張炎華，陳 煒，何文祥，吳冰珊，朱 穎，王金章，游麗斌，黃枝妙，陳宏彬，俞婷婷，鄢育青，吳晶晶，修文瓊，袁 平，張小鴻，駱 婧，翁育偉,2，鄭奎城,2

2019年12月以來(lái)，湖北省武漢市暴發(fā)了不明原因肺炎疫情，其他地區(qū)也陸續(xù)通報(bào)此類疫情。中國(guó)科學(xué)家在很短的時(shí)間內(nèi)確定了該疾病系由一種新型冠狀病毒所致。世界衛(wèi)生組織將這種新型冠狀病毒臨時(shí)命名為2019-nCoV，并將2019-nCoV感染導(dǎo)致的疾病命名為COVID-19[1]，我國(guó)衛(wèi)生健康行政部門將該疾病命名為“新型冠狀病毒肺炎”，簡(jiǎn)稱“新冠肺炎”。2019-nCoV為β屬的冠狀病毒，該病毒有包膜，顆粒呈圓形或橢圓形，常為多形性，直徑60～140 nm，基因組為單正鏈RNA，全長(zhǎng)約30 kb，可編碼E，M，N，S 4個(gè)主要的結(jié)構(gòu)蛋白和若干個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白。為了解福建省早期新冠肺炎病例中的2019-nCoV的基因特征，福建省疾控中心依托BSL-3實(shí)驗(yàn)室及時(shí)開(kāi)展了病毒分離和高通量測(cè)序工作，并對(duì)病毒的全基因組序列進(jìn)行了分析。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1樣本來(lái)源 用于病毒分離的樣本為福建省早期COVID-19確診和疑似病例的呼吸道樣本共12份，包括8份ORF1ab和N基因雙靶標(biāo)核酸檢測(cè)陽(yáng)性樣本、1份N基因單靶標(biāo)核酸檢測(cè)陽(yáng)性樣本和3份雙靶標(biāo)核酸陰性樣本。

1.1.2主要試劑與儀器 Vero-E6細(xì)胞(購(gòu)自ATCC)、細(xì)胞培養(yǎng)基Minimum Essential Medium(Gibco，REF：41500-34)、胎牛血清(PANSera ES，cat：2602-P130707)、核酸提取試劑盒QIAamp Viral RNA Mini Kit(QIAGEN，cat：52906)、雙鏈cDNA合成試劑Maxima H Minus Double-Stranded cDNA Synthesis Kit(ThermoFisher，cat：K2561)、文庫(kù)構(gòu)建試劑盒Ion Xpress Plus Fragment Library Kit(Thermo Fisher，cat：4471252)、模板制備與測(cè)序試劑盒Ion 520TM& Ion 530TMKit-Chef(Thermo Fisher，cat：A27757，與所選芯片型號(hào)配套)、測(cè)序芯片Ion 530TMChip Kit(Thermo Fisher，cat：A27763)、二氧化碳培養(yǎng)箱、倒置顯微鏡、Ion Torrent S5深度測(cè)序系統(tǒng)、序列拼接軟件CLC Genomics Workbench (QIAGEN，ver.11.0)等。

1.2 方 法

1.2.1樣本處理 COVID-19確診和疑似病例的呼吸道樣本中按照100∶1的比例加入10 000 IU的青霉素和10 000 μg的鏈霉素，使青霉素和鏈霉素的終濃度分別為100 IU和100 μg，置4 ℃過(guò)夜。

1.2.2細(xì)胞培養(yǎng)和病毒分離 將Vero-E6細(xì)胞接種至12.5 cm2的細(xì)胞瓶中，置36.0 ℃、5.0% CO2的培養(yǎng)箱中生長(zhǎng)成單層細(xì)胞。吸去生長(zhǎng)液(含10%胎牛血清)，用病毒維持液(2%胎牛血清)清洗細(xì)胞2遍。每個(gè)細(xì)胞瓶加入0.5ml經(jīng)雙抗(青霉素和鏈霉素)處理的COVID-19患者樣本，置36 ℃ CO2培養(yǎng)箱中吸附90 min后吸去樣本并加入3.5 mL維持液，每日觀察細(xì)胞病變情況。

