李青穎，趙莉莉，李軍紅，楊海軍，賈漫漫，王富強(qiáng)，宋文憑，王新偉，孫獻(xiàn)甫，喬江華，申培紅

(1.鄭州大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院 a.病理科;b.防癌辦公室;c.腫瘤科;d.乳腺外科，河南 鄭州 450001；2.河南大學(xué)第一附屬醫(yī)院 乳腺甲狀腺外科，河南 開(kāi)封 475000；3.鄭州大學(xué)附屬洛陽(yáng)市中心醫(yī)院 病理科，河南 洛陽(yáng) 471000；4.安陽(yáng)腫瘤醫(yī)院 病理科，河南 安陽(yáng) 455000)

乳腺癌是多數(shù)國(guó)家最常被診斷的癌癥，也是癌癥患者死亡的主要原因[1]。三陰性乳腺癌(triple negative breast cancer，TNBC)占所有類型乳腺癌的20%～25%，TNBC惡性程度高，侵襲性強(qiáng)，易發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，無(wú)法從內(nèi)分泌治療或者分子靶向治療中獲益[2]。需要尋求新的治療靶標(biāo)和治療藥物。在15%～25%的浸潤(rùn)性乳腺癌中觀察到人表皮生長(zhǎng)因子受體2(human epidermal growth factor receptor-2，HER2)過(guò)表達(dá)與腫瘤高分級(jí)、高細(xì)胞增殖率、P53突變及拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱa擴(kuò)增等相關(guān)，HER2過(guò)表達(dá)增加了癌細(xì)胞的侵襲性和復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)，常提示預(yù)后不良[3]。針對(duì)HER2受體的多種生物制劑改善了患者的預(yù)后，但根據(jù)現(xiàn)有數(shù)據(jù)顯示單藥應(yīng)用的有效率較低且部分患者存在抗藥性，因此需要尋求新的治療靶標(biāo)及組合方式。研究發(fā)現(xiàn)，雄激素受體(androgen receptor，AR)在乳腺癌中廣泛表達(dá)，已成為預(yù)測(cè)乳腺癌預(yù)后的新型標(biāo)志物和治療靶標(biāo)之一[4]。本研究旨在分析AR在HER2+乳腺癌和TNBC中的表達(dá)水平與臨床指標(biāo)的關(guān)系。

1 資料和方法

1.1 一般資料回顧性分析鄭州大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院、河南大學(xué)第一附屬醫(yī)院、安陽(yáng)腫瘤醫(yī)院和鄭州大學(xué)附屬洛陽(yáng)市中心醫(yī)院2018年1月至2019年12月收治的經(jīng)外科手術(shù)且經(jīng)病理分子科確診的345例HER2+乳腺癌和TNBC。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)手術(shù)前未接受任何治療(內(nèi)分泌治療、新輔助化療、放療等)；(2)患者入院后接受“乳腺癌改良根治術(shù)+腋窩淋巴結(jié)清掃術(shù)”治療；(3)經(jīng)病理分子科檢查確診為浸潤(rùn)性乳腺癌；(4)不伴有其他重要器官嚴(yán)重病變者，如心肺功能不全等；(5)有完整的病理及臨床資料。排除標(biāo)準(zhǔn)：未經(jīng)病理分子科檢查的病例，病理、臨床資料不完善的患者及缺乏本研究所需指標(biāo)的患者。345例患者年齡35～74歲，平均(46.05±3.28)歲，包括HER2+乳腺癌患者267例，TNBC患者78例。

1.2 收集指標(biāo)應(yīng)用免疫組化檢測(cè)AR、Ki67在HER2+乳腺癌和TNBC患者中的表達(dá)情況。統(tǒng)計(jì)所有患者的腫瘤直徑、區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的情況后行病理TNM分期，根據(jù)病理TNM分期(2017年AJJCC乳腺癌分期，第八版)[5]，將其分為Ⅰ期，Ⅱ期，Ⅲ期及Ⅳ期。分析AR在HER2+乳腺癌和TNBC患者中的表達(dá)與年齡、脈管內(nèi)癌栓、組織學(xué)分級(jí)、腫瘤直徑、區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、Ki67及TNM分期的關(guān)系。

1.3 檢測(cè)方法

1.3.1免疫組化染色 使用100 g·L-1中性甲醛固定24 h，采用streptavidin-peroxidase(SP)免疫組織化學(xué)法進(jìn)行染色。采用常規(guī)石蠟包埋切片4 μm后脫蠟水化，使用磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗，將玻片置入枸櫞酸抗原修復(fù)液中進(jìn)行熱抗原修復(fù)，然后將玻片浸入體積分?jǐn)?shù)為3%的過(guò)氧化氫中，室溫孵育一抗及二抗，接著滴加二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色液，采用蘇木精復(fù)染，然后將玻片依次置入體積分?jǐn)?shù)為70%、80%、95%、100%的酒精中進(jìn)行水化鹽酸酒精酸化，最后行中性樹(shù)膠封片。每次試驗(yàn)均設(shè)有陽(yáng)性對(duì)照，即已知的乳腺癌組織切片，而以PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。所有的抗體[雌激素受體(estrogen receptor，ER)、孕激素受體(progesterone receptor，PR)、HER2、AR、P53、Ki67]及工作液均購(gòu)自福州邁新生物公司。

