張作艷，吳林文，馬家思，鄭珊珊，何 鐳，張 翀，曾玲暉

（浙江大學(xué)城市學(xué)院醫(yī)學(xué)院，浙江 杭州 310015）

胃癌是我國發(fā)病率和致死率較高的惡性腫瘤，手術(shù)切除后復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是影響胃癌患者生存和預(yù)后的主要因素[1]。因此，探尋參與胃癌轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵分子具有重要的意義。己糖激酶結(jié)構(gòu)域蛋白1（hexokinase domain-containing protein 1，HKDC1）是目前發(fā)現(xiàn)的第5種己糖激酶，在人體中具有調(diào)節(jié)葡萄糖穩(wěn)態(tài)的作用[2-3]。肝中的HKDC1在糖代謝、胰島素敏感性和孕期營養(yǎng)平衡等方面均發(fā)揮了重要作用，HKDC1過表達可改善全身葡萄糖耐量，增強肝和外周胰島素敏感性[4]。雖然目前對于HKDC1與腫瘤發(fā)生發(fā)展的具體作用機制尚不明確，但是有文獻報道，通過一種基于計算的抗癌活性富集分析方法發(fā)現(xiàn)，HKDC1有望成為肺癌治療的一個全新藥物治療靶點[5]。另有文獻報道，HKDC1在肝癌組織中過度表達，沉默HKDC1能夠抑制Wnt/β-連環(huán)蛋白信號傳遞抑制肝癌細胞的增殖和遷移，高表達HKDC1與肝癌患者不良預(yù)后密切相關(guān)[6]。然而，HKDC1在胃癌發(fā)生發(fā)展中的作用及機制尚不明確，本研究探討沉默HKDC1的表達與胃癌轉(zhuǎn)移和上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 細胞和試劑

人胃癌細胞（NCI-N87，BGC-823和HGC-27）均購自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫?；酋Ａ_丹明 B（sulforhodamine B，SRB）染料購自美國Sigma-Aldrich公司；一抗：兔抗人HKDC1單抗（ab228729）購自美國Abcam公司，兔抗人E-鈣黏蛋白單抗（3195P）、小鼠抗人N-鈣黏蛋白單抗（14215S）和兔抗人Snail單抗（3879S）購自美國CST生物技術(shù)公司，兔抗人GAPDH單抗（sc-25778）購自美國Santa公司；二抗：辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG抗體（71039511）和山羊抗兔IgG抗體（A80400644）購自杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司；jetPRIME（114-15）轉(zhuǎn)染試劑購自法國Polyplus Transfection SA公司；Gluta-MAX?谷氨酰胺培養(yǎng)基及添加劑（35050061）和丙酮酸鈉溶液（11360070）購自美國Gibco公司；siRNA購自 上 海 吉瑪基因。 Transwell小 室（8 μm，6297045）購自美國Corning公司；CO2恒溫細胞培養(yǎng)箱購自美國Thermo公司；SW-CJ-2J超凈工作臺購自蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；GZX-DH-40×45型倒置顯微鏡購自德國Leica公司；iCycle實時定量PCR系統(tǒng)、電泳儀和凝膠成像分析系統(tǒng)購自美國Bio-Rad公司。

1.2 細胞培養(yǎng)

將BGC-823和HGC-27細胞接種于RPMI 1640完全培養(yǎng)基（含青霉素100 kU·L-1，鏈霉素0.1 g·L-1，10%胎牛血清），NCI-N87接種于RPMI 1640完全培養(yǎng)基（含青霉素100 kU·L-1，鏈霉素0.1 g·L-1，10%胎牛血清，1%GlutaMAX?谷氨酰胺培養(yǎng)基及添加劑、1 mmol·L-1丙酮酸鈉溶液）置于37℃，5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3 HKDC1 siRNA序列的篩選和轉(zhuǎn)染

