吳莉敏，陳 茜，趙 艷，吳莉娜，馮曉珊，沈夢(mèng)丹，馬文娟，孫艷萍

(西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院a.婦產(chǎn)科； b.手術(shù)室，西安710004)

卵巢癌是一種常見(jiàn)的婦科惡性腫瘤，其發(fā)病率僅次于子宮頸癌與子宮體癌，但其死亡率在婦科腫瘤中位居首位且有逐年升高趨勢(shì)[1]。卵巢癌對(duì)女性健康形成嚴(yán)重威脅，關(guān)鍵原因之一在于早期卵巢癌無(wú)法通過(guò)有效的標(biāo)記物進(jìn)行鑒定和甄別。因此，篩選有效的卵巢癌生物標(biāo)記物與治療靶點(diǎn)尤為重要。

催產(chǎn)素(oxytocin,OXT)是一種腦垂體后葉分泌的激素，能夠調(diào)控子宮收縮[2]。OXT可以通過(guò)激活催產(chǎn)素受體(oxytocin receptor,OXTR)調(diào)節(jié)前列腺癌[3]、乳腺癌、神經(jīng)胚細(xì)胞瘤等多種腫瘤細(xì)胞的增殖[4]。最新研究發(fā)現(xiàn)，OXT可以抑制卵巢癌細(xì)胞的體外增殖和遷移，并促進(jìn)其凋亡和自噬[5]，但OXT在卵巢癌細(xì)胞中的作用機(jī)制尚不清楚。

微小RNA(miRNA)在哺乳動(dòng)物中是一類長(zhǎng)度為20～25nt的非編碼RNA，在多種腫瘤進(jìn)程中發(fā)揮關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用[6]。miRNA介導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲、遷移及血管生成，在多種腫瘤發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用[7]。據(jù)報(bào)道[8-9]，miR-196b是一種關(guān)鍵的促癌miRNA，其在卵巢上皮癌中表達(dá)上調(diào)并可以促進(jìn)細(xì)胞的侵襲性。miR-196b-3p作為miR-196b前體的3’端降解物，在復(fù)發(fā)性卵巢上皮癌中表達(dá)顯著升高[9]。此外，miR-196b-3p可促進(jìn)小鼠體內(nèi)和體外前列腺癌細(xì)胞增殖[10]，而前列腺癌細(xì)胞的遷移又受到OXT的調(diào)節(jié)[11]。另有研究[12]表明，miR-196b-3p在子宮肌層中被OXT獨(dú)立抑制。然而，在卵巢癌細(xì)胞中，miR-196b-3p是否參與OXT介導(dǎo)的抑癌作用尚不明確，有必要進(jìn)行深入探討。

本研究旨在探討OXT是否通過(guò)激活OXTR介導(dǎo)了卵巢癌細(xì)胞的增殖與凋亡，并進(jìn)一步明確OXT發(fā)揮作用的分子機(jī)制。結(jié)果表明，OXT是通過(guò)激活OXTR下調(diào)了miR-196b-3p水平，并進(jìn)一步上調(diào)其靶基因p53凋亡刺激蛋白2(apoptosis-stimulating of p53 protein 2，ASPP2)的表達(dá)來(lái)抑制卵巢癌細(xì)胞的增殖和凋亡[13]。因此，miR-196b-3p/ASPP2信號(hào)通路可能是OXT調(diào)節(jié)卵巢癌細(xì)胞增殖和凋亡的關(guān)鍵途徑。

1 材料與方法

1.1 一般資料

人卵巢癌細(xì)胞系SKOV3和A2780細(xì)胞來(lái)源于美國(guó)模式培養(yǎng)物保藏所(ATCC)，均于2017年7月購(gòu)買于美國(guó)Sigma公司。