1.2.3病毒核酸提取和反轉(zhuǎn)錄 核酸提取按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，提取的病毒核酸用于real-time RT-PCR檢測(cè)；高通量測(cè)序的RNA在提取過(guò)程中加入QIAGEN公司RNase-Free DNase用于去除宿主細(xì)胞DNA?；蚪M反轉(zhuǎn)錄按照試劑盒Maxima H Minus Double-Stranded cDNA Synthesis Kit說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.2.4高通量測(cè)序 對(duì)分離陽(yáng)性的樣本進(jìn)行高通量測(cè)序。樣品經(jīng)RNA提取、雙鏈cDNA合成、雙鏈cDNA純化、雙鏈cDNA定量、文庫(kù)構(gòu)建等步驟之后，采樣Ion Chef System完成測(cè)序模板制備和530芯片上樣，最后采用Ion Torrent S5測(cè)序儀進(jìn)行高通量測(cè)序。利用CLC Genomics Workbench(ver. 11.0)軟件拼接基因序列。

1.2.5序列分析 從GISAID和NCBI下載2019-nCoV基因組序列，利用MAFFT在線服務(wù)器做多序列排列(http://mafft.cbrc.jp/alignment/server/index.html)，利用DNAStar MegAlign計(jì)算序列一致性，利用MEGA6.06軟件構(gòu)建基于全基因組序列以及S、E、M、N等結(jié)構(gòu)蛋白編碼序列的種系進(jìn)化樹(shù)(Neighbor Joining法，bootstrap=1000)。

2 結(jié) 果

2.1細(xì)胞分離培養(yǎng)結(jié)果 本次共接種12份咽拭子樣本，包括8份ORF1ab和N基因雙靶標(biāo)核酸檢測(cè)陽(yáng)性樣本、1份N基因單靶標(biāo)核酸檢測(cè)陽(yáng)性樣本和3份雙靶標(biāo)核酸陰性樣本(見(jiàn)表1)。與正常細(xì)胞比較，8號(hào)和13號(hào)樣本自接種后第3 d開(kāi)始出現(xiàn)典型細(xì)胞病變(cyto-pathogenic effect，CPE)，第6 d細(xì)胞完全病變。其他樣本中，部分細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變，但與上述兩份樣本相比，CPE并不典型。為證實(shí)病毒分離成功，吸取培養(yǎng)物上清提取核酸做核酸檢測(cè)，結(jié)果兩份出現(xiàn)典型CPE的培養(yǎng)物Ct值較原始樣本顯著下降，3份接種前雙靶標(biāo)陰性樣本核酸檢測(cè)仍為陰性，其他樣本有部分檢出病毒核酸陽(yáng)性，但Ct值大于樣本接種前的Ct值，提示樣本中的病毒未在細(xì)胞中增殖和復(fù)制，其核酸陽(yáng)性應(yīng)為樣本殘留所致，具體見(jiàn)表1。為進(jìn)一步證實(shí)病毒分離結(jié)果，將所有樣本第一代培養(yǎng)物繼續(xù)盲傳一代。結(jié)果顯示除8號(hào)和13號(hào)樣本出現(xiàn)典型CPE外(圖1)，其他樣本均未出現(xiàn)CPE。

8號(hào)樣本13號(hào)樣本陰性對(duì)照(第2代第3 d，放大倍數(shù)：200倍)圖1 Vero-E6細(xì)胞接種COVID-19患者咽拭子樣本后的CPE情況Fig.1 CPE of Vero-E6 cell inoculated with throat swab specimens from COVID-19 patients

表1 新冠肺炎患者咽拭子樣本分離培養(yǎng)及核酸檢測(cè)情況
Tab.1 Nucleic acid test and CPE observation of Vero-E6 inoculated with throat swabs