根據(jù)siRNA的設(shè)計原則以及GenBank中的HKDC1的基因序列，設(shè)計出具有特異性的針對HKDC1的干擾序列小干擾RNA（small interference RNA，siRNA）-1和siRNA-2，以及與HKDC1序列無同源性的陰性對照siRNA（negative control siRNA，siRNA-NC）。該序列設(shè)計由上海吉瑪公司完成。HKDC1 siRNA-1序列為5'-CCAACGCCCAAUGAAAUCATT-3，HKDC1 siRNA-2序列為 5'-GAGCUUGUCAGGCUUAUCUTT-3'，陰性對照siRNA序列為5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3'。

取對數(shù)生長期的胃癌細胞NCI-N87，BGC-823和HGC-27，按照每孔1.5×105細胞種入6孔板，過夜，待細胞生長至30%～40%融合度時進行轉(zhuǎn)染，將siRNA 4 μL加入jetPRIME 緩沖液200 μL中，溫和混勻，室溫孵育5 min，加入jetPRIME rejent試劑4 μL；再次溫和混勻，室溫孵育15～20 min。棄6孔板中培養(yǎng)液，用Opti-MEM洗1遍，每孔加入800 μL無雙抗的Opti-MEM，并同時將混合好的含有siRNA的200 μL試劑加入6孔板中，4 h后補加入含20%血清的培養(yǎng)液1 mL。轉(zhuǎn)染24 h后獲得NCI-N87-siRNA-NC，NCI-N87-siRNA-1和NCI-N87-siRNA-2細胞，BGC-823-siRNA-NC，BGC-823-siRNA-1和BGC-823-siRNA-2細胞，HGC-27-siRNA-NC，HGC-27-siRNA-1和HGC-27-siRNA-2細胞。

1.4 siRNA對HKDC1表達的抑制

轉(zhuǎn)染24 h后收集細胞，用RIPA裂解液在冰上裂解30 min，4℃，13 000×g離心30 min后，BCA法測定總蛋白濃度后進行Western印跡實驗，檢測siRNA對HKDC1表達的抑制效果，并計算抑制率。用Image J軟件對蛋白條帶進行積分吸光度（integrated absorbance，IA）分析，蛋白相對表達水平用IA目標(biāo)蛋白/IA內(nèi)參蛋白比值表示。HKDC1抑制率（%）=（陰性對照組HKDC1蛋白表達-沉默組HKDC1蛋白表達）/陰性對照組HKDC1蛋白表達×100%。

1.5 SRB染色法測定細胞存活率

將轉(zhuǎn)染24 h后的胃癌細胞經(jīng)胰酶消化，按每孔6×104細胞接種于96孔板，再孵育72 h后，棄上清，每孔加入100 μL三氯乙酸固定，4℃冰箱放置過夜，去離子水沖洗5遍后烘干，每孔加入0.4%（m/V）SRB染液50 μL，避光染色20 min，1%冰醋酸洗滌5遍后，烘干，加入三羥甲基氨基甲烷堿液100 μL，輕拍混勻，使用酶標(biāo)儀測定540 nm處的吸光度A540nm，并計算細胞存活率。實驗重復(fù)3次。細胞存活率（%）=（轉(zhuǎn)染組A540nm-空白對照組A540nm）/（陰性對照組A540nm-空白對照組A540nm）×100%。

1.6 Transwell法檢測細胞遷移能力

將HGC-27-siRNA-NC，HGC-27-siRNA-1和HGC-27-siRNA-2細胞和NCI-N87-siRNA-NC，NCI-N87-siRNA-1和NCI-N87-siRNA-2細胞以每孔8×104細胞，BGC-823-siRNA-NC，BGC-823-siRNA-1和BGC-823-siRNA-2細胞以每孔1×105細胞接種于無血清的200 μL培養(yǎng)基的Transwell小室上室，下室加入500 μL 20%胎牛血清培養(yǎng)基，置于37℃孵箱中常規(guī)培養(yǎng)24 h，取出后用1%甲紫甲醇溶液固定染色30 min，用棉棒清除上室未穿過細胞，PBS洗滌后隨機選取5個視野，顯微鏡下拍照，進行細胞計數(shù)，比較細胞遷移能力。