1.3.2結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn) 由醫(yī)院病理分子科2名具有高級(jí)職稱的醫(yī)生獨(dú)立雙盲觀察免疫組織化學(xué)染色的切片，對(duì)每張組織切片隨機(jī)選取5個(gè)高倍鏡(×400)視野并觀察細(xì)胞的染色強(qiáng)度。乳腺癌腫瘤組織中AR、ER、PR和Ki67均表達(dá)于細(xì)胞核，當(dāng)細(xì)胞核中出現(xiàn)陽(yáng)性著色(細(xì)胞核內(nèi)呈棕黃色)且著色細(xì)胞≥10%即AR為陽(yáng)性，反之則為陰性；當(dāng)細(xì)胞核中出現(xiàn)陽(yáng)性著色(細(xì)胞核內(nèi)呈棕黃色)且著色細(xì)胞≥1%即ER和PR為陽(yáng)性，當(dāng)細(xì)胞核中出現(xiàn)陽(yáng)性著色(細(xì)胞核內(nèi)呈棕黃色)且著色細(xì)胞<1%即ER和PR為陰性；當(dāng)細(xì)胞核中出現(xiàn)陽(yáng)性著色(細(xì)胞核內(nèi)呈棕黃色)且著色細(xì)胞≥20%即Ki67為高表達(dá)屬于陽(yáng)性，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)<20%為低表達(dá)屬于陰性。對(duì)于HER2的判定，陽(yáng)性即在腫瘤區(qū)域內(nèi)觀察到>10%的侵襲性腫瘤細(xì)胞膜均一、完整、強(qiáng)染色，反之則為陰性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 24.0統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù)。定性資料以率(%)表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 AR與臨床病理參數(shù)的關(guān)系HER2+乳腺癌患者AR陽(yáng)性表達(dá)率與組織學(xué)分級(jí)、區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及Ki67表達(dá)水平有關(guān)(均P<0.05)。HER2+乳腺癌患者AR陽(yáng)性表達(dá)率與年齡、脈管內(nèi)癌栓、腫瘤直徑及TNM分期無(wú)關(guān)(均P>0.05)。TNBC患者AR陽(yáng)性表達(dá)率與年齡和Ki67表達(dá)水平有關(guān)(均P<0.05)。TNBC患者AR陽(yáng)性表達(dá)率與脈管內(nèi)癌栓、組織學(xué)分級(jí)、腫瘤直徑、區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期無(wú)關(guān)(均P>0.05)。見(jiàn)表1。

表1 AR在HER2+乳腺癌和TNBC中的表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系

注：AR—雄激素受體；HER2—人表皮生長(zhǎng)因子受體2；TNBC—三陰性乳腺癌。

2.2 AR在HER2+乳腺癌和TNBC中的表達(dá)HER2+乳腺癌的AR表達(dá)率為76.78%(205/267)，AR在TNBC中的表達(dá)率為39.74%(31/78)。HER2+乳腺癌的AR表達(dá)率高于TNBC者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

3 討論

AR在60%～80%的乳腺癌中廣泛表達(dá)，逐漸成為預(yù)測(cè)乳腺癌患者預(yù)后的新型標(biāo)志物和潛在的治療靶標(biāo)[6]。AR與ER、PR、糖皮質(zhì)激素受體及鹽皮質(zhì)激素受體同屬類固醇激素受體超家族，被認(rèn)為是激素受體調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子。AR與青春期第一特征和第二特征、性欲、肌肉力量水平以及成年人的生育能力等相關(guān)，并且參與前列腺癌和乳腺癌的發(fā)生[7]。AR基因位于1個(gè)由180 kb基因編碼的919個(gè)氨基酸的染色體長(zhǎng)臂Xq11-12上，包含8個(gè)外顯子并且該受體具有3個(gè)功能結(jié)構(gòu)域：外顯子1編碼氨基末端域(NTD)，外顯子2和3編碼DNA結(jié)合域(DBD)，外顯子4編碼鉸鏈區(qū)，連接DBD與配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域(LBD)，余外顯子編碼LBD。AR是信號(hào)通路的關(guān)鍵組成部分，作為調(diào)節(jié)基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子發(fā)揮關(guān)鍵作用，可控制許多生理和病理過(guò)程的特定基因表達(dá)[7]。雄激素進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)后與AR結(jié)合導(dǎo)致熱激蛋白解離，激活的AR二聚體隨后移位至細(xì)胞核，與靶基因的啟動(dòng)子和增強(qiáng)子區(qū)域中的雄激素響應(yīng)元件結(jié)合導(dǎo)致DNA轉(zhuǎn)錄的上調(diào)或下調(diào)。根據(jù)組織類型的不同致使細(xì)胞分裂、分化、凋亡、增殖和血管生成[8]。