1.2 材料

10%的胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS，10099-141)購(gòu)自美國(guó)Gibco BRL公司；3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽細(xì)胞代謝活性檢測(cè)(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium，MTT)法細(xì)胞增殖活性檢測(cè)試劑盒(4890-025-K)購(gòu)自美國(guó)Trevigen公司；Caspase 3活性檢測(cè)試劑盒(C1115)購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；OXTR活性酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)檢測(cè)試劑盒(CSB-E13371h)購(gòu)自上海希美生物科技有限公司；miR-196b-3p擬似物mimic(miR-mimic)與其陰性對(duì)照miR-mimic-NC及miR-196b-3p抑制劑inhibitor(miR-inhibitor)與其陰性對(duì)照miR-inhibitor-NC均購(gòu)自上海吉瑪公司；TRIzol(15596026)及M-MLV逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(C28025-011)購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；miScript逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(218061)購(gòu)自德國(guó)Qiagen公司；SYBR?Green Master Mix(HY-K0501)購(gòu)自美國(guó)MedChemExpress公司；BCA蛋白分析試劑盒(P0012)與ECL發(fā)光液(P0018)購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；硝酸纖維膜由美國(guó)Bio-Rad公司提供；一抗為兔抗-Ki67(ab16667)、兔抗-增殖細(xì)胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)(ab29)、兔抗-p53凋亡刺激蛋白抑制劑(inhibitor of apoptosis-stimulating of p53 protein，iASPP)(ab34898)、兔抗-p53凋亡刺激蛋白1(apoptosis-stimulating of p53 protein 1，ASPP1)(ab51831)、兔抗-ASPP2(ab181377)、兔抗-甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)(ab170904)，二抗為山羊抗兔IgG 辣根過(guò)氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)IgG(ab97064)購(gòu)自美國(guó)Abcam公司。DNA酶Ⅰ(Dnase Ⅰ，10104159001)與完全蛋白酶抑制劑(11583794001)購(gòu)自美國(guó)羅氏集團(tuán)。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)與OXT處理

SKOV3和A2780細(xì)胞均使用含有10%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)于細(xì)胞培養(yǎng)箱(37 ℃，5%CO2)。所有細(xì)胞每2～3 d換液1次，待細(xì)胞融合率達(dá)到80%時(shí)按照1:3比例傳代。A2780細(xì)胞用于miR-196b-3p水平變化的檢測(cè)。

收集細(xì)胞，采用96孔板，調(diào)整SKOV3或A2780細(xì)胞密度為5×103孔-1進(jìn)行接種。細(xì)胞處理及分組：OXT組，細(xì)胞以100 nM OXT處理12 h[14]；Atosiban+OXT組，細(xì)胞以100 nM OXT聯(lián)合100 nM OXTR拮抗劑Atosiban處理12 h[15]；control組，細(xì)胞未經(jīng)OXT或Atosiban處理。使用OXTR活性ELISA檢測(cè)試劑盒檢測(cè)SKOV3細(xì)胞中OXTR的激活狀況。control組：無(wú)處理的SKOV3細(xì)胞組；OXT組：100 nM OXT處理SKOV3細(xì)胞12 h；OXT+miR-mimic-NC組：miR-mimic-NC 轉(zhuǎn)染細(xì)胞24 h后繼續(xù)使用100 nM OXT處理SKOV3細(xì)胞12 h；OXT+miR-mimic組：miR-mimic轉(zhuǎn)染細(xì)胞24 h后繼續(xù)使用100 nM OXT處理SKOV3細(xì)胞12 h。

通過(guò)Targetscan及Targets and Expression生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)凋亡相關(guān)蛋白ASPP2可能是miR-196b-3p的靶基因。為了證實(shí)這一預(yù)測(cè)，對(duì)SKOV3細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-196b-3p mimic或miR-196b-3p inhibitor，24 h后檢測(cè)各組miR-196b-3p的表達(dá)變化。

