陳 維 魏守祥 李禹含 潘魯青

櫛孔扇貝消化盲囊亞細胞組分分離與鑒定技術*

陳 維 魏守祥 李禹含 潘魯青①

(中國海洋大學海水養(yǎng)殖教育部重點實驗室 青島 266003)

采用勻漿、差速離心、鏡檢和標志酶測定等方法，研究了櫛孔扇貝()消化盲囊亞細胞組分分離與鑒定技術。結果顯示，經Hoechst 33258染色，在勻漿2 min對照組中，觀察到大量櫛孔扇貝消化盲囊完整細胞，呈圓形或橢圓形，細胞膜完整，熒光強度較高；在勻漿3、4、5 min實驗組中，完整細胞數目逐漸減少，且出現許多形態(tài)較小、熒光強度弱、輪廓模糊的細胞碎片。通過血球計數板法得到的細胞破碎結果與上述染色結果一致，隨著勻漿時間(2~5 min)的增加，細胞破碎率升高，當勻漿時間達到5 min時，細胞破碎率升至94.24%。利用Hoechst 33258染色櫛孔扇貝消化盲囊亞細胞分離組分(S2、C2、C4、S5和C5)，鏡檢發(fā)現，C2組分熒光強度最強，熒光顆粒數目多，而其他組分熒光強度弱，且基本觀察不到熒光顆粒。由此推測，細胞核主要存在于C2組分中；同時，細胞膜(5￠-核苷酸酶)、線粒體(琥珀酸脫氫酶)、細胞質(乳酸脫氫酶)和微粒體(葡萄糖-6-磷酸酶)標志酶活力在其他亞細胞組分中有少量檢出，但它們在S2、C4、S5和C5組分中的的標志酶活性比例較高(分別為63.90%、64.89%、77.82%和67.55%)。由此推測，S2、C2、C4、S5和C5分離組分分別為細胞膜、細胞核、細胞質、線粒體和微粒體。本研究成功構建了櫛孔扇貝消化盲囊亞細胞組分分離與鑒定技術方法，為貝類生理機制研究提供技術支持。

櫛孔扇貝；消化盲囊；亞細胞組分；分離鑒定

細胞是生物體結構和功能的基本單位，由具有一定形態(tài)、在細胞內執(zhí)行特定功能的亞細胞組分構成，包括細胞膜、細胞質、細胞器、細胞核等。亞細胞組分是細胞內生理代謝反應的主要場所，分布著許多重要的生化代謝酶。目前，關于亞細胞組分的生化組成、特定功能和超微結構等研究已成為熱點(趙艷芳等, 2013; 陳揚等, 2017: Jadot, 2017)，而亞細胞組分分離技術則是研究的前提與關鍵，主要的分離方法有超速離心、電泳(Heidrich, 1976; Islinger, 2011)、親和純化(Vitale, 1998; Takemoto, 2002; Merino, 2012)等，其中，超速離心是最常用的亞細胞組分分離技術(賀芳等, 2005)。在哺乳動物中，通過超速離心已能分離出細胞核、細胞膜、細胞質、線粒體、微粒體、溶酶體等多種亞細胞組分。同時，采用標志酶、蛋白質印跡、電鏡觀察等方法，建立了亞細胞組分種類鑒定、純度分析的技術方法(Fleischer, 1974; Cooper, 2010; Lieb, 2010)。王偉等(2012)用超速離心法從新生大鼠()右側大腦皮質組織中分離得到線粒體和胞漿2種亞細胞組分，并通過測定凋亡蛋白Smac、Diablo蛋白在其中的表達，探究大鼠H/I后神經元Smac/Diablo的亞細胞器轉移與神經元凋亡的作用機制；Jiang等(2004)離心分離了大鼠肝臟粗制線粒體、純化線粒體、胞質等亞細胞組分，通過亞細胞蛋白質組學分析，鑒定了共564個蛋白質，又根據物理化學特征和功能對其進行了詳細的生物信息學注釋；Kiri等(2005)通過蔗糖密度梯度離心得到高度富集的牛心臟線粒體，發(fā)現了來自不同年齡牛心臟的線粒體制劑的蛋白質譜存在顯著差異。

