汪成 范舒舒 張思 黃文波 侯志偉

【摘要】 目的：探索一種可行的男科實驗室計算機輔助精液分析系統(tǒng)（Computer-aided Semen Analysis System，CASA）的質控方法。方法：參考第5版《世界衛(wèi)生組織人類精液分析實驗室技術手冊》推薦的分析方法和質控標準，分別使用高、低濃度的自制精液質控品和商品化質控珠對CASA的檢測結果進行一致性分析。同時由兩名實驗員使用CASA對18份精液樣本的濃度和活力進行雙盲分析，并繪制Bland-Altman圖對檢測結果進行比較分析。結果：自制精液質控品高、低濃度批內變異系數分別為CV4.0%、CV5.8%，質控珠高、低濃度批內分變異系數分別為CV7.8%、CV7.6%，均符合Levey-Jennings質控規(guī)則。Youden分析顯示兩種質控品的檢測結果均位于95%CI。Bland-Altman圖分析顯示，兩名實驗員對18份精液標本的濃度和活力檢測結果差值的絕對值均位于95%CI內，檢測結果一致性高。結論：CASA需要適當的質控方案保證其分析結果的準確性，本研究中無論是自制的精液質控品還是商品化質控珠，均能在CASA的精液濃度質控中起到良好的效果。在精子活力分析質控方面，CASA比傳統(tǒng)的人工分析方法能夠更加準確捕捉精子運動軌跡并提供更多精子運動信息。男科實驗室的CASA質量控制不僅需要嚴格執(zhí)行室內質控，還需要通過室間質評進一步保證儀器檢測結果的準確性。

【關鍵詞】 計算機輔助精液分析 質量保證 質量控制

Application and Quality Control of Computer-aided Semen Analysis System in the Andrology Laboratory/WANG Cheng， FAN Shushu， ZHANG Si， HUANG Wenbo， HOU Zhiwei. //Medical Innovation of China， 2020， 17（13）： -148

[Abstract] Objective： To explore a feasible method for quality control of computer-aided semen analysis （CASA） in the andrology laboratory. Method： With reference to the analytical methods and standards recommended in the 5th edition of WHO Laboratory Manual for the Examination and Processing of Human Semen， the consistency analysis of CASA system was conducted by using high and low concentrations of self-made semen quality control samples and commercial quality control beads. At the same time， the concentration and motility of 18 different semen samples were double-blind analyzed by two experimenters using CASA system， then the bland-altman graphs was drawn to compare the test results. Result： The variation coefficients of high and low concentration self-made semen quality control samples were CV4.0% and CV5.8%， respectively. The intra-batch variation coefficients of high and low concentration control beads were CV7.8% and CV7.6%， respectively. All the statistical results were conformed with the quality control principle of Levey-Jennings. Youden analysis showed that the detection results of the two germplasm controls were at 95%CI. Bland-altman graphs showed that the absolute value of the difference between the concentration and activity of 18 semen samples tested by two experimenters was within the 95%CI， and the consistency was high. Conclusion： The CASA system needs an appropriate quality control method to ensure the accuracy of the analysis results. In this study， both self-made semen quality control samples and commercial quality control beads can take effect in the semen concentration quality control of CASA. In the quality control of sperm motility analysis， CASA is more accurate than the traditional manual analysis method in capturing sperm motility track and providing more sperm motility information. The quality control of CASA in andrology laboratory not only needs to strictly implement the indoor quality control， but also needs to further ensure the accuracy of the instrument test results through the indoor quality assessment.

[Key words] Computer-aided semen analysis Quality assurance Quality control

First-authors address： North Guangdong Peoples Hospital， Shaoguan 512025， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2020.13.036

在我國隨著不孕不育癥的發(fā)病率不斷地增高，男科實驗室已經作為生殖中心不可或缺的一部分，其擔負的精液常規(guī)檢驗的結果不僅作為臨床醫(yī)生對男性生育力的判斷依據，同時還被作為患者治療效果檢驗和輔助生殖臨床方案制定的主要依據[1]。因此，男科實驗室檢驗結果的可重復性和穩(wěn)定性直接關系到患者的治療結局[2]。