1.3.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

按照上海生工生物有限公司提供的說(shuō)明書(shū)并參考LIU等[16]的研究，分別將miR-196b-3p-mimic(miR-mimic組)和miR-196b-3p-mimic(miR-mimic-NC組)轉(zhuǎn)染至SKOV3細(xì)胞中24 h。OXT與miR-mimic共處理細(xì)胞：miR-mimic轉(zhuǎn)染SKOV3細(xì)胞24 h繼續(xù)使用OXT處理12 h(OXT+miR-mimic組)，陰性對(duì)照組為miR-mimic-NC轉(zhuǎn)染入SKOV3細(xì)胞24 h后再使用OXT處理12 h(OXT+miR-mimic-NC組)。

1.3.3 SKOV3細(xì)胞增殖活性檢測(cè)

采用MTT法。將待檢測(cè)各組細(xì)胞的密度調(diào)整為5×103，并接種于96孔板，MTT(終質(zhì)量濃度5 mg·mL-1)37 ℃孵育SKOV3 4 h，棄上清液后加入二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)。使用酶標(biāo)儀檢測(cè)A490 nm處的吸光度值(OD)，計(jì)算細(xì)胞成活率。細(xì)胞存活率=(處理組OD值-空白對(duì)照組OD值)/(對(duì)照組OD值-空白對(duì)照組OD值)×100%。處理組即為對(duì)細(xì)胞各種處理的組。

1.3.4 SKOV3細(xì)胞的Caspase3活性檢測(cè)

首先將待檢測(cè)各組細(xì)胞的密度調(diào)整為5×103，離心棄掉上清液，使用PBS洗滌2次，加入100 μL裂解緩沖液，冰上放置15 min，渦旋振蕩15 s，離心5 min。取10 μL蛋白上清液，加入到90 μL Caspase3活性檢測(cè)液，加入10 μL Ac-LEHD-pNA，避光反應(yīng)1～2 h后檢測(cè)結(jié)果。

1.3.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)

分別收集control、OXT或Atosiban+OXT處理下的SKOV3與A2780的細(xì)胞，TRIzol法抽提細(xì)胞總RNA，M-MLV逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，miRNA逆轉(zhuǎn)錄使用miScript逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成。cDNA特定RNA產(chǎn)物的產(chǎn)量檢測(cè)使用SYBR Green Master Mix、RUN6(miRNA)為內(nèi)參對(duì)miR-196b-3p的表達(dá)量進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理。反應(yīng)體系(20 μL)：10 μL SYBR，2.0 ng模板cDNA，正反向引物濃度均為20 μM，體積為0.8 μL，最終使用滅菌蒸餾水加至20 μL。PCR過(guò)程：40個(gè)循環(huán)，94 ℃，1 min；54 ℃，1 min；聚合72 ℃，1 min；延伸72 ℃，7 min。miR-196b-3p的相對(duì)表達(dá)使用公式2-ΔΔCt計(jì)算。

1.3.6 Western blot檢測(cè)

細(xì)胞加入蛋白裂解液以裂解細(xì)胞，雙辛酸(bicinchoninic acid，BCA)法檢測(cè)蛋白濃度。配制十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)，凝膠后行蛋白電泳，將凝膠中蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride，PVDF)，5%脫脂奶粉封閉3 h，分別使用相應(yīng)的一抗Ki67(1:1000)、PCNA1(1:900)、iASPP(1:1000)、ASPP1(1:1200)、ASPP2(1:1000)、GAPDH(1:8000)進(jìn)行孵育，孵育過(guò)夜后PBS洗滌3次，每次10 min，隨后使用HRP anti-rabbit IgG(1:10 000)室溫孵育1 h。使用化學(xué)發(fā)光液(electrochemical luminescence，ECL)進(jìn)行顯色?；叶戎凳褂肐mageJ V1.49軟件進(jìn)行分析。

