蘭 欣 李 杰 李貴陽 肖 鵬 莫照蘭

發(fā)病鲆鰈類分離菌株的16S rRNA基因測序分析*

蘭 欣1,2李 杰3李貴陽3肖 鵬1莫照蘭3①

(1. 中國科學(xué)院海洋研究所實驗海洋生物學(xué)重點實驗室 青島 266071；2. 中國科學(xué)院大學(xué) 北京 100049； 3. 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部海水養(yǎng)殖病害防治重點實驗室 青島海洋科學(xué)與技術(shù)試點國家實驗室海洋漁業(yè)科學(xué)與食物產(chǎn)出過程功能實驗室 青島 266071)

細菌性疾病是中國海水養(yǎng)殖鲆鰈類的主要病害，為全面了解病原菌種類，本研究對1999~2012年從山東、江蘇、河北、天津等沿海地區(qū)養(yǎng)殖場發(fā)病鲆鰈魚類中分離得到的124株優(yōu)勢菌株進行了16S rRNA基因測序和系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析。將基因序列與GenBank核酸序列數(shù)據(jù)庫進行相似度比對分析，結(jié)果顯示，有83株與弧菌屬(sp.)細菌相似度最高，11株與氣單胞菌屬(sp.)細菌相似度最高，4株與愛德華氏菌屬(sp.)細菌相似度最高，26株為其他15種屬的細菌。根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析結(jié)果，進一步將66株菌鑒定為16個種，優(yōu)勢種為溶藻弧菌()、哈氏弧菌()、鰻弧菌()、殺鮭氣單胞菌()和遲緩愛德華氏菌()。選擇其中的9株鰻弧菌和4株遲緩愛德華氏菌進行人工感染實驗，結(jié)果顯示，其中7株鰻弧菌和3株遲緩愛德華氏菌對大菱鲆()有較強的致病性。研究結(jié)果可為闡明中國海水養(yǎng)殖鲆鰈類的流行病發(fā)生歷史、病原種類、病原監(jiān)測及疾病控制提供重要參考。

鲆鰈類；病原菌；16S rRNA基因；系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析；鑒定

近年來，中國水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展迅速，已成為國民經(jīng)濟的重要組成部分，但隨著養(yǎng)殖規(guī)模的擴大，水產(chǎn)病害也越來越嚴重，成為制約中國水產(chǎn)業(yè)發(fā)展的一個重要因素。據(jù)統(tǒng)計，2017年水產(chǎn)養(yǎng)殖因病害造成的直接經(jīng)濟損失達約361億元，在監(jiān)測到的96種病原中，細菌性疾病種類占了46種(張顯良等, 2018)。中國海水養(yǎng)殖地域范圍分布廣，從遼寧到海南的緯度跨度達23°，同時，養(yǎng)殖品種多，導(dǎo)致不同地區(qū)養(yǎng)殖病害種類復(fù)雜，極大地增加了病害防控的難度。鲆鰈類是中國海水養(yǎng)殖的重要品種，在遼寧、河北、山東、江蘇等多個省份均有養(yǎng)殖。對養(yǎng)殖鲆鰈類進行流行病學(xué)調(diào)查，可為中國水產(chǎn)流行病學(xué)的監(jiān)控提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，并可進一步有針對性地對細菌性病害進行防治，對中國水產(chǎn)事業(yè)的發(fā)展有重要意義。

水產(chǎn)養(yǎng)殖動物的病原主要有細菌、病毒、真菌和寄生蟲四大類。其中，細菌性疾病是魚類中最為常見且是危害最大的一類疾病?，F(xiàn)已報道的海水魚類細菌病原超過40種，包括弧菌()、愛德華氏菌()、氣單胞菌()、假單胞菌()、屈橈桿菌()、巴斯德氏菌()、腎桿菌()、鏈球菌()、分枝桿菌()和諾卡氏菌()等(Austin, 2007; Fryer, 1993)。