現行我國男科實驗室的精液分析和質量控制的標準主要是參照世界衛(wèi)生組織編寫的《世界衛(wèi)生組織人類精液分析實驗室技術手冊》[3]。2010年最新出版的第5版WHO手冊在前4版手冊的基礎上，第一次提出了精液分析的質量控制和質量保證的概念[3]。過去10年間，男科實驗學高速發(fā)展，計算機輔助精液分析系統(tǒng)（CASA）作為WHO手冊推薦精液常規(guī)分析手段已經被廣泛應用于各個實驗室。截至目前，我國男科實驗室的精液分析仍然存在各種各樣問題。盡管有WHO手冊作為工作指南，但各個實驗室從使用的CASA儀器品牌，配套的精子計數板型號等硬件層面到實驗室精液分析方法和質量控制體系等軟件層面均存在顯著的差異[4]。這造成不同男科實驗室的精液常規(guī)檢測結果在廣大生殖中心之間不被相互采納的局面。這也導致患者到不同醫(yī)院就診時需要重復進行精液常規(guī)檢驗，無形中增加了患者的經濟負擔。因此，加強男科實驗室精液常規(guī)分析的質量控制，摸索符合不同實驗室自身實際情況的內部質量控制的方法成為男科實驗室發(fā)展的關注熱點[5]。本研究探討自制精液質控品和商品化質控珠在計算機輔助精液分析系統(tǒng)室內質量控制中的應用，通過不同的統(tǒng)計學方法驗證質控方案的可行性。同時，結合自身實驗室對計算機輔助精液分析系統(tǒng)使用過程中的經驗，探討提高CASA室內質量控制水平的辦法。男科實驗室精液檢測的質量保證與質量控制需要依靠實驗室內部質量控制（IQC）結合由國家人類精子庫技術培訓基地組織的精液分析外部質量控制（EQC）并行方案來保障?，F報道如下。

1 材料與方法

1.1 自制精液質控品 制備方法：收集2019年

3月于本中心男科實驗室進行精液常規(guī)檢驗，同時各項精液參數均正常的5～8份精液標本，充分混勻后制備成高、低濃度質控品[3]。ZZ-High靶值為65×106/mL，濃度范圍（60～69）×106/mL。ZZ-Low靶值為22.0×106/mL，濃度范圍（21.0～24.0）×106/mL。

1.2 精液濃度分析質控珠 使用Geoffrey微球懸浮液，高濃度Q05-300：濃度靶值40×106/mL，濃度范圍（35～46）×106/mL。低濃度Q04-300：濃度靶值21×106/mL，濃度范圍（18～24）×106/mL。

1.3 新鮮精液樣本分析 為保證實驗結果的穩(wěn)定和準確，選擇參與分析測試的人員為本中心男科實驗室從事精液質量分析的專業(yè)技術人員，均具備臨床檢驗技師資質，并在國家衛(wèi)生部人類精子庫技術培訓基地接受男科實驗室技術的崗位培訓，參與男科室內質控（IQC）和室間質控（EQC）3次以上，質控的結果均合格。兩名實驗員使用雙盲法同時對2019年3月在本中心男科實驗進行精液常規(guī)檢查的18份精液標本的精子濃度和活力進行評估。對每份精液樣本均進行重復評估，按WHO第5版手冊推薦的方法對兩次結果的差異進行評估，如果差異可以接受，則將兩次結果的平均值作為該份樣本的結果，如果差異超過由隨機誤差造成差異的最大值，則放棄結果重新評估兩份重復樣本，直至兩次結果的差異可以接受為止[3]。

1.4 精子評估方法 參照第五版《WHO人類精液檢查與處理實驗室手冊》收集、處理和分析精液標本。精液常規(guī)檢測采用江蘇瑞祺CFT-9201型精子質量分析系統(tǒng)和其配套的Geoffrey改良精子計數板。精子活力劃分如下，（1）前向運動精子（PR）：精子運動活躍、線性運動或在較大范圍內運動（不考慮運動速度）;（2）非前向運動精子（NP）：精子運動但不活躍，如精子在較小范圍內運動，精子頭部輕微移位或僅有尾部擺動;（3）完全不動精子（IM）：精子完全不動。利用攝像系統(tǒng)捕獲至少200條精子，精子濃度低的標本至少捕獲6個視野。如果在高倍顯微鏡下觀察到精液標本濃度過高（濃度>50×106/mL），則需對標本進行稀釋，以確保檢測的準確性[3]。

1.5 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 19.0軟件對各批次自制和商品化的質控品的CV值進行統(tǒng)計分析，計量資料用（x±s）表示，比較采用配對t檢驗及單因素方差分析;使用Medcalc軟件對相關變量繪制Bland-Altman圖和Youden圖對檢測結果進行分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 使用CASA對自制精液質控品和商品化質控珠的濃度分析 為保證分析結果的準確性，使用CASA對自制質控品和商品化質控品分別進行濃度連續(xù)18次檢測（重復分析18次）;對高、低濃度的自制質控品濃度分析結果的變異系數分別為4.0%和5.8%，對高、低濃度的商品化質控珠的濃度檢測結果變異系數分別為7.8%和7.6%，所得的CV值均小于10%，均符合Levey-Jennings質控原則，見表1;其中商品化質控珠與自制的混合精液質控品相比較，在顯微鏡下觀察分析時質控珠的背景更加干凈，更容易區(qū)分，計數結果也更加準確，見圖1。

2.2 不同精液質控品濃度檢測的Youden圖分析結果 94.4%（17/18）的商品化質控珠的檢測結果均位于95%CI內，88.9%（16/18）的自制質控品的檢測均位于95%CI內，見圖2。

