薛 瑞，魏肇余，張森品，陳紅霞，李云峰，張有志

（軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院毒物藥物研究所，抗毒藥物與毒理學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100850）

創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙（post-traumatic stress disorder，PTSD）是指?jìng)€(gè)體經(jīng)歷、目睹或遭遇到一個(gè)或多個(gè)重大創(chuàng)傷性事件所導(dǎo)致的延遲出現(xiàn)和持續(xù)存在的一類精神障礙[1]。1980年，“美國(guó)精神疾病診斷與統(tǒng)計(jì)手冊(cè)”第三版（DSM-Ⅲ）首次定義了該疾病和明確了診斷標(biāo)準(zhǔn)，最新出版的DSM-Ⅴ將PTSD從焦慮障礙中分離出來(lái)，與急性應(yīng)激障礙、適應(yīng)障礙等歸入創(chuàng)傷及應(yīng)激相關(guān)障礙分類下[1-2]。流行病學(xué)研究表明，創(chuàng)傷事件發(fā)生后PTSD的終生患病率為1.3%～12.2%，其中女性發(fā)病率高于男性，兒童期遭遇創(chuàng)傷風(fēng)險(xiǎn)高于成人期[2-3]。目前PTSD的治療以心理干預(yù)和藥物治療相結(jié)合的方式為主，以舍曲林和氟西汀為代表的5-羥色胺重?cái)z取抑制劑被認(rèn)為是PTSD治療的首選用藥[4-5]。

PTSD病理機(jī)制研究和新藥評(píng)價(jià)依賴于理想的PTSD動(dòng)物模型，然而由于發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，單一模型無(wú)法全面模擬其核心癥狀，因此多采用多模型結(jié)合的方式評(píng)價(jià)疾病和藥物的作用特點(diǎn)。PTSD的核心癥狀群包括創(chuàng)傷事件闖入性回憶、創(chuàng)傷線索回避、高警覺(jué)和反應(yīng)性及認(rèn)知與情感的負(fù)性改變，其中創(chuàng)傷性事件闖入性回憶與恐懼記憶的再現(xiàn)具有相似的過(guò)程和表現(xiàn)[2]。條件性恐懼模型被認(rèn)為是模擬評(píng)價(jià)創(chuàng)傷事件闖入性回憶的經(jīng)典模型，此外，它還可評(píng)價(jià)恐懼記憶不同階段的特點(diǎn)，為我們精準(zhǔn)評(píng)價(jià)疾病發(fā)生和藥物作用特點(diǎn)提供了良好的工具。

本研究首先通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)對(duì)文獻(xiàn)方法[6-8]進(jìn)行改進(jìn)，建立穩(wěn)定的小鼠條件性恐懼模型，進(jìn)而以ICR小鼠、DBA/2小鼠（后簡(jiǎn)稱DBA小鼠）和C57BL/6J小鼠（后簡(jiǎn)稱C57小鼠）為研究對(duì)象，通過(guò)評(píng)價(jià)不同品系小鼠在場(chǎng)景恐懼和聲音線索恐懼獲得與表達(dá)的敏感性確定了C57為敏感品系鼠，并對(duì)C57小鼠條件性恐懼的自然消退和聲音線索恐懼消退訓(xùn)練和保持進(jìn)行研究。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

ICR小鼠和C57小鼠，雄性，SPF級(jí)，體質(zhì)量18～20 g，購(gòu)自斯貝福（北京）生物技術(shù)有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（京）2016-0002。DBA小鼠，雄性，SPF級(jí)，體質(zhì)量18～20 g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（京）2016-0006。飼養(yǎng)溫度 22～26℃，濕度40%～60%，8∶00-20∶00燈光照明，自由攝食飲水。

1.2 主要儀器

條件性恐懼檢測(cè)系統(tǒng)：包括條件性恐懼測(cè)試箱和Video Freeze SOF-843僵住時(shí)間采集軟件（美國(guó)Med Associates Inc.公司）。