目前，16S rRNA基因的高通量測序在環(huán)境細菌組成分析研究中已得到廣泛應(yīng)用，通過提取、擴增和分析水體、魚體表和組織的總DNA，對16S rRNA基因進行擴增、測序和比對，判斷細菌的種類組成，并可獲得大量的非可培養(yǎng)細菌的數(shù)據(jù)。16S rRNA是高度保守的分子，又有中度保守和高度變化的序列區(qū)域，適合于研究進化距離不同的各類原核生物的親緣關(guān)系，目前已廣泛應(yīng)用于細菌的分類研究(東秀珠等, 2001; Borrell, 1997)。但由于病原需要通過柯赫氏法則進行確定，因此，在病原的鑒定過程中，分離培養(yǎng)依舊是不可缺少的一部分。鲆鰈類是中國重要的海水養(yǎng)殖品種，本實驗室自1999年以來，開展了海水養(yǎng)殖鲆鰈類病害調(diào)查，從江蘇、山東、河北、天津等沿海養(yǎng)殖場的發(fā)病魚分離收集菌株。本研究通過分析分離菌株的16S rRNA基因序列，對其進行分類，并對其中的鰻弧菌和遲緩愛德華氏菌進行致病性檢驗，以期對中國海水養(yǎng)殖鲆鰈類的細菌性病原種類有深入的了解，為病害控制提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 菌株來源

本研究所用菌株為1999~2012年從江蘇、山東、河北、天津等沿海地區(qū)海水養(yǎng)殖場發(fā)病鲆鰈類內(nèi)臟分離純化(表1)，用甘油保存于?80℃冰箱中。

1.2 細菌16S rRNA基因序列的PCR擴增和測序

取保存于?80℃冰箱的菌株在胰大豆蛋白胨平板(TSA)劃線，28℃培養(yǎng)24~36 h，挑取單一菌落懸浮于50 μl無菌蒸餾水，在100℃水浴5 min裂解細胞，離心沉淀細胞碎片，取上清液作為細菌DNA模板。以細菌16S rRNA基因通用引物27F(5￠-AGAGTTTGATCCT GGCTCAG-3￠)和1492R(5￠-GGTTACCTT GTTACGAC TT-3￠)進行PCR擴增(Lane, 1991)。50 μl PCR反應(yīng)體系：5 μl 10×buffer，1 μl 2.5 mmol/L dNTPs (Thermo,美國)，3 μl 25 mmol/L MgCl2，10 μmol/L引物各1 μl，酶0.5 μl (Thermo, 美國)，DNA模板2 μl，ddH2O補至50 μl。反應(yīng)程序：95℃5 min；95℃ 1 min，52℃ 1 min，72℃ 1 min 40 s，30個循環(huán)；72℃ 10 min。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，用DNA膠回收試劑盒(上海生工)進行純化，純化產(chǎn)物送上海桑尼生物科技有限公司測序。

1.3 16S rRNA基因序列比對分析

所得序列在GenBank (http://blast.ncbi.nlm.nih. gov/)核酸數(shù)據(jù)庫進行Blast比對分析，根據(jù)序列相似性>95%為同屬細菌，在70%~95%為不同屬細菌(楊霞等, 2008)，初步確定所測細菌在屬水平上的分類地位。采用BioEdit的ClustalW Multiple alignment比對分析，運用Mega5.05以Neighbor-Joining法，重復(fù)1000次計算bootstrap值，Kimura 2-parameter模型構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.4 人工感染實驗

選擇均重約為30 g的健康大菱鲆()，養(yǎng)殖水溫為16℃~18℃，通過肌肉注射方式進行人工感染。選取鑒定為鰻弧菌和遲緩愛德華氏菌的菌株接種于TSB液體培養(yǎng)基，28℃搖床培養(yǎng)12 h。離心收集菌體，用生理鹽水將菌液依次稀釋至106、105、104和103CFU/ml。每個濃度注射10尾魚，每尾注射0.1 ml，對照組注射等體積的滅菌生理鹽水。每天正常飼喂、換水，記錄發(fā)病和死亡情況，對死亡魚及時解剖，并對病原進行分離。同時，平板計數(shù)稀釋液以確定菌液具體濃度。根據(jù)改進的寇氏法(楊茂成, 1990)計算菌株的半數(shù)致死量(50% lethal dose, LD50)。

