陳 煒,張春陽(yáng),朱 穎,張炎華,游麗斌,吳冰珊,黃枝妙,鄭奎城,翁育偉

2019年12月在中國(guó)湖北省武漢市發(fā)生新型冠狀病毒感染的肺炎病例[1]，2020年1月12日，該新型冠狀病毒被命名為“2019-nCoV”[2]，該病毒是一種新型β屬冠狀病毒，屬正冠狀病毒亞科，但形成了另外一簇的進(jìn)化分枝，成為繼α-冠狀病毒的HCoV-229E和HCoV-NL63，β-冠狀病毒的HCoV-OC43、HCoV-HKU1、SARS-CoV和MERS-CoV之后，可以感染人類的冠狀病毒科中的第7個(gè)成員。

2020年1月20日我國(guó)將新型冠狀病毒感染的肺炎納入法定乙類傳染病，并采取甲類傳染病的預(yù)防、控制措施[3]。截至1月31日24時(shí)，中國(guó)大陸累計(jì)報(bào)告確診病例11 791例，重癥病例1 795例，死亡病例259例，港澳臺(tái)地區(qū)通報(bào)確診病例30例[4]，泰國(guó)、日本、新加坡及美國(guó)等二十幾個(gè)國(guó)家也相繼報(bào)告確診病例。2020年1月31日，世界衛(wèi)生組織宣布新型冠狀病毒感染的肺炎疫情構(gòu)成“國(guó)際關(guān)注的突發(fā)公共衛(wèi)生事件”[5]。福建省自2020年1月22日?qǐng)?bào)告首例輸入性新型冠狀病毒感染的肺炎確診病例[6]以來(lái)，截至1月31日24時(shí)，福建省累計(jì)報(bào)告新型冠狀病毒感染的肺炎確診病例144例[7]。為比較不同呼吸道標(biāo)本的病毒核酸檢測(cè)效果，我們對(duì)收集到的4例新型冠狀病毒確診病例的咽拭子與痰標(biāo)本開展病毒核酸檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1標(biāo)本 收集到2020年1月22日以來(lái)福建省各地市上送至省疾控中心的4例新型冠狀病毒確診病例的咽拭子與痰標(biāo)本。

1.2RNA提取 提取病毒的RNA采用QIAamp viral RNA mini kit(Qiagen, Hilden, Germany)試劑盒，從280 μL的標(biāo)本(咽拭子和痰標(biāo)本)中獲得50 μL的總RNA溶液，提取的RNA保存在-20 ℃待用。

1.3人體細(xì)胞管家基因GAPDH的檢測(cè) 應(yīng)用AgPath-IDTMOne-step RT-PCR Kit反應(yīng)試劑盒(ABI Ambion, Life Technologies, USA)及引物探針(GAPDH-F: 5′-CACATGGCCTCCAAGGAGTAA-3′, GAPDH-R: 5′-TGAGGGTCTCTCTCTTCCTCTTGT-3′ GAPDH-Prob: 5′-(FAM)CTGGACCACCAGCCCCAGCAAG(BHQ1) -3′)，進(jìn)行人體細(xì)胞管家基因GAPDH的檢測(cè)。按照試劑盒說(shuō)明書配制體系，反應(yīng)程序如下：45 ℃ 10 min, 95 ℃ 10 min; 95 ℃ 15 s, 60 ℃ 1 min, 40個(gè)循環(huán)。置ABI 7500儀器上檢測(cè)，單點(diǎn)熒光檢測(cè)在60 ℃，熒光檢測(cè)通道選擇FAM/none，passive reference選擇ROX。判定標(biāo)準(zhǔn)：陽(yáng)性(Ct值≤37，典型擴(kuò)增曲線)，灰區(qū)(3740或無(wú)，無(wú)擴(kuò)增曲線)。

1.4病毒基因ORF 1ab及基因N的檢測(cè) 應(yīng)用AgPath-IDTMOne-step RT-PCR Kit反應(yīng)試劑盒(ABI Ambion, Life Technologies, USA)及實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)指南[8]推薦的引物探針，進(jìn)行病毒基因ORF 1ab及基因N的檢測(cè)。按照試劑盒說(shuō)明書配制體系，反應(yīng)程序如下：為45 ℃10 min, 95 ℃10 min; 95 ℃15 s, 55 ℃1 min, 40個(gè)循環(huán)。置ABI 7500熒光定量PCR儀檢測(cè)，單點(diǎn)熒光檢測(cè)在55 ℃，熒光檢測(cè)通道選擇FAM/none，passive reference選擇ROX。判定標(biāo)準(zhǔn)：陽(yáng)性(Ct值≤37，典型擴(kuò)增曲線)，灰區(qū)(3740或無(wú)，無(wú)擴(kuò)增曲線)。

