趙登超 王成忠 賈明* 孫銳*

(1齊魯工業(yè)大學（山東省科學院）食品科學與工程學院，濟南 250353；2山東省林業(yè)科學研究院經(jīng)濟林研究所，濟南250014)

樹莓(Raspberry)，是享有“黃金水果”之稱的第3代保健水果，薔薇科(Rosaceae)薔薇亞科(Rosoideae Focke)懸鉤子屬(Rubus L.)，多年生落葉灌木果樹，廣泛分布于北溫帶、亞熱帶，我國黑龍江、遼寧、河南、江蘇、山東等多個省份均有栽培。

樹莓果口感獨特，富含花青素、鞣花酸和黃酮類物質(zhì)、水楊酸、抗壞血酸和樹莓苷等多種功能性成分[1]，具有抗菌、抗癌、抗炎、抗氧化、增強免疫力、預(yù)防疾病和保持人體健康等多種生物學作用[2-5]，但不耐儲運。將新鮮樹莓發(fā)酵制成樹莓酒，可保留其營養(yǎng)成分和生物活性物質(zhì)，適當延長保存時間。據(jù)文獻報道，樹莓酒有一定的輔助降血脂功效[6]。此外，發(fā)酵制成的樹莓酒中還保留有鉀、鈣、鈉、鎂等大量元素及鋅、鐵、錫、銅等微量元素[7]。隨著人民生活水平的提高，口感更佳、具有營養(yǎng)保健功能的發(fā)酵型果酒，在我國將具有廣闊的消費市場和發(fā)展前景[8-9]。

目前市售樹莓果酒酸度略高，口感體驗受到一定影響。為進一步優(yōu)化樹莓酒品質(zhì)，本試驗研究了酵母菌種、接種量、環(huán)境溫度、發(fā)酵時間、pH值等多個發(fā)酵過程的關(guān)鍵因素，以發(fā)酵液的酒精度、還原糖、總酸為評價指標，分析探究樹莓果酒發(fā)酵的最佳工藝條件，旨在得到最優(yōu)的樹莓果酒釀造條件，為樹莓酒的大規(guī)模生產(chǎn)提供一定的參考價值。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 原料與試劑

樹莓果采自河南新鄉(xiāng)樹莓種植基地。菌種：葡萄酒酵母（D254、EC1118、FX10、KD、71B、K1、ST），購于煙臺帝伯仕、樂晗商貿(mào)公司。試劑：葡萄糖、3,5-二硝基水楊酸、氯化氫、氫氧化鈉、酚酞（德州曼巴）；碘、碘化鉀（山東德彥），以上試劑均為分析純。

1.1.2 儀器與設(shè)備

JYL-Y8PLUS打漿機（山東九陽）；JW—1032離心機（安徽嘉文）；DSX-280KB30高壓滅菌鍋（上海申安）；722s分光光度計（上海儀電）；SPX-250B-Z恒溫培養(yǎng)箱（上海博田）；LCD-A500分析天平（福州華志）；YP10002電子天平（上海光正）；PHS-3C pH計（上海儀電）；酒精計（武強縣勝啟儀表廠）。

1.2 研究方法

1.2.1 樹莓酒發(fā)酵工藝優(yōu)化方法

1.2.1.1 適宜酵母的篩選 分別取7種不同葡萄酒酵母1 g接入100 mL純凈水中，30℃活化30 min，取4 mL活化后的酵母液分別接入pH值4.0、糖度20°Brix的200 g樹莓汁中，38℃下發(fā)酵6 d。測定發(fā)酵液酒精度、殘?zhí)橇俊⒖偹?，篩選最適酵母菌種。

1.2.1.2 適宜接種量的篩選 取71B酵母活化液接入pH值4.0、糖度20°Brix的200 g樹莓汁中，接種量分別為0.10 mg/mL、0.20 mg/mL、0.30 mg/mL、0.40 mg/mL 和 0.50 mg/mL，38 ℃下發(fā)酵6 d。測定發(fā)酵液的酒精度、酸度和殘?zhí)橇?，確定最適接種量。

