梁小煙 林玫 梁大斌 藍如束 覃慧芳 葉婧 黃莉雯

據(jù)全國第五次結核病流行病學抽樣調(diào)查報告顯示，我國結核病總耐藥率為42.10%，耐多藥(multidrug-resistant, MDR)發(fā)生率為6.8%，雖較2000年有所下降，但仍高于全球平均水平，耐藥形勢不容樂觀[1]。北京基因型作為全球第二大流行菌株，與INH、RFP、EMB耐藥的發(fā)生呈正相關，與MDR的發(fā)生呈強相關[2-3]。間隔區(qū)寡核苷酸基因分型(Spoligotyping)技術是鑒定北京基因型的金標準，但其所耗時間較長，容易造成交叉污染且易出現(xiàn)人為判讀錯誤；而熔解曲線間隔區(qū)寡核苷酸基因分型(melting curve analysis-based Spoligotyping，McSpoligotyping)是一種新型的基因分型技術，與傳統(tǒng)的Spoligotyping相比，不僅大大縮短了實驗時間，也避免了由于人工判讀而導致的錯誤；同時其結果的準確率也較高，可用于結核病的流行病學研究[4]。廣西壯族自治區(qū)(以下簡稱“廣西”)位于我國西南地區(qū)，由于其特殊的地理位置，結核病和MDR-TB 疫情一直處于全國較高水平[5-6]，嚴重制約著廣西的經(jīng)濟發(fā)展，然而關于廣西MDR-MTB基因型與耐藥性的關系鮮有報道。因此，本研究采用McSpoligotyping分型技術對收集到的MDR-MTB菌株進行基因分型，了解其耐藥情況和基因型分布特征，同時分析基因型與耐藥的關系。

材料和方法

一、菌株來源

采用連續(xù)監(jiān)測的方法，選取位于廣西境內(nèi)東、西、南、北、中的貴港市、百色市、崇左市、桂林市、防城港市5個市為監(jiān)測點，采用隨機數(shù)字表法抽取5個市中的21個縣(市、區(qū))，納入于2016—2017年在當?shù)亟Y核病防治(簡稱“結防”)機構登記治療且培養(yǎng)陽性的MTB菌株，共1514株，將菌株送往廣西疾病預防控制中心結核病防治所進行藥物敏感性試驗(簡稱“藥敏試驗”)，最終有51株確定為MDR-MTB菌株，其中貴港市12株(23.53%)、百色市9株(17.65%)、崇左市18株(35.29%)、桂林市5株(9.80%)、防城港市7株(13.73%)。

二、研究方法

(一)藥敏試驗

采用WHO[7]推薦的比例法進行藥敏試驗，本研究共檢測6種藥品，包括異煙肼(INH)、利福平(RFP)、乙胺丁醇(EMB)、鏈霉素(Sm)、氧氟沙星(Ofx)和卡那霉素(Km)。

(二)DNA提取(煮沸法)

取帶螺旋蓋的前處理管，加入500 μl滅菌生理鹽水；用接種環(huán)在固體培養(yǎng)基上刮取1～2環(huán)MTB加入前處理管中；使用80 ℃水浴滅活30 min后，12 000×g離心5 min；棄上清液，然后加入200 μl三羥甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸緩沖液(TE)重懸菌體；置于100 ℃金屬浴中15 min，取出后12 000×g離心10 min后取其上清液置于潔凈的EP管中備用。

(三)McSpoligotyping基因分型

1.操作步驟：每份樣本分為3管進行檢測，分別加擴增試劑McSpoligotyping PCR Mix(A/B/C)。先按照每個樣本19.75 μl McSpoligotyping PCR Mix(A/B/C)+0.25 μl McSpoligotyping酶的比例混合PCR反應液，混勻后3000×g離心5 s，然后抽取20 μl離心后的3種PCR反應液分裝于PCR薄壁反應管中，最后加入5 μl DNA樣本或陰/陽性對照品后置于PCR儀中進行擴增。

