shí)熒光PCR Ct 值

在轉(zhuǎn)基因作物的研發(fā)過程中，為使外源基因適合在宿主植物中進(jìn)行表達(dá)，經(jīng)常需要根據(jù)宿主密碼子的偏好對(duì)目標(biāo)元件的密碼子進(jìn)行修飾，從而造成相同名稱的基因不一定具有完全相同的核苷酸序列。因此，在設(shè)計(jì)檢測(cè)方法時(shí)必須考慮同名的基因元件其DNA 序列是否有差異，檢測(cè)靶標(biāo)在不同轉(zhuǎn)化事件中是否一致，能否用同樣的引物進(jìn)行檢測(cè)。

Cry1A基因由于被改造和使用的最多，其情況最為復(fù)雜，包含了Cry1Ab、Cry1Ac、Cry1A105等多種同源基因，本次篩查中選用的引物和探針組合可以特異性的檢出MON810、Bt176 等常見轉(zhuǎn)化體，但無法檢出Bt11，這是在日常檢測(cè)中需重點(diǎn)關(guān)注的問題。MON87427 在ISAAA 數(shù)據(jù)庫(kù)中顯示包含Cp4-epsps基因，但測(cè)試結(jié)果中并未出現(xiàn)陽(yáng)性結(jié)果，我們將其序列與I 型Cp4-epsps基因進(jìn)行了比對(duì)，發(fā)現(xiàn)其同源性有較大的差異（結(jié)果未列出），而這在各數(shù)據(jù)庫(kù)中并未有提示，容易給依賴目標(biāo)名稱和數(shù)據(jù)庫(kù)信息進(jìn)行日常檢測(cè)的機(jī)構(gòu)帶來誤判。

本研究中構(gòu)建的篩查質(zhì)粒按照理論計(jì)算獲得的數(shù)值與數(shù)字PCR 實(shí)際測(cè)試結(jié)果具有較大的差異，推測(cè)這可能是由質(zhì)粒分子本身結(jié)構(gòu)造成的，在實(shí)際應(yīng)用中一般傾向于以數(shù)字PCR 測(cè)試值為準(zhǔn)。由于該質(zhì)粒的研發(fā)目的是作為定性檢測(cè)的陽(yáng)性物質(zhì)，其量值的準(zhǔn)確性及均勻性并未進(jìn)行進(jìn)一步測(cè)試，這也是后續(xù)工作的重點(diǎn)研究?jī)?nèi)容。

4 結(jié)論

建立了以9 種常用元件/基因?yàn)槟繕?biāo)的基于實(shí)時(shí)熒光PCR 技術(shù)的玉米轉(zhuǎn)基因篩查方法，可覆蓋30種獨(dú)立性狀玉米轉(zhuǎn)化體，同時(shí)研制了可與該方法配套使用的陽(yáng)性質(zhì)粒分子。