1.3 小鼠條件性恐懼模型的建立

小鼠購(gòu)入后適應(yīng)性飼養(yǎng)6 d，實(shí)驗(yàn)當(dāng)天提前1 h放入實(shí)驗(yàn)間。不同品系小鼠放入電擊箱內(nèi)（A環(huán)境）自由探索2 min（適應(yīng)期）后，給與30 s聲音刺激（85 dB，5000 Hz），后2 s伴隨給與不可逃避的足底電擊（0.6 mA，持續(xù)2 s），聲音-電擊共配對(duì)5次，每次間隔2 min。計(jì)算機(jī)軟件記錄各個(gè)階段（包括適應(yīng)期、5輪聲音刺激期和5輪間歇期）的僵住時(shí)間，僵住時(shí)間百分率（%）=僵住時(shí)間（s）/總時(shí)間（s）×100%。僵住行為是嚙齒類動(dòng)物表達(dá)恐懼的方式，表現(xiàn)為除呼吸運(yùn)動(dòng)外全身其余的肌肉運(yùn)動(dòng)均消失[9]。

1.4 場(chǎng)景恐懼和聲音線索恐懼表達(dá)的檢測(cè)

場(chǎng)景恐懼表達(dá)檢測(cè)：條件性恐懼訓(xùn)練24 h后，將小鼠再次置于接受過(guò)電擊的裝置（環(huán)境A：足底電柵欄+白光）中，不給與任何刺激，進(jìn)行環(huán)境重現(xiàn)，記錄5 min內(nèi)的僵住時(shí)間，計(jì)算僵住時(shí)間百分率，評(píng)價(jià)3種品系小鼠場(chǎng)景條件恐懼表達(dá)的特點(diǎn)。

聲音線索恐懼表達(dá)檢測(cè)：場(chǎng)景恐懼檢測(cè)2 h后，將小鼠置于新環(huán)境（環(huán)境B：三角形半透明黑色套盒+白色底板+無(wú)白光）中，2 min適應(yīng)期后進(jìn)行30 s聲音刺激，聲音刺激結(jié)束30 s后將動(dòng)物取出，記錄各個(gè)階段（包括適應(yīng)期、聲音刺激期和間歇期）的僵住時(shí)間，計(jì)算僵住時(shí)間百分率，用于評(píng)價(jià)3種品系小鼠線索條件恐懼表達(dá)的特點(diǎn)。

1.5 條件性恐懼的自然消退

以C57小鼠為研究對(duì)象，分別于條件性恐懼訓(xùn)練后第2，7，14，21和28天對(duì)其場(chǎng)景恐懼和聲音線索恐懼進(jìn)行檢測(cè)，以評(píng)價(jià)該品系小鼠條件性恐懼的自然消退特點(diǎn)。其中，場(chǎng)景恐懼檢測(cè)5 min內(nèi)僵住時(shí)間（環(huán)境A，無(wú)聲音信號(hào)，不電擊），聲音線索恐懼檢測(cè)30 s聲音刺激期內(nèi)僵住時(shí)間（環(huán)境B，不電擊，2 min適應(yīng)+30 s聲音信號(hào)+30 s間歇），計(jì)算僵住時(shí)間百分率。

1.6 聲音線索恐懼消退訓(xùn)練和消退保持測(cè)試

以C57小鼠為研究對(duì)象，在條件性恐懼訓(xùn)練（方法見(jiàn)1.3）后24 h進(jìn)行聲音線索恐懼消退訓(xùn)練，消退訓(xùn)練結(jié)束后24 h進(jìn)行消退保持測(cè)試。消退訓(xùn)練方法：將C57小鼠放入B環(huán)境電擊箱中，適應(yīng)2 min后，采用“30 s聲音刺激+30 s間歇期”方法給與10次聲音刺激，計(jì)算機(jī)軟件記錄適應(yīng)期、10輪聲音刺激階段和10輪間歇期的僵住時(shí)間，計(jì)算僵住時(shí)間百分率，作為消退訓(xùn)練成績(jī)。消退保持測(cè)試方法：將C57小鼠放入B環(huán)境電擊箱中，適應(yīng)2 min后，給與30 s聲音刺激1次，刺激結(jié)束30 s后將動(dòng)物取出，記錄不同階段（適應(yīng)期+30 s聲音刺激期+30 s間歇期）內(nèi)僵住時(shí)間并計(jì)算僵住時(shí)間百分率，作為消退保持成績(jī)。