2.PCR擴增條件和熔解曲線分析：50 ℃ 5 min→95 ℃ 10 min→(95 ℃ 15 s→57 ℃ 15 s→72 ℃ 15 s)×50個循環(huán)→95 ℃ 1 min→35 ℃ 1 min→35 ℃～90 ℃ 以0.04 ℃/s的速率升溫時進行熔解曲線分析，并采集羧基熒光素(FAM)、羧基羅丹明(ROX)、六氯熒光素(HEX)和吲哚二碳菁(CY5)四個通道的熒光信號。

3.結果判讀：本研究共檢測43個間隔子，判讀規(guī)則見文獻[8]。將數(shù)據(jù)表提交至國際數(shù)據(jù)庫MIRU-VNTRplus (https://www.miru-vntrplus.org/MIRU/index.faces)和SpolDB4.0數(shù)據(jù)庫進行比對。

三、統(tǒng)計學處理

采用SPSS 17.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，計數(shù)資料的比較采用卡方檢驗或Fisher確切概率法，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義，均為雙側檢驗。

結 果

一、耐藥情況

51株MDR-MTB菌株中，有21株對EMB耐藥，16株對Sm耐藥，15株對Ofx耐藥，1株對Km耐藥，耐藥率分別為41.18%、31.37%、9.80%和1.96%。耐藥形式共9種，包括耐INH+RFP、耐INH+RFP+Sm、耐INH+RFP+EMB、耐INH+RFP+Ofx、耐INH+RFP+Sm+EMB、耐INH+RFP+Sm+Ofx、耐INH+RFP+EMB+Ofx、耐INH+RFP+Sm+EMB+Ofx、耐INH+RFP+Sm+EMB+Ofx+Km，其包含的菌株數(shù)分別為23株(45.10%)、4株(7.84%)、4株(7.84%)、2株(3.92%)、5株(9.80%)、1株(1.96%)、6株(11.76%)、5株(9.80%)和1株(1.96%)。

二、基因分型

McSpoligotyping將51株MDR-MTB菌株分為北京和非北京基因型兩大類，其中北京基因型29株(56.86%)，非北京基因型22株(43.14%)。非北京基因型包括T家族(含6株T1、4株T2和1株T4)11株(21.57%, 11/51)、U家族2株(3.92%, 2/51)、MANU家族(MANU2)1株(1.96%, 1/51)和新發(fā)現(xiàn)基因型8株(15.69%, 8/51)。將獲得的基因分型結果與SpolDB 4.0數(shù)據(jù)庫進行比對，有43株被分為18種型別且有對應的系統(tǒng)集成測試(SIT)編碼，典型北京基因型(SIT=1)占所有菌株的37.25%(19/51)，有8株未找到相對應的SIT編碼，為本研究新發(fā)現(xiàn)基因型。見表1。