1.3.7 螢光素酶報(bào)告基因分析

生物信息學(xué)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)miR-196-3p序列與ASPP2的3’-UTR區(qū)具有結(jié)合關(guān)系。將野生型的ASPP2 3’-UTR(WT- UTR)或突變型的ASPP2 3’-UTR(mut-UTR，已經(jīng)過(guò)點(diǎn)突變)分別插入到pGL3載體(Promega,Madison,WI,USA)的XbaI/FseI 位點(diǎn)。熒光素酶活性分析如下：使用雙基因轉(zhuǎn)染試劑(Thermo Fisher Scientific,UK)對(duì)細(xì)胞共轉(zhuǎn)染miR-mimic、WT-ASPP2 3’-UTR 或mut-ASPP2 3’-UTR，轉(zhuǎn)染時(shí)間為48 h。根據(jù)制造商的指示，用Dual-Glo熒光素酶檢測(cè)系統(tǒng)(Promega,Madison,WI,USA)進(jìn)行熒光素酶活性分析。使用熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證miR-196b-3p與ASPP2的關(guān)系。構(gòu)建野生型(WT)及突變型(mut)的ASPP2 3’-UTR并克隆到熒光素酶報(bào)告基因下游。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

本研究的實(shí)驗(yàn)均獨(dú)立重復(fù)3次，數(shù)據(jù)采用SPSS.22軟件進(jìn)行分析。結(jié)果表示為均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)，多組間使用單因素方差分析比較，組內(nèi)兩兩比較采用t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 OXT通過(guò)激活OXTR抑制卵巢癌細(xì)胞SKOV3的增殖活性

OXT、Atosiban+OXT和對(duì)照組3組的OXTR活性比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=28.842，P<0.05)，與對(duì)照組相比，OXT組中OXTR活性升高(P<0.05)，Atosiban+OXT組中OXTR活性顯著低于OXT組(P<0.05)，見(jiàn)圖1A。結(jié)果表明，OXT激活OXTR，當(dāng)使用OXTR的拮抗劑Atosiban處理細(xì)胞后，OXTR被激活的效率顯著降低。

OXT、Atosiban+OXT和對(duì)照組3組的細(xì)胞增殖活性比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=12.988，P<0.05)，與對(duì)照組相比，OXT組細(xì)胞增殖活性降低(P<0.05)，Atosiban+OXT組中細(xì)胞增殖活性顯著高于OXT組(P<0.05)，見(jiàn)圖1B。此外，OXT、Atosiban+OXT和對(duì)照組3組的Ki67與PCNA的蛋白水平比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Ki67：F=141.902，P<0.05；PCNA：F=140.959，P<0.05)，OXT組Ki67與PCNA的蛋白水平均低于對(duì)照組(均P<0.05)，Atosiban+OXT組Ki67與PCNA的蛋白水平均較OXT組升高(均P<0.05)，見(jiàn)圖1C—E。結(jié)果表明，OXT通過(guò)激活OXTR來(lái)抑制SKOV3細(xì)胞的增殖活性。

A：OXTR相對(duì)活性變化；B：細(xì)胞存活率變化；C：Ki67與PCNA的Western blot條帶；D：Ki67蛋白相對(duì)表達(dá)變化；E：PCNA蛋白相對(duì)表達(dá)變化。n=3，*P<0.05與對(duì)照組比較，#P<0.05與OXT組比較。

圖1 OXT激活OXTR抑制SKOV3細(xì)胞增殖活性

2.2 OXT通過(guò)激活OXTR提高卵巢癌細(xì)胞SKOV3中的Caspase3活性

OXT、Atosiban+OXT和對(duì)照組3組的Caspase3活性比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=26.676，P<0.05)，與對(duì)照組相比，OXT組中Caspase3的活性升高(P<0.05)，Atosiban+OXT組中Caspase3活性顯著低于OXT組(P<0.05)，見(jiàn)圖2A。結(jié)果表明，OXT激活Caspase3，當(dāng)使用OXTR的拮抗劑Atosiban時(shí)，Caspase3的活性降低。此外，OXT、Atosiban+OXT和對(duì)照組的ASPP1，ASPP2及iASPP蛋白水平比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(ASPP1：F=46.597，P<0.05；ASPP2：F=24.657，P<0.05；iASPP：F=18.021，P<0.05)，OXT組ASPP1和ASPP2的蛋白水平均高于對(duì)照組、ASPP抑制因子iASPP低于對(duì)照組(均P<0.05)；與OXT組相比，Atosiban+OXT組中ASPP2的蛋白水平下調(diào)(P<0.05)，但ASPP1及iASPP的水平無(wú)顯著變化(P>0.05)，見(jiàn)圖2B—E。結(jié)果表明，OXT激活OXTR可促進(jìn)SKOV3細(xì)胞的凋亡。