目前，貝類亞細胞組分分離技術和功能研究也受到廣泛關注。Keiichi等(2013)從長牡蠣()和日本蜆()組織中離心分離了線粒體、微粒體，通過體外實驗發(fā)現這2種亞細胞組分提取物在岡田酸酰化反應中起到關鍵作用；Livingstone等(1984)分離了紫貽貝()微粒體、線粒體、細胞質等亞細胞組分，但僅在微粒體及線粒體中檢測到混合功能氧化酶(MFO)及苯并[a]芘(BaP)代謝相關酶酶活性；Siebert等(2017)離心分離了牡蠣()鰓和消化盲囊的微粒體、細胞質，也僅在微粒體中檢測到乙氧基脫嘌呤O-脫乙酰酶(EROD)的活性。目前，獲得貝類亞細胞組分的方法仍主要參照哺乳動物亞細胞組分分離方法的研究，通過超速離心能夠獲得細胞核、細胞質、線粒體、微粒體等亞細胞組分中的1~2個組分，但之后極少有開展亞細胞組分種類鑒定及純度分析的研究，因此分離效率低，準確性難以保證。

本研究以櫛孔扇貝()為對象，在已有的哺乳動物和貝類亞細胞組分分離技術的基礎上，依據櫛孔扇貝消化盲囊特有的組織細胞特征，開展組織勻漿液制備和檢驗技術的研究，探究貝類亞細胞組分超速離心分離與鑒定技術，不僅可為貝類亞細胞組分的生理功能研究提供技術支持，也可為貝類亞細胞組分標準化分離技術提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗所用櫛孔扇貝于2018年4月購自山東省青島市嶗山區(qū)沙子口養(yǎng)殖場，殼高為(6.15±0.50) cm。采用青島近海自然海水暫養(yǎng)10 d，溫度為(18±1)℃，海水鹽度為31，pH為8.1，連續(xù)充氣，日換水量為1/2，投喂螺旋藻粉，日投餌量為3 mg/L。

1.2 實驗方法

1.2.1 消化盲囊組織勻漿液的制備 配制勻漿緩沖液，A液：0.02 mol/L Tris、0.15 mol/L KCl、1 mmol/L DTT、0.5 mol/L蔗糖，pH調至7.7，于4℃保存；B液：150 mmol/L MgCl2，于4℃保存；C液：100 mmol/L PMSF，于-20℃保存。

選擇健康、活力強的櫛孔扇貝，解剖并稱取消化盲囊組織2 g，剪碎后，放入預冷的玻璃勻漿器中，加入10 ml A液、100 μl B液和10 μl C液，4℃冰水浴下研磨，經預實驗設置勻漿時間分別為2、3、4、5 min，然后采用醫(yī)用紗布擠壓過濾，濾液放入預冷的15 ml離心管中。

1.2.2 細胞裂解率檢驗 取100 μl過濾液，用勻漿緩沖液A液稀釋10倍。再取100 μl稀釋后的過濾液，加入100 μl 10 μg/ml的Hoechst工作液，混勻，暗處理10 min，之后，取2.5 μl均勻涂片，在熒光顯微鏡(Nikon50i，藍色濾光片，熒光激發(fā)光波長為346~ 352 nm，發(fā)射波長為460~461 nm)下觀察細胞形態(tài)及大小，以勻漿2 min染色結果為對照組，其他勻漿時間與之比較，觀察完整細胞形態(tài)并計數。

吸取2.5 μl上述稀釋的勻漿液，滴于血球計數板上，在熒光顯微鏡光鏡下(10×40 倍)觀察細胞形態(tài)并計數。細胞破碎率公式：破碎率(%)=1-實驗組完整細胞個數/對照組完整細胞個數，當破碎率達90%以上時，視為勻漿質量良好，可用于亞細胞組分的分離實驗。

1.2.3 消化盲囊亞細胞組分的分離 參照Livingstone等(1984)和Song等(2006)的分離方法，并根據預實驗情況對緩沖液和具體離心步驟進行調整和優(yōu)化，所有分離過程溫度均控制在0℃~4℃，具體操作步驟如圖1所示。