1.2.1.3 發(fā)酵溫度對酒精發(fā)酵的影響 取0.20 mg/mL的71B酵母活化接入pH值 4.0、糖度20°Brix的200 g樹莓汁中，不同溫度條件下發(fā)酵6 d，溫度分別設(shè)為27℃、30℃、33℃、36℃和39℃。測定發(fā)酵液的酒精度、酸度和殘?zhí)橇?，確定最適發(fā)酵溫度。

1.2.1.4 發(fā)酵pH值對酒精發(fā)酵的影響 取0.20 mg/mL的71B酵母活化液接入不同pH值、糖度20°Brix的200 g樹莓汁中，pH值分別設(shè)為 3.0、4.0、5.0、6.0 和 7.0，38 ℃下發(fā)酵 6 d。測定發(fā)酵液的酒精度、酸度及殘?zhí)橇?，確定最適pH值。

1.2.1.5 發(fā)酵時間對酒精發(fā)酵的影響 取0.20 mg/mL的71B酵母活化液接入pH值4.00、糖度 20°Brix的 200 g樹莓汁中，38℃下分別培養(yǎng) 2 d、4 d、6 d、8 d 和 10 d。發(fā)酵結(jié)束時測定發(fā)酵液的酒精度、酸度和殘?zhí)橇?，確定適宜的發(fā)酵時間。

1.2.1.6 發(fā)酵期間酒精度與還原糖的變化 取0.20 mg/mL的71B酵母活化液接入pH值4.0、糖度20°Brix的200 g樹莓汁中，在38℃下發(fā)酵6 d。每1 d取樣檢測，記錄1～6 d的酒精含量及還原糖的變化。

1.2.2 理化分析檢測方法

還原糖(以葡萄糖計)測定：3,5-二硝基水楊酸比色法[10]；酒精度測定：GB/T15038-2006酒精計法[11]；總酸(以乙酸計)的測定：電位滴定法[12]；pH值測定：pH計法。

1.2.3 統(tǒng)計分析

單個因素3次平行試驗，計算試驗結(jié)果平均值與標準差，利用SPSS 23統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理，采用單因素方差分析，顯著性水平P＜0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 最適酵母菌種篩選

添加不同酵母菌種發(fā)酵后總酸、酒精度、殘?zhí)橇康膶Ρ冉Y(jié)果見表1。酵母菌種是影響果酒發(fā)酵過程的重要因素之一，不同酵母菌種對還原糖的利用率不同導致其發(fā)酵能力、發(fā)酵速率及產(chǎn)香能力有較大的差異，從而影響果酒品質(zhì)[13]。由表1可看出，酵母菌種71B發(fā)酵所得酒精度（9.73%）、還原糖含量（0.35 mg/mL）居中，總酸最低，僅為8.11 g/L，為獲得最終酸度較低的樹莓酒，71B作為下一步試驗的菌種。

表1 不同酵母菌酒精發(fā)酵的成分比較

2.2 最適接種量選擇

酵母菌接種量對樹莓酒發(fā)酵成分含量的影響見圖1。接種量不足會導致發(fā)酵時間過長，過高會導致發(fā)酵液中氧含量不足[14]，適宜接種量可縮短發(fā)酵時間、降低樣品污染幾率。

由圖1可知，隨著酵母接種量的變化，總酸含量曲線波動不大，酵母接種量對總酸含量的影響不明顯。酒精度隨接種量的增加呈先升高后降低的趨勢，原因在于接種量較低時，酵母菌生長代謝速度較慢，酒精發(fā)酵速度低；接種量過高會導致酵母菌生長速度過快、競爭激烈，產(chǎn)生代謝廢物破壞酵母菌生存環(huán)境，不利于酒精的產(chǎn)生；與高辰哲等[15]研究紅樹莓酒發(fā)酵工藝的發(fā)現(xiàn)相似。還原糖含量隨著接種量增加而逐漸降低，這是由于接種量增加、酵母菌的生長代謝速率隨之升高，還原糖消耗速度增加。綜合考慮還原糖含量和酒精度轉(zhuǎn)化率，選擇0.2 mg/mL為最適接種量。