1.7 統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用±s表示，采用Prism8.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。兩組間比較采用Studentt或Manny-Whitney檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析和Dunnettt或Tukey檢驗(yàn)，不同時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)僵住時(shí)間百分率數(shù)據(jù)采用重復(fù)測(cè)量的單因素方差分析。P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3種品系小鼠條件性恐懼獲得的差異性

3種品系模型組小鼠隨聲音/場(chǎng)景-電擊配對(duì)次數(shù)增加均呈現(xiàn)僵住時(shí)間百分率增加（圖1），其中ICR小鼠末次檢測(cè)的僵住時(shí)間百分率為（29±22）%，DBA小鼠為（35±19）%，C57小鼠為（81±20）%。3種品系正常組小鼠不同時(shí)間點(diǎn)僵住時(shí)間百分率無(wú)明顯波動(dòng)。

2.2 3種品系小鼠條件性恐懼表達(dá)的差異性

條件性恐懼訓(xùn)練24 h后，分別進(jìn)行場(chǎng)景恐懼檢測(cè)和聲音線索恐懼檢測(cè)，評(píng)價(jià)不同品系小鼠條件性恐懼表達(dá)的差異。ICR，DBA和C57模型組小鼠場(chǎng)景恐懼的僵住時(shí)間百分率分別為（8±11）%，（26±20）%和（45±16）%（圖2），其中DBA小鼠和C57小鼠模型組與對(duì)照組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05，P＜0.01）。如圖3所示，ICR，DBA和C57模型組小鼠在新環(huán)境下的僵住時(shí)間百分率分別為（2±3）%，（5±5）%和（14±9）%，提示不同品系小鼠在新環(huán)境下未呈現(xiàn)恐懼反應(yīng)。在30 s的聲音刺激期，上述3種品系模型組小鼠的僵住時(shí)間百分率分別為（13±24）%，（47±26）%和（66±19）%，其中DBA小鼠和C57小鼠模型組與對(duì)照組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05，P＜0.01）。

2.3 C57小鼠條件性恐懼自然消退

分別于條件性恐懼訓(xùn)練第2天（D2）、D7、D14、D21和D28進(jìn)行5 min場(chǎng)景恐懼和30 s聲音線索恐懼檢測(cè)，評(píng)價(jià)C57小鼠條件性恐懼自然消退的行為特點(diǎn)。如圖4A所示，C57小鼠D2，D7，D14，D21和D28場(chǎng)景恐懼的僵住時(shí)間百分率分別為（45±16）%，（25±12）%，（19±8）%，（16±7）%和（25±14）%，其中D2與對(duì)照組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.01）。如圖4B所示，C57小鼠D2，D7，D14，D21和D28聲音線索恐懼的僵住時(shí)間百分率分別為（65±21）%，（69±13）%，（52±23）%，（58±31）%和（48±22）%，其中D2，D7，D14，D21與對(duì)照組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（分別為P＜0.01，P＜0.01，P＜0.05和P＜0.01）。

2.4 C57小鼠聲音線索恐懼的消退訓(xùn)練和保持

Fig.1 Fear acquisition performance following fear conditioning training in lCR（A），DBA（B）and C57（C）mice.Different strains of mice were placed in the foot shock box（context A）for 2 min before sound（30 s，85 dB）-shock（2 s，0.6 mA）presentation.Freezing behavior was recorded by computer.Percentage of freezing time（%）=freezing time（s）/total time（s）×100%.n=8-11.±s.

Fig.2 Contextual fear expression in lCR（A），DBA（B）and C57（C）mice 24 h following fear conditioning training.Twenty-four hours following fear conditioning training，different strains of mice were re-placed in the same shock box（context A）again，and freezing behavior was measured for 5 min without sound or shock.±s，n=10.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with control group.