圖1 櫛孔扇貝消化盲囊亞細胞組分分離流程

取勻漿質量良好的過濾液10 ml，加入10 μl C液，混勻，于600×g離心1 h，分離上清液S1和沉淀C1。C1中加入0.5 ml D液和4.5 ml E液重懸，重懸液于71000×g離心90 min，分離上清液S2和沉淀C2。S1于12000×g離心45 min，分離獲得上清液S3和沉淀C3，C3加入2 ml勻漿緩沖液重懸，于12000×g離心45 min，分離獲得沉淀C4和上清液S4，S4與S3合并后于100000×g下離心90 min，分離獲得上清液S5和沉淀C5。沉淀C2、C4、C5中加入2 ml儲備緩沖液F液和0.4 g儲備緩沖液G液，懸浮沉淀，置于-80℃保存。

離心步驟中用到的緩沖液配方如下，D液：0.3 mol/L蔗糖溶液、50 mmol/L Tris、1.5 mmol/L MgCl2，pH 7.7；E液：1.98 mol/L蔗糖溶液、50 mmol/L Tris、1.5 mmol/L MgCl2，pH 7.7；F液：20 mmol/L Tris、1 mmol/L DTT，pH 7.7，均在4℃保存；G液：甘油。

1.2.4 細胞核純度及活性檢驗 取S2、C2、C4、S5和C5各100 μl，稀釋10倍后，分別按1.2.2中步驟進行Hoechst染色，在熒光顯微鏡下觀察細胞核形態(tài)和大小。

1.2.5 亞細胞組分標志酶的活性測定 按照Beneking等(1978)，測定細胞膜標志酶5￠-核苷酸酶(5￠-NT)；參照Storrie等(1990)，測定細胞質標志酶乳酸脫氫酶(LDH)；依據Klaassen等(1969)，測定微粒體標志酶葡萄糖-6-磷酸酶(G-6-Pase)；采用南京建成試劑盒，測定線粒體標志酶琥珀酸脫氫酶(SDH)。蛋白質含量的測定按照Bradford(1976)，以牛血清白蛋白(BSA)為標準蛋白。

1.3 數據處理與分析

所有實驗數據均以4個平行組數據的平均值±標準差(Means±SD)表示，采用SPSS 22.0軟件進行單因素方差分析(One-way ANOVA)、差異顯著性分析用Duncan檢驗法，以<0.05表示差異顯著，>0.05表示差異不顯著。

2 結果

2.1 櫛孔扇貝消化盲囊組織細胞勻漿與檢驗技術

由圖2可以看出，Hoechst 33258染色后，在熒光顯微鏡下，消化盲囊組織在勻漿后完整，細胞形態(tài)飽滿，呈圓形或橢圓形，細胞膜完整，熒光強度較強；而破碎細胞形態(tài)較小，熒光強度弱，細胞輪廓模糊。在勻漿2 min對照組中，可以觀察到大量完整的細胞，隨著勻漿時間的增加，完整細胞個數減少，熒光強度弱的顆粒數增加，勻漿5 min實驗組中基本沒有完整細胞的存在。隨著勻漿時間(2~5 min)的增加，櫛孔扇貝消化盲囊組織細胞破碎率升高，以勻漿2 min為對照組，勻漿時間為5 min時，細胞破碎率達到94.24% (表1)。

表1 櫛孔扇貝消化盲囊在不同勻漿時間下細胞破碎率

Tab.1 Broken rate of digestive gland cells of C. farreri at different homogenization time

注：勻漿2 min作為對照組，同一列標有不同上標字母表示差異顯著(<0.05)

Note: 2 min homogenization group was the control group, different superscripts in the same column indicate significant differences (<0.05)

2.2 櫛3孔扇貝消化盲囊組織亞細胞組分的鑒定

將櫛孔扇貝消化盲囊亞細胞分離組分(S2、C2、C4、S5和C5)進行Hoechst 33258染色，在熒光顯微鏡下觀察，C2組分熒光強度最強，視野中熒光顆粒數多，顆粒間粘黏比例低，說明細胞核提純質量較好(圖3)；其他組分熒光強度弱，基本觀察不到熒光顆粒。因此，細胞核主要存在于C2組分中，其他組分中不存在細胞核。