A：Caspase3活性變化；B：ASPP1、ASPP2及iASPP的Western blot條帶；C：ASPP1的相對(duì)表達(dá)變化；D：ASPP2的相對(duì)表達(dá)變化；E：iASPP的相對(duì)表達(dá)變化。n=3，*P<0.05與對(duì)照組比較，#P<0.05與OXT組比較。

圖2 OXT激活OXTR促進(jìn)SKOV3細(xì)胞凋亡

2.3 OXT下調(diào)卵巢癌細(xì)胞中miR-196b-3p的水平

A2780和SKOV3兩種細(xì)胞系miR-196b-3p水平在OXT、Atosiban+OXT和對(duì)照組3組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(A2780：F=76.406，P<0.05；SKOV3：F=45.874，P<0.05)，與對(duì)照組相比，OXT組中miR-196b-3p水平均顯著下調(diào)(均P<0.05)，當(dāng)使用OXTR的拮抗劑Atosiban時(shí)，miR-196b-3p的水平部分恢復(fù)，見(jiàn)圖3A—B。結(jié)果表明，OXT可抑制卵巢癌細(xì)胞中miR-196b-3p的水平。

A：A2780細(xì)胞中miR-196b-3p的相對(duì)水平變化；B：SKOV3細(xì)胞中miR-196b-3p的相對(duì)水平變化。n=3，

*P<0.05與對(duì)照組比較，#P<0.05與OXT組比較。

圖3 OXT激活OXTR抑制卵巢癌細(xì)胞中miR-196b-3p水平

2.4 miR-196b-3p mimic處理部分逆轉(zhuǎn)OXT的效果

檢測(cè)各組miR-196b-3p的表達(dá)變化，發(fā)現(xiàn)miR-196b-3p水平在control、OXT、OXT+miR-mimic、OXT+miR-mimic-NC組4組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=35.932，P<0.05)，與OXT組相比，OXT+miR-mimic可以顯著提高miR-196b-3p水平(P<0.05)，見(jiàn)圖4A。MTT結(jié)果發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞增殖活性在4組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=9.232，P<0.05)，與OXT組相比，OXT+miR-mimic組的增殖活性上調(diào)(P<0.05)，OXT+miR-mimic-NC組的增殖活性與OXT組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)圖4B。此外，Caspase3活性檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Caspase3活性在4組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=36.350，P<0.05)，與OXT組相比，OXT+miR-mimic組的Caspase3活性下調(diào)(P<0.05)；OXT+miR-mimic-NC組的Caspase3活性與OXT組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)圖4C。結(jié)果表明，OXT通過(guò)抑制miR-196b-3p水平調(diào)節(jié)卵巢癌細(xì)胞增殖與凋亡。

A：miR-196b-3p相對(duì)表達(dá)變化；B：細(xì)胞存活率變化；C：Caspase3相對(duì)活性變化。n=3，*P<0.05與control組比較，#P<0.05與OXT組比較。