2 結(jié)果與分析

2.1 細菌16S rRNA基因擴增及序列分析

以引物對27F/1492R進行PCR擴增，獲得1500 bp左右的DNA片段。對純化的DNA片段進行測序，獲得的16S rRNA基因序列提交至GenBank，登錄號見表1。Blast結(jié)果顯示，所得124個16S rRNA基因序列與GenBank核酸數(shù)據(jù)庫序列的最高相似性達99%~100%，可鑒定到屬的地位，其中，弧菌屬(sp.)數(shù)量最多，共分離到83株，占66.9%；其次依次為氣單胞菌屬(sp.) (共11株, 占8.9%)、愛德華氏菌屬(sp.) (4株, 占3.2%)、假交替單胞菌屬(sp.) (3株, 占2.4%)和假單胞菌屬(sp.) (3株, 占2.4%)等(表2)。在1999~2004年，分離到的細菌大部分屬于弧菌屬，占77.3%；在2005年以后，隨著養(yǎng)殖技術(shù)的提高和養(yǎng)殖條件的改善，弧菌的比例逐漸下降，僅占29.6%，氣單胞菌屬和愛德華氏菌屬的菌株逐漸增多，分別占40.7%和11.1%。

根據(jù)在GenBank核酸數(shù)據(jù)庫中進行Blast比對的結(jié)果，并從GenBank選取屬內(nèi)具有代表性的16S rRNA基因序列作為參考序列，與所得序列共同構(gòu)建系統(tǒng)進化樹(圖略)。綜合相似性和系統(tǒng)進化結(jié)果，將66株細菌鑒定到種的水平，其中，15株為溶藻弧菌(占12.1%)，9株為哈氏弧菌(占7.3%)，9株為鰻弧菌(占7.3%)，6株為殺鮭氣單胞菌(占4.8%)，4株為遲緩愛德華氏菌(占3.2%)，以及其他種類的細菌(表3)，其余菌株均須結(jié)合其他方法鑒定到種的水平。

表1 分離菌株16S rRNA基因序列在GenBank核酸數(shù)據(jù)庫BLAST分析

Tab.1 BLAST analysis of 16S rRNA gene sequences in GenBank Nucleotide Database

續(xù)表1

續(xù)表1

表2 分離菌株在屬水平上的分類地位

Tab.2 Classification status of the isolated strains on genus level

表3 分離菌株在種水平上的分類地位

Tab.3 Classification status of the isolated strains on species level

2.2 人工感染實驗和半數(shù)致死量

選取鑒定為鰻弧菌和遲緩愛德華氏菌的菌株對大菱鲆進行人工感染實驗和半數(shù)致死量計算。結(jié)果顯示，在9株鰻弧菌中，7株對大菱鲆具有較強的致病性；在4株遲緩愛德華氏菌中，3株有較強的致病性。細菌的半數(shù)致死量如表4所示，鰻弧菌M3、SMP1和SMQ29對大菱鲆的半數(shù)致死量在105CFU/尾左右，L4、L62、SMP3和SMP4的半數(shù)致死量在106CFU/尾左右，鰻弧菌MHK9和MHK13的半數(shù)致死量都在107CFU/尾以上，屬于非致病性菌株。遲緩愛德華氏菌JN、SMQ34和MHK2對大菱鲆的半數(shù)致死量在103~104CFU/尾，MHK25的半數(shù)致死量超過107CFU/尾，也屬于非致病性菌株。

表4 分離菌株對大菱鲆的半數(shù)致死量

Tab.4 The 50% lethal dose of isolates in turbot

3 討論

本研究采用16S rRNA基因序列測定及比對分析方法，對1999~2012年從發(fā)病海水養(yǎng)殖鲆鰈類中分離到的124株細菌進行了分類地位的分析。結(jié)果表明，分離到的弧菌菌株最多，占66.9%，表明弧菌病仍然是中國鲆鰈類養(yǎng)殖的主要疾病。弧菌廣泛分布于海洋和河口環(huán)境，共發(fā)現(xiàn)有66個種(Garrity, 2004)，其中，對于水生動物危害嚴重的常見種類有鰻弧菌、溶藻弧菌、哈氏弧菌、創(chuàng)傷弧菌、擬態(tài)弧菌()和河弧菌()等。本研究表明，溶藻弧菌、魚腸道弧菌、大菱鲆弧菌、哈氏弧菌和鰻弧菌為江蘇、山東、河北和天津鲆鰈類養(yǎng)殖場發(fā)病魚分離到的優(yōu)勢種。鰻弧菌是鲆鰈類常見的致病菌，本研究共分離到9株鰻弧菌，占分離弧菌的10.84%。另外，還分離到創(chuàng)傷弧菌、河弧菌、燦爛弧菌、費氏弧菌 ()、梅氏弧菌()、美人魚弧菌()、病海魚弧菌()、棲黑?；【?()，這些弧菌感染水產(chǎn)動物并引起疾病的事件在國內(nèi)外均有報道(Austin, 2007; Xie, 2007)。在分離得到的弧菌中，溶藻弧菌、創(chuàng)傷弧菌為食源性致病菌，可引起人類食物中毒(Austin, 2010)，這表明對水產(chǎn)品來源的弧菌監(jiān)測應(yīng)當成為食品安全監(jiān)管的重要內(nèi)容。