由表2可知，細胞膜(5￠-NT)、線粒體(SDH)、微粒體(G-6-Pase)和細胞質(LDH)標志酶在櫛孔扇貝消化盲囊亞細胞組分(S2、C2、C4、S5和C5)中顯示有不同的分布，其中，5￠-NT、SDH、LDH和G-6-Pase分別在S2、C4、S5和C5組分中占有高比例(63.90%、64.89%、77.82%和67.55%)的標志酶活性(圖4)，由此推測，S2、C4、S5和C5分離組分分別為細胞膜、細胞質、線粒體和微粒體。雖然4種亞細胞組分標志酶在C2中均有微量檢出，但結合細胞核Hoechst 33258染色結果，確定為細胞核。綜合標志酶檢測和Hoechst 33258染色細胞核的結果，本實驗得到的S2、C2、C4、S5和C5分別為細胞膜、細胞核、線粒體、細胞質和微粒體。

3 討論

3.1 貝類組織細胞勻漿方法

動物組織細胞勻漿質量直接關系到亞細胞組分的充分釋放和完整程度，實驗材料處理方法、勻漿方法和勻漿介質等是影響組織勻漿質量的重要因素。新鮮動物肝臟是亞細胞組分分離的最佳材料(Mootha, 2003; Kikuchi, 2004; Li, 2004; Bagshaw, 2005)，但有時因為實驗條件限制，低溫冷凍的實驗材料也被用來離心分離亞細胞組分(Hoffmann, 2005)。Song等(2006)研究顯示，小鼠()冷凍肝臟制備的亞細胞組分回收率顯著低于新鮮肝臟組和冷凍均質肝臟組。Nielsen等(2005)研究顯示，冷凍處理導致細胞核破碎釋放DNA，會引起其他膜系細胞器的聚集，不利于細胞膜和其他亞細胞組分的分離。因此，不建議冷凍肝臟用于亞細胞組分分離研究。此外，還應根據待均質化的組織類型和實驗的具體目的，合理選擇玻璃勻漿、過濾、研磨、超聲處理、酶溶解等勻漿方法。本研究以新鮮櫛孔扇貝消化盲囊組織作為實驗材料，采用玻璃勻漿法研磨組織細胞，整個勻漿、分離過程嚴格控制實驗溫度在0℃~4℃，亞細胞組分分離效果好、損傷小。

圖2 在不同勻漿時間下的櫛孔扇貝消化盲囊細胞Hoechst 33258染色

圖3 櫛孔扇貝消化盲囊亞細胞組分的Hoechst 33258染色

A: S2; B: C2; C: C4; D: S5; E: C5

表2 櫛孔扇貝消化盲囊亞細胞組分標志酶分布

Tab.2 Distribution of marker enzymes in subcellular fractions of digestive glands of C. farreri

注：同一行中標有不同上標字母表示差異性顯著(<0.05)

Note: Different superscripts in the same line indicate significant differences (<0.05)

圖4 櫛孔扇貝消化盲囊的5種亞細胞組分中標志酶活性比例

以櫛孔扇貝消化盲囊亞細胞各分離組分(S2、C2、C4、S5和C5)標記酶活性總和為參照，計算各分離組分所占標記酶活性的比例。同一顏色柱子標有不同上標字母表示差異顯著(<0.05)

The total activity of marker enzymes in subcellular fractions (S2, C2, C4, S5, and C5) of digestive glandsofwas used as a reference to calculated the proportions of the marker enzymes activity in each isolated fraction. Different letters in the column of the same color indicate significant differences (<0.05)