表1 51株耐多藥結核分枝桿菌McSpoligotyping基因分型結果

續(xù)表1

表2 廣西耐多藥結核分枝桿菌基因型與耐藥情況的相關性

注a：表示采用Fisher確切概率法

三、基因型與耐藥情況相關性

北京基因型和非北京基因型菌株對EMB、Sm、Ofx、Km耐藥情況比較見表2，結果顯示差異均無統(tǒng)計學意義。

討 論

MDR-TB是全球結核病防控的主要威脅，由于其治療效果不佳，耐受性差，且治療費用較高，因此MDR-TB患者，特別是并發(fā)糖尿病和年齡較大者，更有可能導致不良治療結局和死亡[9-10]。關于MDR-TB的相關研究一直以來都是全球關注的熱點。本研究對收集到的MDR-MTB菌株進行了藥敏試驗，結果發(fā)現(xiàn)MDR-MTB對EMB、Sm、Ofx、Km的耐藥率分別為41.18%、31.37%、9.80%和1.96%。對EMB的耐藥率雖低于全國水平(58.7%)[11]，但明顯高于海南省(27.34%)[12]、烏魯木齊市(31.0%)[13]和廣西以往的報道(21.7%)[14]。EMB作為一線抗結核藥品，是初、復治結核病的常規(guī)藥品，其耐藥率的增加勢必會對結核病的治療效果產(chǎn)生影響，因此應加強對EMB耐藥性的監(jiān)測。而對Sm、Ofx、Km的耐藥率低于廣西以往的報道(53.9%、44.2%和5.6%)[14]，也低于海南省(54.69%、51.56%和10.94%)[12]，提示Sm、Ofx和Km對MDR-TB仍有一定的治療價值，但仍需加強對其耐藥性的監(jiān)測。耐藥形式以耐INH和RFP最為多見，與周云等[12]、喻容等[15]研究結果一致，也與以往的報道一致[14]。

北京基因型是多個國家和地區(qū)的優(yōu)勢菌株，導致了MDR-TB的暴發(fā)，一直以來都備受全球關注[16]。本研究采用McSpoligotyping對收集到的51株MDR-MTB菌株進行了基因分型，結果發(fā)現(xiàn)北京基因型占56.86%，略低于以往的報道(58.29%)[17]，低于福建省(67.23%)[16]、河南省(83.53%)[18]和陜西省(86.21%)[19]，而略高于四川省(55.73%)和貴州省(55.13%)[17]，進一步體現(xiàn)了北京基因型的分布具有地區(qū)差異，表明北京基因型是廣西MDR-MTB的主要流行菌株，因此在今后的研究工作中，應加強對該基因型菌株的相關研究，進一步了解其流行和傳播規(guī)律，以便更好地控制MDR-TB的流行。本研究發(fā)現(xiàn)，非北京基因型菌株占43.14%，包括T、U、MANU家族及新發(fā)現(xiàn)基因型，其中T家族所占的比例最大。T家族主要流行于中南美洲地區(qū)，而在本研究中，T家族占非北京基因型的50.00%，這可能與廣西地處中越邊境、西南大通道和東盟橋頭堡等特殊地理位置，對外貿(mào)易頻繁，人口流動性較大有關，提示應加強對流動人口結核病的篩查和管理力度。新發(fā)現(xiàn)基因型菌株占全部菌株的15.69%，有待做進一步的研究。

雖然有資料報道北京基因型與INH、RFP、Ofx等藥品耐藥有關，與MDR呈強相關[2-3]，但一項關于中國南方地區(qū)MTB北京基因型與耐藥相關性的研究結果卻顯示[20]，盡管北京基因型對任一藥品的耐藥率均高于非北京基因型，但除Sm外，其他藥品耐藥與否與是否為北京基因型不相關。本研究發(fā)現(xiàn)北京基因型對EMB、Sm、Ofx、Km的耐藥率均高于非北京基因型，但差異均無統(tǒng)計學意義，與以往的報道一致[17]，也與林淑芳等[16]、Liu等[21]研究結果一致。由此可見，北京基因型與耐藥的相關性存在爭議，這可能是由于地區(qū)差異而引起，也有可能與本研究所收集到的樣本量較少有關。因此下一步應擴大樣本量以發(fā)現(xiàn)廣西北京基因型與耐藥的可能相關性。

綜上所述，廣西MDR-MTB對EMB的耐藥率較高，應加強對該藥品的監(jiān)測，此外還應關注MDR-MTB 對其他藥品的耐藥性。北京基因型為主要流行菌株，與EMB、Sm、Ofx、Km耐藥無統(tǒng)計學關聯(lián)。該結論對廣西MDR-TB的防控措施的制定有一定的指導作用。當然，本研究尚存在不足之處，即未對其他常用藥品(如吡嗪酰胺、左氧氟沙星等)進行藥敏試驗，未能評估北京基因型與其他藥品耐藥的相關性，且由于樣本量較少未能對該地區(qū)MDR-MTB基因型與社會人口學資料(如性別、年齡等)、人口流動性、疾病進展等的相關性進行深入探討，這也將成為下一步的研究工作。