圖4 miR-196b-3p mimic處理部分逆轉(zhuǎn)OXT的效果

2.5 ASPP2是miR-196b-3p的靶基因

miR-196b-3p水平在control、miR-mimic、miR-mimic-NC、miR-inhibitor和miR-inhibitor-NC組5組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=72.473，P<0.05)，與control組相比，miR-mimic可以顯著提高miR-196b-3p的水平(P<0.05)，而miR-inhibitor可以顯著抑制miR-196b-3p的水平(P<0.05)，見(jiàn)圖5A。檢測(cè)ASPP2的蛋白表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)ASPP2蛋白水平在5組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=83.013，P<0.05)，與control組相比，miR-mimic組的ASPP2表達(dá)下調(diào)(P<0.05)；miR-mimic-NC組的ASPP2表達(dá)與control組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)圖5B。對(duì)SKOV3細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-196b-3p inhibitor，24 h后檢測(cè)ASPP2的蛋白表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與control組相比，miR-inhibitor組的ASPP2表達(dá)上調(diào)(P<0.05)；miR-inhibitor-NC組的ASPP2表達(dá)與control組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)圖5B。熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)與control組相比，miR-196b-3p下調(diào)wild-ASPP2的3’-UTR水平，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=16.699，P<0.05)，見(jiàn)圖5C。然而與control組相比，miR-196b-3p對(duì)mut-ASPP2的3’-UTR水平無(wú)改變，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-0.065，P>0.05)，見(jiàn)圖5C。表明，在卵巢癌細(xì)胞中ASPP2是miR-196b-3p的下游靶基因。

以上結(jié)果表明，OXT介導(dǎo)的OXTR激活通過(guò)調(diào)節(jié)miR-196b-3p/ASPP2信號(hào)通路抑制卵巢癌細(xì)胞增殖并促進(jìn)其凋亡。

A:miR-196b-3p相對(duì)表達(dá)變化；B:ASPP2蛋白的相對(duì)表達(dá)變化；C:熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證ASPP2是miR-196b-3p的下游靶基因。WT：wild type；mut：mutant type；n=3,*P<0.05、&P<0.05、#P<0.05與control組比較。

圖5(續(xù))

3 討論

本研究首先探明OXT通過(guò)激活OXTR對(duì)卵巢癌細(xì)胞增殖與凋亡進(jìn)行調(diào)節(jié)。OXTR屬于G蛋白偶聯(lián)受體家族，在以往研究中，OXT通過(guò)激活OXTR可以發(fā)揮多種癌癥進(jìn)展的調(diào)節(jié)作用[4]，OXT被多方證實(shí)可作為婦科癌癥的候選藥物[4，17]。本研究確認(rèn)，OXT激活SKOV3細(xì)胞OXTR的同時(shí)，細(xì)胞增殖活性被抑制，而且細(xì)胞增殖標(biāo)記物Ki-67、PCNA蛋白的表達(dá)均減少，當(dāng)使用OXTR拮抗劑Atosiban時(shí)，Ki-67、PCNA蛋白水平部分恢復(fù)。因此，OXT通過(guò)激活OXTR抑制卵巢癌細(xì)胞增殖。進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)OXT導(dǎo)致Caspase3活性增加。檢測(cè)凋亡刺激蛋白家族成員(ASPP1、ASPP2和iASPP)的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)ASSP1及ASSP2的表達(dá)水平升高，iASSP的表達(dá)水平降低。ASPP1與ASPP2能與p53家族成員直接作用選擇性地促進(jìn)它們對(duì)促凋亡基因的轉(zhuǎn)錄活性[13]，從而抑制細(xì)胞增殖并促進(jìn)凋亡[18]。而iASPP是p53凋亡刺激蛋白抑制劑，研究發(fā)現(xiàn)iASPP在卵巢癌組織中表達(dá)上調(diào)[19]，且iASPP可抑制癌細(xì)胞凋亡[18]。在OXTR激活與卵巢癌細(xì)胞凋亡關(guān)系的研究中發(fā)現(xiàn)，使用OXTR拮抗劑Atosiban時(shí)，OXT對(duì)細(xì)胞Caspase3活性以及標(biāo)記分子ASPP2的表達(dá)的調(diào)節(jié)效果明顯減弱，而Atosiban對(duì)iASPP和ASPP1的表達(dá)影響不明顯，暗示OXTR激活對(duì)卵巢癌凋亡的作用可能通過(guò)ASPP2介導(dǎo)，而非ASPP1或iASPP。以上表明，OXT對(duì)卵巢癌細(xì)胞的增殖活性具有抑制作用，對(duì)細(xì)胞凋亡具有誘導(dǎo)作用。OXT激活OXTR可能通過(guò)上調(diào)ASSP2對(duì)卵巢癌細(xì)胞凋亡發(fā)揮促進(jìn)作用。