動物組織勻漿介質的選擇和制備要考慮滲透壓、pH、蛋白質保護劑等條件，這對于亞細胞組分的分離及完整性至關重要。已有研究表明，在蔗糖溶液中加入低濃度的Ca2+或Mg2+可防止細胞核團簇(Anderson, 1951; Hogeboom, 1952)，但Ca2+、Mg2+的存在對線粒體的功能有害(Graham, 2006)；因而，在勻漿緩沖液中加入100 mmol/L KCl，或在細胞核分離步驟完成后，往上清液中加入EDTA，可平衡Ca2+、Mg2+等引起的核粘連以及核和其他碎片粘連(費一楠等, 2007)。本研究中，櫛孔扇貝消化盲囊組織細胞勻漿緩沖液已經過預實驗優(yōu)化，結果顯示，勻漿液中不加細胞核穩(wěn)定劑MgCl2，會發(fā)生細胞核大面積團簇現象，而加入MgCl2的實驗組，得到的細胞核分散、形態(tài)清晰、個體完整，這與上述一些研究結果類似。與Livingstone等(1984)在紫貽貝上和Siebert等(2017)在牡蠣上所用勻漿緩沖液相比，其優(yōu)點在于能更好地保護膜蛋白，且協調了MgCl2能減少細胞核破裂、結塊的優(yōu)點和影響其他細胞器功能缺點之間的矛盾。

3.2 貝類組織細胞勻漿破碎率檢驗方法

目前，動物組織細胞勻漿破碎率大多利用形態(tài)學手段如臺盼藍染色(Lepvrier, 2017)、相差顯微鏡觀察(Huber, 2003)等方法檢驗，通過測定完整細胞的數量和觀察細胞核的聚集情況，來評估均質化的質量，但這些方法存在觀察結果模糊、對比不明顯等缺點。Hoechst 33258是一種毒性較低的藍色熒光染料，因其能穿透細胞膜與核酸結合，常用于細胞凋亡檢測和活細胞標記(謝興文等, 2012; 吳彪等, 2013; 王凈等, 2015)。本研究利用Hoechst 33258染色的特性，通過該方法觀察不同勻漿時間里的完整細胞數量，結果顯示，經玻璃勻漿5 min時完整細胞數目最少，勻漿效果較好。同時，將Hoechst 33258染色結果與血球計數板計數結果進行比較，驗證了Hoechst 33258染色法檢驗勻漿破碎率的可行性。由此，建立了櫛孔扇貝(貝類)消化盲囊組織細胞勻漿破碎率Hoechst 33258染色檢驗方法。

3.3 貝類組織亞細胞組分鑒定與純度分析

亞細胞組分分離技術在過去的幾十年中得到了很大完善，同時，也發(fā)展出了一系列提純亞細胞組分的方法，如重復洗滌、密度梯度離心或其他蛋白質純化程序(Pasquali, 1999)，但要得到純凈的亞細胞組分仍然是現在細胞生物學中很難實現的目標。提純亞細胞組分的每一步操作都以損失亞細胞組分的活性為代價，因此，分離純化亞細胞組分的純度只要達到實驗要求即可。

標志酶、蛋白質印跡、電鏡觀察等方法是常用的動物組織細胞亞細胞組分鑒定與純度分析方法(Fleischer, 1974; Cooper, 2010; Lieb, 2010)，其中，標志酶法通過檢測各個亞細胞分離組分的標志酶活性大小和酶活性貢獻比率，獲得亞細胞組分純度和分布信息(Andreyev, 2010)，如某一目標亞細胞組分中檢測到有對應的標記酶以外的其他標志酶活性，則表明存在其他亞細胞組分，通過計算標記酶的酶活性貢獻比率，可以得到亞細胞組分富集和分布情況。Siebert等(2017)未對牡蠣消化盲囊組織離心得到的微粒體和細胞質進行鑒定和純度分析，難以保證實驗精確性；Livingstone等(1984)利用琥珀酸脫氫酶(SDH)、葡萄糖-6-磷酸酶(G6PASE)、丙酮酸激酶(PK)對紫貽貝消化盲囊線粒體、細胞質、微粒體進行鑒定，且用標志酶活性大小表示它們的富集情況，結果顯示，G6PASE酶活性在分離得到的其他幾個組分中都有較高的檢出，微粒體富集程度不理想。