Fig.3 Tone-cued fear expression in lCR（A），DBA（B）and C57（C）mice 24 h following fear conditioning training.Two hours following contextual fear expression test，different strains of mice were placed in a different context（context B ）for 2 min before 1 trail of 30 s sound-30 s interval.±s，n=10.＊＊P＜0.01，compared with control group.

Fig.4 Time-dependent extinction of contextual fear conditioning（A）and tone-cued fear conditioning（B）in C57 mice.Fear expression behavior in C57 mice was tested in context A and context B for 5 min and 30 s，respectively，in D2，D7，D14，D21 and D28.±s，n=10.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with control group.

Fig.5 Extinction training（A）and retention test（B）in C57 mice following tone-cued fear conditioning training.C57 mice were subjected to 10 extinction trails with 30 s sound presentation and 30 s intervals in context B.Twenty-four hours later，extinction retention test was performed in the same context for 30 s with sound on.±s，n=10.

條件性恐懼訓(xùn)練24 h后，采用“30 s聲音刺激-30 s間歇期”的方法進(jìn)行10輪聲音消退訓(xùn)練，如圖5A所示，隨消退訓(xùn)練次數(shù)增加，C57小鼠聲音線索恐懼反應(yīng)逐漸降低，第1輪和第10輪聲音刺激期僵住時(shí)間百分率分別為（55±30）%和（32±27）%。消退訓(xùn)練24 h后進(jìn)行消退保持測(cè)試，如圖5B所示，C57小鼠在30 s聲音刺激期的僵住時(shí)間百分率為（47±35）%。

3 討論

根據(jù)與創(chuàng)傷記憶是否具有直接聯(lián)結(jié)，PTSD模型可分為敏化模型和條件性恐懼模型，其中敏化模型包括單程長(zhǎng)時(shí)應(yīng)激模型、時(shí)間依賴敏化模型、單程短暫電擊模型、天敵模型和社會(huì)挫敗模型等[10-11]。無(wú)論是PTSD患者還是敏化動(dòng)物模型都會(huì)出現(xiàn)恐懼反應(yīng)增敏和（或）消退障礙等癥狀，因此條件性恐懼模型在PTSD病理機(jī)制研究和抗PTSD藥物評(píng)價(jià)中具有重要價(jià)值。條件性恐懼模型是基于巴甫洛夫條件反射，以電擊刺激為創(chuàng)傷性應(yīng)激因子，將中性條件性刺激（如應(yīng)激環(huán)境、聲音或燈光）和厭惡性的非條件刺激（電擊）進(jìn)行多次配對(duì)，動(dòng)物可獲得場(chǎng)景關(guān)聯(lián)恐懼（以環(huán)境為線索的恐懼條件化）和（或）聲音線索恐懼（以聲音為線索的恐懼條件化）[12]。

條件性恐懼模型的建立與多種因素密切相關(guān)，如動(dòng)物品系、電擊強(qiáng)度、電擊時(shí)間、聲音刺激時(shí)間、聲音-電擊配對(duì)次數(shù)、配對(duì)方式、預(yù)適應(yīng)方式、間歇期時(shí)間和實(shí)驗(yàn)?zāi)康牡取Ｓ?xùn)練過(guò)程是恐懼條件化的學(xué)習(xí)過(guò)程，不同實(shí)驗(yàn)室采用的造模訓(xùn)練方式不同。由于藥物對(duì)恐懼行為既可能發(fā)揮促進(jìn)作用也可能發(fā)揮抑制作用，因此本研究希望通過(guò)訓(xùn)練方案的優(yōu)化將僵住時(shí)間百分率控制在40%～60%。此外，本研究擬在D2同時(shí)檢測(cè)場(chǎng)景和聲音線索恐懼的表達(dá)，因此恐懼條件化訓(xùn)練時(shí)增加了間歇期時(shí)間，如僅檢測(cè)聲音線索恐懼的表達(dá)，則可縮短適應(yīng)期和間歇期的時(shí)間。在文獻(xiàn)調(diào)研和預(yù)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，本研究發(fā)現(xiàn)聲音-電擊配對(duì)5次可成功誘導(dǎo)C57小鼠形成場(chǎng)景恐懼和聲音線索恐懼，DBA小鼠可誘導(dǎo)形成聲音線索恐懼但無(wú)法形成場(chǎng)景恐懼，而神經(jīng)精神藥理學(xué)研究最常用的遠(yuǎn)交系小鼠品系ICR小鼠則無(wú)法誘導(dǎo)形成場(chǎng)景恐懼和聲音線索恐懼，提示動(dòng)物品系可能對(duì)條件性恐懼模型能否成功具有決定性的影響。結(jié)合恐懼消退和保持的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，本研究發(fā)現(xiàn)C57小鼠為條件性恐懼研究的敏感品系鼠，易形成恐懼反應(yīng)，聲音線索恐懼可持續(xù)3～4周。