樣本序號(hào)采集日期咽拭子核酸檢測(cè)結(jié)果(Ct值)ORF1abN細(xì)胞病變培養(yǎng)物核酸檢測(cè)結(jié)果(Ct值)OFR1abN12020012026.2927.93不明顯——320200120——不明顯——420200121——不明顯——52020012124.0326.67不明顯31.1331.13620200121——不明顯——72020012122.3231.46不明顯——82020012119.2023.56明顯9.479.4692020012228.3428.73不明顯36.74—112020012218.5332.47不明顯32.5132.72122020012222.9026.31不明顯29.8230.74132020012221.2224.67明顯9.558.821420200123—35.74不明顯35.7935.42

注：“—”代表陰性。核酸提取時(shí)均用50 μL RNase-free water洗脫。咽拭子樣本的檢測(cè)試劑為上海捷諾生物科技有限公司生產(chǎn)的新型冠狀病毒檢測(cè)試劑盒D2R(熒光定量PCR法)，培養(yǎng)物的檢測(cè)試劑根據(jù)中國(guó)疾控中心下發(fā)的檢測(cè)方案[2]，自行合成引物探針后配制反應(yīng)體系。兩種檢測(cè)試劑的結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)相同，Ct值<37為陽(yáng)性。

2.2高通量測(cè)序結(jié)果 選取8號(hào)和13號(hào)樣本培養(yǎng)物進(jìn)行高通量測(cè)序。結(jié)果顯示，兩份樣本所測(cè)定的總堿基數(shù)(Total Bases)分別為111 436 972和354 667 067，總reads數(shù)(Total Reads)分別為513 470和1 701 497，以早期公布的2019-nCoV病毒株Wuhan-Hu-1的基因組(GenBank Accession No.NC045512.2)為參考序列，所測(cè)reads的mapping數(shù)分別為445 476(86.76%)和1 113 346(65.43%)，基因組平均測(cè)序深度(Average Coverage)分別為3169和7697。測(cè)序后的數(shù)據(jù)經(jīng)CLC Genomics Workbench軟件(ver.11.0)拼接，第8號(hào)樣本培養(yǎng)物獲得29 871 bp的基因組序列，命名為BetaCoV-Fujian-08-2020(GISAID No.EPI_ISL_411060)，第13號(hào)樣本培養(yǎng)物獲得29 891 bp的基因序列，命名為BetaCoV-Fujian-13-2020(GISAID No.EPI_ISL_411066)，兩者基因組長(zhǎng)度的差異主要在3′polyA的長(zhǎng)度不同。

2.3基因組一致性分析 對(duì)BetaCoV-Fujian-08-2020和BetaCoV-Fujian-13-2020進(jìn)行全基因組一致性分析，相對(duì)于Wuhan-Hu-1的一致性超過(guò)均99.9%，提示病毒尚未發(fā)生變異；相對(duì)于SARS-coronavirus(GenBank Accession No.NC004718.3)的一致性均為80.2%；相對(duì)于在蝙蝠身上分離到的病毒株BetaCoV_bat_Yunnan_RaTG13_2013 (GISAID No.EPI_ISL_402131)的一致性均為96.3%；相對(duì)于在穿山甲身上分離到的毒株BetaCoV_pangolin_Guandong_1_2019(GISAID No.EPI_ISL_410721)的一致性為90.4%和90.3%。從結(jié)構(gòu)蛋白基因來(lái)看， 4個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白基因(E、M、N、S)中，兩株2019-nCoV分離株的S基因與以上參考株的S基因的一致性最低。全基因組及E、M、N、S結(jié)構(gòu)蛋白基因的一致性分析詳見(jiàn)表2。

表2 福建省兩株新型冠狀病毒分離株與遺傳相近的冠狀病毒的核酸序列一致性分析
Tab.2 Nucleotide identity of two 2019-nCoV isolates from Fujian and genetic-related coronaviruses

病毒參考基因一致性Wuhan-Hu-1SARS-CoV CoV-batCoV-pangolinFujian-08-2020全基因組10080.296.390.4E基因1009499.699.2M基因10084.795.593.3N基因10088.597.096.3S基因10074.393.484.9Fujian-13-2020全基因組99.980.296.390.3E基因1009499.699.2M基因10084.795.593.3N基因10088.597.096.3S基因10074.393.484.9