既往研究顯示，AR在HER2+乳腺癌中的表達(dá)率約為76.7%[9]，AR在TNBC中的表達(dá)率為12%～60%[10]。本研究結(jié)果顯示，HER2+乳腺癌患者的AR表達(dá)率為76.78%，AR在TNBC中的表達(dá)率為39.74%，HER2+乳腺癌的AR表達(dá)率高于TNBC者。這與上述研究結(jié)果[9-10]相符。在本研究中，HER2+乳腺癌患者AR陽(yáng)性表達(dá)率與組織學(xué)分級(jí)、區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及Ki67表達(dá)水平有關(guān)。AR陽(yáng)性表達(dá)率與組織學(xué)分級(jí)呈負(fù)相關(guān)，即組織學(xué)分級(jí)越高，AR陽(yáng)性表達(dá)率越低，這與張靜等[11]研究結(jié)果一致。在本研究中，區(qū)域淋巴結(jié)無(wú)轉(zhuǎn)移者AR陽(yáng)性表達(dá)率高于淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者，這提示AR陽(yáng)性表達(dá)情況可能和預(yù)后相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)HER2+乳腺癌患者AR陽(yáng)性表達(dá)率與Ki67表達(dá)水平有關(guān)，這與其他研究結(jié)果[12]類似。本研究中TNBC患者AR陽(yáng)性表達(dá)率與年齡有關(guān)，年齡越大AR陽(yáng)性表達(dá)率越高，這與賈秀鵬等[13]研究結(jié)果一致。本研究結(jié)果表明，TNBC患者AR陽(yáng)性表達(dá)率與Ki-67表達(dá)水平有關(guān)。這預(yù)示AR陽(yáng)性表達(dá)的乳腺癌患者的腫瘤細(xì)胞增殖活性相對(duì)降低，提示可能有較好的預(yù)后，與Qi等[14]研究觀點(diǎn)一致，但與Gerratana等[15]研究結(jié)果相反。Gerratana等[15]研究發(fā)現(xiàn)，AR陽(yáng)性表達(dá)情況與較高的Ki67指數(shù)相關(guān)?？傊鄶?shù)HER2+乳腺癌和TNBC患者表達(dá)AR。

HER2+/ER-/AR+乳腺癌MDA-MB-453細(xì)胞基因表達(dá)譜的整體AR染色質(zhì)結(jié)合圖譜與ER+乳腺癌中的ER高度重疊。這提示AR在驅(qū)動(dòng)細(xì)胞增殖中可能承擔(dān)了與ER相似的致癌作用，AR信號(hào)通路具有增殖作用[16]。AR拮抗劑可有效減少細(xì)胞增殖。HER2信號(hào)傳導(dǎo)是HER2+乳腺癌患者主要的致癌驅(qū)動(dòng)因素。目前臨床研究正在積極探索AR拮抗劑與抗HER2治療聯(lián)合使用是否具有更好的療效。TNBC分子亞型中的管腔雄激素受體亞型(LAR)以AR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)為特征，對(duì)AR拮抗劑具有獨(dú)特的敏感性，AR拮抗劑的使用似乎是治療此類疾病的合理選擇，加上AR的激活導(dǎo)致AR介導(dǎo)的促凋亡基因和抗凋亡基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)進(jìn)而降低了對(duì)LAR亞型的化療功效，因此AR拮抗劑與化療聯(lián)合使用似乎也是有效的方案[17]。Gucalp等[18]探討了比卡魯胺在AR陽(yáng)性和ER/PgR陰性的轉(zhuǎn)移性乳腺癌中的作用，這是第1個(gè)有關(guān)抗雄激素治療晚期乳腺癌的臨床試驗(yàn)，最終結(jié)果確定了AR作為靶標(biāo)的潛力效應(yīng)。Bonnefoi等[19]和Traina等[20]研究也觀察到AR陽(yáng)性的TNBC患者從抗雄激素治療中獲益。

綜上所述，HER2+乳腺癌患者AR陽(yáng)性表達(dá)率與組織學(xué)分級(jí)、區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及Ki67表達(dá)水平有關(guān)，TNBC患者AR陽(yáng)性表達(dá)率與年齡和Ki67表達(dá)水平有關(guān)。HER2+乳腺癌和TNBC的AR陽(yáng)性表達(dá)率均較高，AR可能成為HER2+乳腺癌和TNBC的新型治療靶標(biāo)。