1.5病毒基因S檢測(cè) 應(yīng)用市場(chǎng)上流通的某商品化試劑進(jìn)行病毒基因S的檢測(cè)，按照試劑說(shuō)明書配制體系和設(shè)置反應(yīng)條件，放置Bio-Rad CFX96熒光定量PCR儀檢測(cè)。按照試劑說(shuō)明書判定結(jié)果。

2 結(jié) 果

2.1人體細(xì)胞管家基因GAPDH的檢測(cè) 4例2019-nCoV確診病例的咽拭子和痰標(biāo)本中，人體細(xì)胞管家基因GAPDH均呈現(xiàn)明顯典型的擴(kuò)增信號(hào)曲線(圖1)。但痰標(biāo)本中人細(xì)胞管家基因GAPDH擴(kuò)增曲線信號(hào)強(qiáng)于咽拭子，CT值均低于咽拭子(表1)。

圖1 4例2019-nCoV確診病例咽拭子(TS)和痰(S)標(biāo)本的人細(xì)胞管家基因GAPDH的擴(kuò)增曲線Fig.1 Amplification curves of human cell housekeeping gene GAPDH in throat swab (TS) and sputum (S) specimens from 4 2019-nCoV confirmed

表1 4例2019-nCoV確診病例咽拭子和痰標(biāo)本相關(guān)基因核酸檢測(cè)CT值
Tab.1 CT value of gene nucleic acid detection in throat swab and sputum samples of 4 2019-nCoV confirmed cases

CaseSpecimensCTGAPDHORF 1abNS1Throat swabs28.3236.635.4431.65sputum22.7730.2432.1424.382Throat swabs26.7124.2324.9720.02sputum23.0320.6221.315.783Throat swabs26.7625.2625.6620.74sputum24.3923.2022.4918.064Throat swabs25.5436.5136.30-sputum22.1723.4021.8018.57

2.2病毒ORF 1ab基因及N基因的檢測(cè) 采用實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)指南發(fā)布的2019-nCoV熒光PCR檢測(cè)引物和探針對(duì)4例2019-nCoV確診病例的咽拭子和痰標(biāo)本分別進(jìn)行病毒基因ORF 1ab(圖2)及基因N(圖3)核酸檢測(cè)。結(jié)果顯示，4例2019-nCoV確診病例的咽拭子和痰標(biāo)本，無(wú)論是病毒基因ORF 1ab還是基因N的熒光信號(hào)擴(kuò)增曲線中，痰標(biāo)本的擴(kuò)增曲線信號(hào)均比咽拭子強(qiáng)。其中，在病例1和病例4，咽拭子的病毒基因ORF 1ab及基因N的熒光信號(hào)均很微弱，而痰標(biāo)本的信號(hào)則較明顯。同樣，痰標(biāo)本中病毒基因ORF 1ab及基因N擴(kuò)增曲線的CT值均低于咽拭子(表1)。

2.3病毒S基因檢測(cè) 應(yīng)用商品化試劑對(duì)4例2019-nCoV確診病例的咽拭子和痰標(biāo)本進(jìn)行病毒基因S(圖4)核酸檢測(cè)。結(jié)果顯示，痰標(biāo)本中病毒基因S的擴(kuò)增曲線信號(hào)強(qiáng)于咽拭子，CT值均低于咽拭子(表1)。而在病例4的病毒基因S核酸檢測(cè)中，咽拭子呈現(xiàn)陰性結(jié)果。

3 討 論

本研究對(duì)4例新型冠狀病毒確診病例的咽拭子與痰標(biāo)本分別進(jìn)行人體細(xì)胞GAPDH管家基因、病毒ORF 1ab基因、N基因及S基因核酸檢測(cè)與比較。GAPDH管家基因幾乎在所有組織中都高水平表達(dá)，在同種細(xì)胞或者組織中的表達(dá)量一般是恒定的。本研究通過(guò)檢測(cè)咽拭子和痰標(biāo)本的GAPDH管家基因來(lái)評(píng)估標(biāo)本的采集質(zhì)量及核酸提取質(zhì)量，結(jié)果表明這4例新型冠狀病毒確診病例的咽拭子與痰標(biāo)本的標(biāo)本質(zhì)量及核酸提取效果均符合要求。