氣單胞菌屬的細菌為人魚共患病原，其中，殺鮭氣單胞菌、嗜水氣單胞菌()、維隆氣單胞菌()是引起魚疾病的主要病原(Austin, 2007)。本研究鑒定的11株氣單胞菌，分別為殺鮭氣單胞菌、維隆氣單胞菌和異常嗜糖氣單胞菌 ()。殺鮭氣單胞菌是鮭科魚類的主要病原，引起鮭鱒魚的病害并造成嚴重經(jīng)濟損失(Austin, 2007)，在中國已發(fā)現(xiàn)該病原可感染石鰈()、刺參()等養(yǎng)殖對象(曹成易等, 2009; 楊嘉龍等, 2007; 張曉君等, 2005)；維隆氣單胞菌宿主廣泛，可感染多種淡水養(yǎng)殖魚類(Janda, 2010)，在海水魚類的腸道中也廣泛存在(Herrera, 2006)，在養(yǎng)殖環(huán)境惡化或病原感染的情況下，可能會入侵魚體引起繼發(fā)性感染；異常嗜糖氣單胞菌也在西班牙養(yǎng)殖的歐洲鰻鱺()中有感染報道(Martinez-Murcia, 1992)。

遲緩愛德華氏菌能感染許多動物并引發(fā)愛德華氏菌病，感染的動物包括魚類、兩棲類、爬行類直到哺乳類(Thune, 1993)。多年來，中國北方的重要水產(chǎn)養(yǎng)殖品種如大菱鲆、牙鲆()、半滑舌鰨()等常受到遲緩愛德華氏菌感染，經(jīng)濟損失嚴重(王印庚等, 2007; 李杰等, 2008)，給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成了嚴重影響。目前，遲緩愛德華氏菌是該屬唯一可以感染人的致病菌，給水產(chǎn)食品安全帶來威脅，應(yīng)引起廣泛的重視。

鰻弧菌和遲緩愛德華氏菌是近年來常見的鲆鰈類致病菌，針對這2種病原，對分離得到的菌株進行了大菱鲆感染實驗。在分離到的9株鰻弧菌中，7株對大菱鲆具有較強的致病性；4株遲緩愛德華氏菌中，3株對大菱鲆有較強的致病性。近年來，隨著鲆鰈類養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，疾病種類也不斷增加(李杰等, 2019)。中國鲆鰈類大規(guī)模養(yǎng)殖起源于20世紀90年代，本研究中檢測的菌株大多是實驗室在2000年左右分離(表1)，這表明在規(guī)?；B(yǎng)殖初期，這些病原就開始危害中國的養(yǎng)殖鲆鰈類，在今后的水產(chǎn)養(yǎng)殖疾病預(yù)防中需對其進行特別關(guān)注和重視。

有26株細菌未能鑒定到種的地位，分別為假單胞菌屬、假交替單胞菌屬、冷桿菌屬(sp.)、嗜鹽單胞菌屬(sp.)等15個屬。假單胞菌屬細菌是動植物、人類常見的病原，能引起養(yǎng)殖鲆鰈類的脫鱗癥(Li, 2018)。假交替單胞菌對海洋動物致病性的報道不多，在中國已發(fā)現(xiàn)該屬細菌可引起刺參、七帶石斑魚()疾病 (王印庚等, 2006; 孟慶國等, 2006; 喬遷等, 2010)。其他13個種屬的細菌為水環(huán)境的菌株，對水生動物的致病性尚未有報道，其致病性需要通過進一步的研究來確定。