1.7 Transwell法檢測細胞侵襲能力

將0.5%的基質(zhì)膠按照每孔100 μL加入Transwell上室，37℃培養(yǎng)箱放置30 min后，取出吸取殘余液體，備用。將HGC-27-siRNA-NC，HGC-27-siRNA-1和HGC-27-siRNA-2細胞和NCI-N87-siRNA-NC，NCI-N87-siRNA-1和NCI-N87-siRNA-2細胞以每孔1×105細胞，BGC-823-siRNA-1和BGC-823-siRNA-2細胞以每孔1.2×105細胞接種于無血清的200 μL培養(yǎng)基的Transwell小室上室，下室加入500 μL 20%胎牛血清培養(yǎng)基，置于37℃孵箱中常規(guī)培養(yǎng)24 h，取出后用1%甲紫甲醇溶液固定染色30 min，用棉棒清除上室細胞，PBS洗滌后，顯微鏡下拍照，進行細胞計數(shù)，比較細胞侵襲能力。

1.8 Western印跡法檢測HKDC1蛋白和EMT相關(guān)蛋白表達

收集轉(zhuǎn)染24 h后的胃癌細胞，用RIPA裂解液在冰上裂解30 min，4℃，13 000×g離心30 min后，BCA法測定總蛋白：SDS-PAGE凝膠電泳后，轉(zhuǎn)膜，封閉 1 h，加一抗 4℃孵育過夜（HKDC1：1∶1000；E-鈣黏蛋白：1∶1000；N-鈣黏蛋白：1∶1000 ；Snail：1∶1000；GAPDH：1∶500）。回收一抗，PBS清洗3次后加二抗（HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG抗體1：5000；HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體1∶5000），室溫孵育1 h后曝光。用Image J軟件對蛋白條帶進行IA分析。待測蛋白相對表達水平用IA目標(biāo)蛋白/IA內(nèi)參蛋白比值表示。

1.9 統(tǒng)計學(xué)分析

實驗結(jié)果數(shù)據(jù)以±s表示。采用SPSS 22.0軟件，各組間的比較采用單因素方差分析（oneway ANOVA），組間兩兩比較采用Studentt檢驗。P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 siRNA對HKDC1表達的抑制效果

Western印跡結(jié)果顯示（圖1），轉(zhuǎn)染siRNA-1和siRNA-2后，與siRNA-NC組相比，3種細胞HKDC1蛋白表達降低（P＜0.05，P＜0.01）。對NCI-N87-siRNA-1和NCI-N87-siRNA-2細胞的抑制率分別為（20.5±0.1）%和（48.6±0.1）%，BGC-823-siRNA-1和BGC-823-siRNA-2細胞分別為（56.5±0.1）%和（58.9±0.1）%，HGC-27-siRNA-1和HGC-27-siRNA-2細胞分別為（63.5±0.1）%和（85.9±0.1）%。

Fig.1 Silence effect of siRNA on expression of hexokinase domain containing 1（HKDC1）protein in NCl-N87，BGC-823 and HGC-27 cells by Western blotting.Gastric cancer cells were transfected by negative control siRNA（siRNA-NC），HKDC1 siRNA-1（siRNA-1）and HKDC1 siRNA-2（siRNA-2）for 24 h，Western blotting was used to detect the expression of HKDC1.B was the semi-quantitative result of A.IA：integrated absorbance.±s，n=3. ＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with siRNA-NC group.