本研究通過5￠-核苷酸酶、琥珀酸脫氫酶、乳酸脫氫酶和葡萄糖-6-磷酸酶鑒定了細胞膜、線粒體、細胞質、微粒體4種亞細胞組分的種類，且通過標志酶活力大小和酶活性貢獻比率顯示4種標志酶分別在S2、C4、S5和C5組分中占有高比例(63.90%、64.89%、77.82%和67.55%)的標志酶活性。由此確定，S2、C2、C4、S5和C5組分分別為細胞膜、細胞核、細胞質、線粒體和微粒體。另外，本研究將分離組分(S2、C2、C4、S5和C5)用Hoechst 33258染色，鏡檢發(fā)現，C2組分熒光強度最強，熒光顆粒數目多，其他組分熒光強度微弱，熒光顆粒數目稀少，由此推出細胞核存在于C2組分中。由此說明，本研究不僅分離、鑒定出5個櫛孔扇貝消化盲囊組織亞細胞組分，還獲得了活性良好的細胞核，充分證明本研究建立的櫛孔扇貝組織細胞亞細胞組分分離、鑒定方法是可行的，對于貝類組織細胞亞細胞組分分離鑒定和生理機制研究具有重要意義。

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Isolation and Identification of Subcellular Fractions from Digestive Glands of

CHEN Wei, WEI Shouxiang, LI Yuhan, PAN Luqing①

(Key Laboratory of Mariculture, Ministry of Education, Ocean University of China, Qingdao 266003)

In this study, homogenization, centrifugation, microscopy, and marker enzyme assays were used to study the separation and identification techniques for subcellular fractions of the digestive gland tissuesof. The results showed that after Hoechst 33258 staining, a large number of intact cells, which were round or elliptical, with complete cell membrane and high fluorescence intensity, were observed in the 2 min homogenization group. In the 3, 4, and 5 min homogenization group, the number of intact cells gradually decreased, and many cell fragments with small morphology, weak fluorescence, and blurred outline appeared. Additionally, the blood cell counting results were consistent with the Hoechst staining results. With the increase in homogenization time (2~5 min), the broken cell rate was increased under an optical microscope and when the 2 min homogenization group was used as the control group, the broken cell rate reached 94.24% in the 5 min homogenization group. There were more fluorescent particles in C2 with appropriate size, and clear structure, and fewer fluorescent particles were observed in other separated fractions, when fractions (S2, C2, C4, S5, and C5) of the digestive gland tissuesofwere stained with Hoechst 33258. Therefore, the nucleus mainly presented in the C2 fraction. At the same time, the marker enzyme activity of the cell membrane (5?-nucleotidase), mitochondria (succinate dehydrogenase), cytoplasmic (lactate dehydrogenase), and microsomes (glucose-6-phosphatase) accounted for a high proportion (63.90%, 64.89%, 77.82%, and 67.55%) in the S2, C4, S5, and C5 fractions, respectively; however, there were also a small amount found in other subcellular fractions. As a result, the separated fractions of S2, C2, C4, S5, and C5 were cell membrane, nucleus, mitochondria, cytoplasm, and microsomes, respectively, and the technical methods for separation and identification of subcellular fractions of the digestive gland tissuesofwere successfully determined.

; Digestive glands tissues; Subcellular fractions; Isolation and identification

PAN Luqing, E-mail: panlq@ouc.edu.cn

10.19663/j.issn2095-9869.20190214001

http://www.yykxjz.cn/

陳維, 魏守祥, 李禹含, 潘魯青. 櫛孔扇貝消化盲囊亞細胞組分分離與鑒定技術. 漁業(yè)科學進展, 2020, 41(3): 111–118

Chen W, Wei SX, Li YH, Pan LQ. Isolation and identification of subcellular fractions from digestive glands of. Progress in Fishery Sciences, 2020, 41(3): 111–118

* 山東省2018年重點研發(fā)計劃(公益性科技攻關類)(2018GHY115007)資助[This work was supported by Shandong Province 2018 Key Research and Development Plan (Public Welfare Science and Technology Research) (2018GHY115007)]. 陳 維，E-mail: 2209236262@qq.com

潘魯青，教授，E-mail: panlq@ouc.edu.cn

2019-02-14,

2019-03-04

S917.4

A

2095-9869(2020)03-0111-08

(編輯 馬璀艷)