鲆鰈類的規(guī)模化養(yǎng)殖在中國已有20多年歷史，病害是影響鲆鰈類養(yǎng)殖業(yè)的重要因素，不僅引起魚類死亡造成直接經(jīng)濟損失，而且可能導(dǎo)致藥物濫用引起藥殘超標，造成消費者恐慌，進而影響市場價格。目前，國內(nèi)對養(yǎng)殖魚類的發(fā)病情況報道多集中于個體病例分析，缺乏對產(chǎn)業(yè)病害的整體分析，更缺乏規(guī)模化養(yǎng)殖起步階段的病害情況資料。本研究對實驗室自1999年以來從發(fā)病養(yǎng)殖鲆鰈類中分離的124株菌株進行了鑒定和綜合分析，初步確定了中國養(yǎng)殖鲆鰈類主要流行的細菌性病原，為病害防治、流行病衍化和疫苗開發(fā)提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

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Sequencing and Phylogenetic Analysis of the 16S rRNA Genes of Bacterial Strains Isolated from Diseased Flatfish

LAN Xin1,2, LI Jie3, LI Guiyang3, XIAO Peng1, MO Zhaolan3①

(1. Institution of Oceanology, Chinese Academy of Sciences, Qingdao 266071; 2. Graduate University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049; 3. Yellow Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences; Key Laboratory of Maricultural Organism Disease Control, Ministry of Agriculture and Rural Affairs; Laboratory for Marine Fisheries Science and Food Production Processes, Pilot National Laboratory for Marine Science and Technology (Qingdao), Qingdao 266071)

Flatfish are the major industrial aquaculture marine fish species bred in North China. During the culturing process, members of this species are exposed to infection from a variety of pathogens. Diseases caused by bacterial pathogensare the major cause of harm to cultured flatfish in China. To investigate the bacterial pathogens that affect flatfish, we focused on 124 strains isolated from organs of diseased flatfish in Shandong, Jiangsu, Hebei, Tianjin and other similar places between 1999 and 2012. The 16S rRNA gene of the isolates was sequenced, analyzed using BLAST (GenBank), and subjected to phylogenetic analysis by using Mega 5.05. The results identified 66.90% of isolates as(83 strains), 8.90% as(11 strains), 3.20% as(4 strains), andother 15 genera (26 strains). According to the phylogenetic tree, 66 strains were identified as 16 species; the dominant species were.,.,.,.,.,.,.,., and.. To evaluate the pathogenicity of isolates, the virulence of.and.strains isolated from diseased fish was further determined by experimental infection based on the 50% lethal dose (LD50) in turbot (). The results showed that seven.strains and three.strains were pathogenic to fish. The LD50values were 105.1to 106.8CFU/fish for pathogenic.and 103.4to 104.1CFU/fish for pathogenic.. There were also two strains of.and one strain of.that showed low virulence to turbot, with an LD50higher than 107CFU/fish. The presented results provide significant information to ascertain the bacterial pathogens of flatfish, which is important for establishing strategies for the epidemiology, monitoring, and control of bacterial diseases.

Flatfish; Pathogen; 16S rRNA gene; Phylogenetic analysis; Identification

MO Zhaolan, E-mail: mozl@ysfri.ac.cn

* 國家重點研發(fā)計劃(2018YFC0311300)、中央級公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費專項(2019ZD0706)和鰲山科技創(chuàng)新計劃(2015ASKJ02)共同資助[This work was supported by National Key R&D Program of China(2018YFC0311300), Central Public-Interest Scientific Institution Basal Research Fund (2019ZD0706), and Aoshan Technology Innovation Program (2015ASKJ02)]. 蘭 欣，E-mail: lanxinqd@vip.qq.com

莫照蘭，研究員，E-mail: mozl@ysfri.ac.cn

2019-01-28,

2019-03-19

S943

A

2095-9869(2020)03-0142-09

10.19663/j.issn2095-9869.20190128001

http://www.yykxjz.cn/

蘭欣, 李杰, 李貴陽, 肖鵬, 莫照蘭. 發(fā)病鲆鰈類分離菌株的16S rRNA基因測序分析. 漁業(yè)科學(xué)進展, 2020, 41(3): 142–150

Lan X, Li J, Li GY, Xiao P, Mo ZL. Sequencing and phylogenetic analysis of the 16S rRNA genes of bacterial strains isolated from diseased flatfish. Progress in Fishery Sciences, 2020, 41(3): 142–150

(編輯 馬璀艷)