2.3 適宜發(fā)酵溫度的選擇

適宜溫度范圍內(nèi)溫度越高發(fā)酵時間越短，溫度過高不利于酵母活性[16-17]。本次試驗選取27～39℃，3℃為梯度，探究溫度對樹莓酒發(fā)酵的影響。發(fā)酵后樹莓酒各成分含量變化見圖2。

由圖2可知，隨溫度升高，酵母菌活力提升、生長繁殖速度加快，產(chǎn)酸能力增強[18]，導致總酸含量隨之升高；以30℃為臨界值，還原糖最低(0.25 mg/mL)，酒精含量最高(10.17%，V/V)。低于30℃時，酒精含量隨溫度上升而升高，高于30℃時，酒精度隨溫度的上升而下降，發(fā)酵溫度39℃時酒精度僅為7.82%，V/V，其原因是酵母菌在較低溫度條件下生長速度慢，酒精轉(zhuǎn)化效率低，溫度過高時，酵母菌衰老速度快、代謝能力不足，不利于還原糖轉(zhuǎn)化為酒精[19]。因此選擇總酸含量偏低、酒精轉(zhuǎn)化率高的30℃為樹莓酒的最適發(fā)酵溫度。

2.4 適宜發(fā)酵時間的選擇

發(fā)酵過程中總酸、還原糖、酒精度等成分含量變化見圖3。由圖3可知，隨發(fā)酵時間延長，還原糖含量呈現(xiàn)降低趨勢，6 d后趨于平緩，說明還原糖不斷被消耗轉(zhuǎn)化為酒精，酒精度先升高后降低，發(fā)酵第6 d酒精含量最高(10.1%，V/V)，總酸含量較低(8.18 g/L)，之后酒精度逐漸降低。這是由于發(fā)酵時間延長，酵母數(shù)量達到一定程度，代謝廢物積累，不利于酵母生長，酵母菌衰老死亡，雜菌滋生，消耗酒精而使酒精度下降[20-21]。為確保酵母產(chǎn)生足夠量酒精，避免發(fā)酵時間過長導致醋酸發(fā)酵使酒精含量下降[22]，選擇6 d為樹莓酒發(fā)酵最佳時間。

2.5 不同pH值對酒精發(fā)酵的影響

不同pH值對發(fā)酵過程中總酸、還原糖、酒精成分含量的影響見圖4。

由圖4可知，pH值＜4.0時，酸度過高，影響酵母活性，抑制發(fā)酵過程，發(fā)酵效果差；pH值為4.0時，酒精含量最高，達10.23%，V/V，還原糖最低(0.27 mg/mL)，酵母發(fā)酵效率最高。隨pH值升高，發(fā)酵液易感染雜菌，且酸度抑制發(fā)酵過程，還原糖不降反升，酒精度、酸度均呈降低趨勢[23]，故最適宜pH值為4.0。

2.6 最佳條件發(fā)酵酒精度及時間的變化

依據(jù)之前試驗所得數(shù)據(jù)確定最佳發(fā)酵條件進行發(fā)酵。每1 d取樣檢測，記錄酒精含量與還原糖變化，結(jié)果見圖5。由圖5可知，前2 d酒精發(fā)酵速度較快，第2 d時酒精度為6.93%，V/V，從第3 d起酒精度上升速度、還原糖消耗速度均有所減緩，第6 d時酒精含量達10.31%，V/V，還原糖降至0.24 mg/mL，總酸度平穩(wěn)，約為8.12 g/L。

3 結(jié)論

通過單因素試驗優(yōu)化樹莓酒的發(fā)酵條件，得出樹莓酒酒精發(fā)酵的最佳工藝條件為：酵母菌種71B、接種量0.2 mg/mL、溫度30℃、初始pH值為4.0、發(fā)酵時間6 d。該條件下所得樹莓酒酒精含量可達10.31%，V/V，酸度約8.12 g/L，產(chǎn)品酸度較低，口感溫和，品質(zhì)優(yōu)良。