2.2 沉默HKDC1表達對胃癌細胞增殖的影響

由圖2顯示，與對應(yīng)的siRNA-NC組細胞相比，NCI-N87-siRNA-1和NCI-N87-siRNA-2細胞的存活率降低（P＜0.01），BGC-823-siRNA-1，BGC-823-siRNA-2，HGC-27-siRNA-1和HGC-27-siRNA-2細胞的存活率也均顯著低于siRNA-NC組（P＜0.05，P＜0.01），提示沉默HKDC1表達可顯著抑制胃癌細胞增殖。

Fig.2 Effect of silence HKDC1 on cell viability of NCl-N87，BGC-823 and HGC-27 cells transfected by siRNA.See Fig.1 for the cell transfection.The cells transfected by siRNA were incubated for 72 h and the SRB assay was used to detect the cell viability.Cell viability（%）=（A540 nmof siRNA group-A540 nmof blankgroup）/（A540 nmof siRNA-NCgroup-A540 nmof blank group）×100%.±s，n=3.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with siRNA-NC group.

2.3 沉默HKDC1表達對胃癌細胞遷移能力的影響

Transwell實驗結(jié)果顯示（圖3），轉(zhuǎn)染siRNA-1和siRNA-2后，3種細胞在Transwell小室內(nèi)培養(yǎng)24 h后，細胞的遷移數(shù)如圖3B所示。與對應(yīng)siRNA-NC組相比，轉(zhuǎn)染siRNA-1和siRNA-2細胞體外遷移能力顯著降低（P＜0.01），表明沉默HKDC1表達可抑制胃癌細胞遷移。

2.4 沉默HKDC1表達對胃癌細胞侵襲能力的影響

Transwell侵襲實驗結(jié)果如圖（圖4），轉(zhuǎn)染siRNA-1和siRNA-2后，3種細胞在Transwell小室內(nèi)培養(yǎng)24 h，細胞的侵襲數(shù)如圖4B所示。與對應(yīng)siRNA-NC組相比，轉(zhuǎn)染siRNA-1和siRNA-2細胞體外侵襲能力顯著降低（P＜0.01），提示沉默HKDC1可抑制胃癌細胞體外侵襲能力。

2.5 沉默HKDC1表達對EMT相關(guān)蛋白表達的影響

Western印跡結(jié)果（圖5）顯示，與siRNA-NC相比，分別轉(zhuǎn)染siRNA-1和siRNA-2 24 h后，3種細胞E-鈣黏蛋白表達顯著增加（P＜0.05，P＜0.01）；N-鈣黏蛋白表達顯著降低（P＜0.05，P＜0.01）；Snail蛋白表達在NCI-N87和BGC-823細胞中顯著下降（P＜0.01）；而在HGC-27細胞中，僅轉(zhuǎn)染siRNA-2的細胞表達顯著降低（P＜0.05）。

Fig.3 Effect of silence HKDC1 on migration of NCl-N87，BGC-823 and HGC-27 cells transfected by siRNA.See Fig.1 for the cell transfection.The cells were cultured in Transwell for 24 h.±s，n=3.＊＊P＜0.01，compared with siRNA-NC group.

Fig.4 Effect of silence HKDC1 on invasion of NCl-N87，BGC-823 and HGC-27 cells transfected by siRNA.See Fig.1 for the cell transfection.The cells were cultured in Transwell for 24 h.±s，n=3.＊＊P＜0.01，compared with siRNA-NC group.

Fig.5 Effect of silence HKDC1 on protein expressions of E-cadherin，N-cadherin and Snail in NCl-N87，BGC-823 and HGC-27 cells transfected by siRNA by Western blotting.See Fig.1 for the cell transfection.B was the semiquantitative result of A.±s，n=3.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with siRNA-NC group.