MiR-196b是一種關(guān)鍵性促癌miRNA。在卵巢上皮癌中miR-196b水平上調(diào)可促進(jìn)細(xì)胞的侵襲性[8- 9]。已有研究[9]發(fā)現(xiàn)在復(fù)發(fā)性卵巢上皮癌中miR-196b前體的3’端降解物miR-196b-3p的表達(dá)顯著升高。本研究發(fā)現(xiàn)miR-196b-3p在OXT刺激下的卵巢癌細(xì)胞中表達(dá)顯著降低，這與miR-196b-3p在子宮肌層中被OXT抑制[12]的結(jié)果有一致性。本研究在卵巢癌細(xì)胞中使用miR-196b-3p擬似物上調(diào)miR-196b-3p水平后，發(fā)現(xiàn)OXT介導(dǎo)的抑制增殖和促進(jìn)凋亡的效果均顯著減弱，即部分被逆轉(zhuǎn)。而JEONG等[10]發(fā)現(xiàn)miR-196b-3p可促進(jìn)前列腺癌進(jìn)程，這與本研究發(fā)現(xiàn)的miR-196b-3p在卵巢癌中的促癌效果相類似。表明，miR-196b-3p是OXT調(diào)節(jié)卵巢癌細(xì)胞增殖與凋亡的關(guān)鍵下游分子。

本研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)miR-196b-3p通過(guò)調(diào)控靶基因ASPP2參與OXT對(duì)卵巢癌細(xì)胞增殖與凋亡的調(diào)節(jié)。越來(lái)越多的證據(jù)表明，促癌miRNA通過(guò)靶向抑制抑癌基因參與調(diào)節(jié)癌細(xì)胞增殖、凋亡與血管生成[20]。多種miRNA在卵巢癌細(xì)胞或組織中有異位表達(dá)，并且發(fā)揮著調(diào)節(jié)功能[21-22]。例如，miR-614在卵巢癌組織與細(xì)胞中高表達(dá)，體外增加miR-614的胞內(nèi)水平可以促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞增殖并抑制凋亡，其內(nèi)在分子機(jī)制是miR-614抑制細(xì)胞分裂調(diào)節(jié)因子PPP2R2A的表達(dá)，并確定PPP2R2A是miR-614的靶基因[23]。本研究首先觀察到OXT負(fù)調(diào)節(jié)miR-196b-3p水平同時(shí)正調(diào)節(jié)ASPP2的表達(dá)，但是又進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)ASPP2受miR-196b-3p的負(fù)調(diào)節(jié)。使用生物信息學(xué)工具預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)miR-196b-3p可能的靶基因之一是ASPP2。并最終通過(guò)熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)首次驗(yàn)明卵巢癌細(xì)胞中ASPP2是miR-196b-3p的直接靶基因。因此，以上結(jié)果表明OXT介導(dǎo)的OXTR激活通過(guò)調(diào)節(jié)miR-196b-3p/ASPP2信號(hào)通路調(diào)節(jié)卵巢癌細(xì)胞的增殖與凋亡。

綜上，本研究證實(shí)OXT介導(dǎo)的OXTR激活抑制了卵巢癌細(xì)胞的生長(zhǎng)功能，并發(fā)現(xiàn)OXT通過(guò)抑制miR-196b-3p水平促進(jìn)p53凋亡刺激蛋白ASPP2的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)節(jié)著卵巢癌細(xì)胞的增殖及凋亡活性。