對(duì)于新型冠狀病毒的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)，我們采用實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)指南發(fā)布的2019-nCoV熒光PCR檢測(cè)引物和探針對(duì)4例2019-nCoV確診病例的咽拭子和痰標(biāo)本分別進(jìn)行病毒ORF 1ab基因及N基因核酸檢測(cè)，用市場(chǎng)流通的某商品化試劑對(duì)病毒S基因進(jìn)行核酸檢測(cè)。結(jié)果均表明，痰標(biāo)本的病毒含量均高于咽拭子標(biāo)本，痰標(biāo)本的檢測(cè)效果優(yōu)于咽拭子，其中，在病例1和4表現(xiàn)更加明顯，特別在病例4的咽拭子標(biāo)本檢測(cè)中，商品化試劑呈現(xiàn)陰性結(jié)果，而痰標(biāo)本則呈現(xiàn)非常明顯的陽(yáng)性結(jié)果。且在病毒核酸提取過(guò)程，我們采取雙倍標(biāo)本(280 μL)提取核酸，如果采取常規(guī)的140 μL標(biāo)本提取，病例1和4的核酸檢測(cè)，可能都會(huì)出現(xiàn)陰性結(jié)果導(dǎo)致漏檢。在痰標(biāo)本的液化過(guò)程中，我們采用等體積的1%胰酶(AMRESCO, Solon, Ohio, USA)與痰液混合37 ℃孵育震蕩液化15 min，但是痰標(biāo)本的液化效果依舊不是很理想，如果能找到更佳的液化痰標(biāo)本的方法，那么從痰標(biāo)本中獲取的病毒含量可能更高，更有利于實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)。

圖2 4例2019-nCoV確診病例咽拭子(TS)和痰(S)標(biāo)本的病毒ORF 1ab基因的擴(kuò)增曲線Fig.2 Amplification curves of viral gene ORF 1ab in throat swab (TS) and sputum (S) specimens from 4 2019-nCoV confirmed cases

圖3 4例2019-nCoV確診病例咽拭子(TS)和痰(S)標(biāo)本的病毒N基因的擴(kuò)增曲線Fig.3 Amplification curves of viral gene N in throat swab (TS) and sputum (S) specimens from 4 2019-nCoV confirmed cases

圖4 4例2019-nCoV確診病例咽拭子(TS)和痰(S)標(biāo)本的病毒基因S的擴(kuò)增曲線Fig.4 Amplification curves of viral gene S in throat swab (TS) and sputum (S) specimens from 4 2019-nCoV confirmed cases

痰標(biāo)本的病毒含量高于咽拭子標(biāo)本，可能與新型冠狀病毒主要侵襲感染下呼吸道細(xì)胞有關(guān)，進(jìn)而產(chǎn)生咳嗽、肺炎等臨床表現(xiàn)。同時(shí)，本研究結(jié)果也提示，在新型冠狀病毒感染肺炎病例實(shí)驗(yàn)室確診及出院實(shí)驗(yàn)室診斷時(shí)，以咽拭子病毒核酸檢測(cè)陰性作為排除感染及治愈標(biāo)準(zhǔn)在實(shí)施過(guò)程中需謹(jǐn)慎，必要時(shí)應(yīng)當(dāng)采集痰等其他標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)。此外，本結(jié)果也提示，當(dāng)前疫情防控措施需要增加宣傳公眾特別是肺炎患者不隨地吐痰，加強(qiáng)痰液管理及公共場(chǎng)所地面環(huán)境的衛(wèi)生消毒工作。

了解新型冠狀病毒在咽拭子、痰液、血液及糞便不同標(biāo)本中的病毒含量及存在時(shí)間，是實(shí)驗(yàn)室診斷新型冠狀病毒感染肺炎病例及判斷病例治愈的重要環(huán)節(jié)。本研究結(jié)果為新型冠狀病毒實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)中標(biāo)本的選擇及防控措施等提供了一些建議。由于標(biāo)本數(shù)量較少，在此后工作中，將進(jìn)一步收集更多的數(shù)據(jù)進(jìn)行比較分析。