3 討論

胃癌是全球第五大最常被診斷的癌癥，也是第三大與癌癥死亡相關(guān)原因，胃癌患者的5年生存率僅為26%[7-8]。前期臨床TCGA數(shù)據(jù)庫挖掘發(fā)現(xiàn)，HKDC1在胃癌腫瘤組織中高表達，且HKDC1高表達患者較低表達患者預(yù)后更差，進一步提示HKDC1可能參與了胃癌的發(fā)生發(fā)展。本研究首先利用siRNA沉默HKDC1表達，發(fā)現(xiàn)siRNA-1和siRNA-2均能夠特異性抑制HKDC1的表達。隨后發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染siRNA-1和siRNA-2后，與siRNA-NC組相比，3種細胞的存活率降低，提示沉默HKDC1表達可顯著抑制胃癌細胞的增殖。在前期預(yù)實驗中發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染siRNA-NC對HKDC1表達無影響，與正常對照組細胞無差別，因此本研究中未設(shè)細胞對照組。

胃癌復(fù)發(fā)和高轉(zhuǎn)移是威脅患者生存的重要因素[9]，闡明影響胃癌轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵分子將為晚期胃癌治療提供生物標(biāo)志物和治療靶點。本研究用siRNA沉默HKDC1后，檢測胃癌細胞體外遷移和侵襲的能力變化，發(fā)現(xiàn)與siRNA-NC組相比，3種細胞HKDC1表達被抑制后，體外遷移和侵襲的能力均顯著下降，提示靶向沉默HKDC1可能是抑制胃癌轉(zhuǎn)移的有效途徑。據(jù)報道，HKDC1在乳腺癌細胞和臨床乳腺癌腫瘤組織中也存在高表達，沉默HKDC1能夠在體內(nèi)和體外水平抑制乳腺癌細胞的增殖以及腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移[10]。因此，靶向HKDC1信號通路可能是抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的新型治療策略。

EMT是指上皮細胞轉(zhuǎn)化為具有間質(zhì)表型及生物學(xué)特性的生物學(xué)過程，其異常與腫瘤轉(zhuǎn)移、耐藥和腫瘤干細胞特性密切相關(guān)。鈣黏蛋白是一種鈣依賴性的負責(zé)調(diào)節(jié)細胞間黏附作用的跨膜糖蛋白家族[11]。分為10多個亞類，包括EMT重要的標(biāo)志物E-鈣黏蛋白、N-鈣黏蛋白和跨膜糖蛋白等[12]。EMT發(fā)生過程中，細胞-細胞間黏附的上皮標(biāo)志物E-鈣黏蛋白的表達下調(diào)，而間質(zhì)細胞標(biāo)志物N-鈣黏蛋白、纖黏蛋白（fibronectin）和波形蛋白（vimentin）等表達上調(diào)。E-鈣黏蛋白參與調(diào)節(jié)細胞增殖、侵襲和遷移的信號通路，E-鈣黏蛋白失調(diào)導(dǎo)致胃上皮細胞功能障礙并導(dǎo)致胃癌發(fā)展[13]。此外，其表達變化可反映胃黏膜的的病理狀態(tài)。在胃癌中，可溶性的E-鈣黏蛋白可作為胃癌的預(yù)后分子標(biāo)志物[14]和獨立的預(yù)后因子[15]。本研究結(jié)果表明，沉默HKDC1表達能促進E-鈣黏蛋白的表達，抑制N-鈣黏蛋白的表達，表明HKDC1可能通過抑制EMT影響胃癌細胞的遷移和侵襲能力。轉(zhuǎn)錄因子Snail可促進EMT的發(fā)生，并在多種腫瘤中呈高表達。Snail高表達的腫瘤組織中，E-鈣黏蛋白表達常下降。本研究結(jié)果表明，沉默HKDC1表達可以抑制Snail蛋白的表達。但HKDC1如何調(diào)控胃癌細胞EMT發(fā)生還有待更深入的研究。

綜上所述，沉默HKDC1表達后，胃癌細胞增殖、EMT和侵襲運動能力均受到抑制，提示HKDC1可能參與胃癌細胞轉(zhuǎn)移，HKDC1有可能成為胃癌治療的潛在分子靶點。