注：CoV-bat參比毒株為BetaCoV_bat_Yunnan_RaTG13_2013，CoV-pangolin參比毒株為BetaCoV_pangolin_Guandong_1_2019

2.4基因進(jìn)化分析 全基因組進(jìn)化分析顯示，本次流行的2019-nCoV與2003年流行的SARS-CoV在同一個(gè)進(jìn)化分枝上，親緣關(guān)系比較近。研究結(jié)果顯示，從福建省早期COVID-19病例中分離的BetaCoV-Fujian-08-2020和BetaCoV-Fujian-13-2020與國(guó)內(nèi)其他省份以及其他國(guó)家發(fā)現(xiàn)的2019-nCoV在同一進(jìn)化分枝上且親緣關(guān)系非常相近。E、M、N、S結(jié)構(gòu)蛋白基因的進(jìn)化分析結(jié)果與全基因組進(jìn)化分析結(jié)果基本相似，進(jìn)一步提示病毒尚未發(fā)生明顯變異。這些病毒與蝙蝠身上分離到的病毒BetaCoV_bat_Yunnan_RaTG13_2013的親緣關(guān)系較穿山甲身上分離到的病毒BetaCoV_pangolin_Guandong_1_2019的關(guān)系更近。詳見(jiàn)圖2。

3 討 論

國(guó)內(nèi)已有學(xué)者報(bào)道SARS-CoV可在Vero、Ve S5高通量測(cè)序系統(tǒng)對(duì)培養(yǎng)物進(jìn)行了基因組測(cè)序，將ro-E6、MDCK、Hela、Hep-2等不同細(xì)胞系中分離培養(yǎng)的情況[3]，但是目前關(guān)于2019-nCoV在不同細(xì)胞系中分離培養(yǎng)敏感性的報(bào)道較少，為提高分離培養(yǎng)的效率，可以對(duì)不同細(xì)胞系對(duì)2019-nCoV的敏感性做進(jìn)一步的研究。病毒在細(xì)胞中的分離培養(yǎng)情況與其結(jié)合到細(xì)胞受體上的能力有關(guān)。盡管2019-nCoV和SARS-CoV的受體均為血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE2)，但研究顯示2019-nCoV的S蛋白中受體結(jié)合區(qū)域(Receptor binding domain, RBD)發(fā)生了氨基酸改變，提高了病毒與受體的親和力[4-5]，而且S1和S2連接區(qū)插入了PRRA 4個(gè)氨基酸，在連接區(qū)形成PRRAR序列[6]，形成類似高致病性禽流感的HA鏈接肽，這或許會(huì)增強(qiáng)病毒的感染力。

通過(guò)對(duì)培養(yǎng)物進(jìn)行核酸檢測(cè)，我們初步確定分離到兩株病毒。然而，兩個(gè)基因靶標(biāo)檢測(cè)陽(yáng)性尚不能完全確證分離到毒株，因此我們利用Ion Torrent測(cè)序結(jié)果進(jìn)行拼接和比對(duì)之后獲得了病毒的全基因組，證實(shí)了2019-nCoV分離培養(yǎng)獲得成功。

圖2 福建省2株新型冠狀病毒全基因組進(jìn)化分析Fig.2 Phylogenetic tree of the complete genome of 2019-nCoV isolated from Fujian，China

通過(guò)對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析，我們發(fā)現(xiàn)自福建省早期COVID-19病例中分離到的2019-nCoV與Wuhan-Hu-1及其他地方的病毒全基因組一致性為99.9%以上，提示我省早期COVID-19患者所攜帶的病毒尚未發(fā)現(xiàn)變異。盡管本研究結(jié)果提示福建省分離到的2019-nCoV病毒沒(méi)有發(fā)現(xiàn)明顯的變異，但并不能排除病毒在疾病流行過(guò)程中逐步發(fā)生變異并導(dǎo)致生物學(xué)特征改變。在藥物治療、人體免疫和人際傳播代次等因素的影響下，病毒變異很有可能隨著時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸凸顯。因此，我們應(yīng)該對(duì)該病毒持續(xù)監(jiān)測(cè)，密切關(guān)注病毒變異情況。