除訓(xùn)練方式外，不同實(shí)驗(yàn)室采用的檢測(cè)指標(biāo)和檢測(cè)方式也不盡相同。僵住行為的檢測(cè)指標(biāo)分為僵住時(shí)間和僵住次數(shù)2種，二者記錄方式不同[13-14]。僵住時(shí)間是記錄檢測(cè)周期內(nèi)動(dòng)物呈現(xiàn)僵住反應(yīng)的累計(jì)時(shí)間，而僵住次數(shù)則是間隔固定時(shí)間（常為6～10 s，與檢測(cè)周期長(zhǎng)短有關(guān)）判斷一次動(dòng)物是否處于僵住狀態(tài)，進(jìn)而記錄累計(jì)僵住次數(shù)。本研究以小鼠為研究對(duì)象，條件性恐懼模型僵住行為研究時(shí)采用了計(jì)算機(jī)軟件自動(dòng)記錄僵住時(shí)間的方法。但值得注意的是，如以大鼠為研究對(duì)象，部分大鼠呼吸幅度較深，可能會(huì)影響計(jì)算機(jī)軟件采集數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性，此時(shí)建議采用人工記錄僵住次數(shù)的方式進(jìn)行數(shù)據(jù)采集。此外，本研究還對(duì)聲音線索恐懼的檢測(cè)方式進(jìn)行了優(yōu)化。目前，文獻(xiàn)報(bào)道的檢測(cè)場(chǎng)景恐懼采用的時(shí)長(zhǎng)多為3～11 min，其中以記錄5 min內(nèi)的僵住時(shí)間最常見(jiàn)[7，15]，本研究也采用該時(shí)長(zhǎng)進(jìn)行場(chǎng)景恐懼的檢測(cè)。然而對(duì)于聲音線索恐懼，多數(shù)文獻(xiàn)中采用檢測(cè)2或3 min內(nèi)僵住時(shí)間或次數(shù)的方法[6-7]，而本研究發(fā)現(xiàn)，2 min長(zhǎng)時(shí)聲音刺激時(shí)，小鼠發(fā)生了時(shí)間依賴的恐懼消退，此種方式檢測(cè)的聲音線索恐懼的僵住時(shí)間百分率不足30%（結(jié)果未列出），因此通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)，本研究將聲音線索恐懼的檢測(cè)時(shí)間優(yōu)化為30 s。

此外，值得注意的是，條件性恐懼模型是否成功不應(yīng)僅以統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果作為參照，而應(yīng)結(jié)合研究目的，以僵住時(shí)間百分率是否滿足實(shí)驗(yàn)需求為核心依據(jù)。例如，本研究中D2進(jìn)行的場(chǎng)景恐懼表達(dá)檢測(cè)中，DBA模型小鼠的僵住時(shí)間百分率雖與正常組相比顯著增加，但DBA模型組僵住時(shí)間百分率僅為25%，因此DBA小鼠并非場(chǎng)景恐懼檢測(cè)的合適品系，模型組25%的僵住率也無(wú)法滿足檢測(cè)藥物作用的目的。

綜上，本研究確定了C57小鼠為敏感品系，建立了恐懼獲得、表達(dá)、自然消退、消退訓(xùn)練和消退保持各階段恐懼行為檢測(cè)的實(shí)驗(yàn)方法，成功建立了小鼠條件性恐懼模型，該模型穩(wěn)定可靠，具有良好的可重復(fù)性。