2.3 Bland-Altman圖分析兩名實驗員對18份精液標本的濃度和活力檢測結果 精子濃度一致性界限為（7.7，-7.4），所有的數據點均處于95%CI內，在一致性界限范圍內，兩名實驗員的檢驗結果差值的絕對值最大為7.5×106/mL，此種差異在精子濃度分析中是可以接受的，見圖3。分析精子活動力時，由于百分率為非正太分布的特征，需先將其進行LN轉換，并用此數據作圖，得到一致性界限為（9.1，-8.3），同樣觀察到無數據點位于95%CI外，在一致性界限范圍內，差值的絕對值最大為7.7，對應點的百分率差值為2.0%，這種差異在精子活動率分析中是可以接受的，見圖4。對18份精液標本的分析結果進行配對t檢驗，實驗員-1、實驗員-2的精子濃度分別為（48.4±23.6）和（48.2±25.5）×106/mL，比較差異無統(tǒng)計學意義（t=0.02，P>0.05）;實驗員-1、實驗員-2的精子活力分別為（62.6±10.2）%和（62.2±11.9）%，比較差異無統(tǒng)計學意義（t=0.11，P>0.05），驗證了不同操作人員使用同一CASA得到檢測結果的一致性良好，CASA分析18份精液樣本濃度和活力的檢測結果見表2。

3 討論

男科實驗室的精液分析結果是臨床開展診斷和治療的基礎。目前，男科實驗室已經成為生殖醫(yī)學中心不可或缺的核心部門。20世紀80年代CASA問世之前，男科實驗室一直采用人工分析進行精液常規(guī)分析[6]。作為男科實驗室“紅寶書”的WHO手冊主要推薦使用血球計數池（牛鮑板計數板）作為精子的分析工具。由于人工精液分析過度依賴檢驗人員的經驗和主觀判斷。同時，血球計數池因其開放式的結構容易引起精液分析過程容易受到外界環(huán)境的影響，最終導致血球計數池對精子濃度的分析結果不穩(wěn)定，計數結果明顯高于實際值[5]。2010年出版的第5版WHO手冊推薦使用改良牛鮑板計數或是CASA完成精液常規(guī)分析[7-9]。CASA主要由電子計算機分析系統(tǒng)、相差顯微鏡、高分辨率攝像頭、專用的精子計數板等組成，是將先進的計算機信息技術和現代化的圖像識別技術相結合運用于男科實驗室精液分析。通過對精液標本進行圖像采集，信息化分析各項精子參數后得出檢驗報告。CASA的精液分析結果的客觀性和可重復性均優(yōu)于傳統(tǒng)的人工精液分析方法。隨著男科實驗學的高速發(fā)展，CASA已經成為我國男科實驗室精液分析的主要方法[10]。

盡管男科實驗室的精液分析方法學逐步統(tǒng)一，但是不同實驗室之間的精液分析結果仍然存在巨大的差異[11]。這導致各大生殖中心均不采納第三方實驗室的精液檢測報告，患者往往需要重復多次的進行精液常規(guī)分析，無形中增加了患者的經濟壓力和過度檢查的風險。究其原因，一方面是CASA分析系統(tǒng)的品牌和精子計數板的規(guī)格型號眾多，并且各廠家的技術路線不一致。另一方面，不同男科實驗室缺乏成熟可靠的精液分析質量控制的方案和完成相關質控所需的具有豐富統(tǒng)計學知識的實驗人員。同時，精液分析質量控制過程中所需的商品化質控珠、精子活力分析視頻和精子形態(tài)分析的預染片價格高昂且不易獲得。男科實驗室往往工作量巨大、難以再花費人力物力去完成復雜的精液質量控制流程。最后，缺乏權威機構提供標準化男科實驗室管理和質量控制體系的指導方案，精液分析技能考核培訓和繼續(xù)教育[12]。第5版WHO手冊第一次提出“質量控制”和“質量保證”的概念，并增加精液分析質量控制的相關章節(jié)，但是目前世界衛(wèi)生組織及國家衛(wèi)健委并未規(guī)定統(tǒng)一的質控標準品和質控結果的統(tǒng)計學分析方法[13]。因此，摸索符合自身實驗室條件的內部質量控制方案是男科實驗室持續(xù)改進的重要組成部分。

為了真實評估自制精液質控品和商品化質控珠在本中心男科實驗室CASA質量控制中的使用效果。本研究中所有的實驗步驟均遵照第5版手冊的規(guī)范，為了減少人為誤差對實驗結果的影響，進行一致性分析時每個樣本至少計數兩次，每個濃度的質控品均進行了18次檢測[3]。分析結果顯示，CASA對不同濃度的自制精液質控品和商品化質控珠進行濃度分析結果的批內CV均小于10%。Youden圖結果顯示，94.4%（17/18）的商品化質控珠的檢測結果均位于95%CI內，88.9%（16/18）的自制質控品的檢測均位于95%CI內，說明無論是自制的精液質控品還是商品化質控珠均能在CASA的精液濃度質控中起到良好的效果，進一步驗證了兩種不同質控品在CASA精液濃度分析質控中的一致性。同時在商業(yè)化質控珠和自制質控品的低濃度檢測中均出現1～2個結果位于95%CI外，屬于系統(tǒng)誤差，應從檢測前樣品是否充分混勻，檢測時檢測池的蓋板是否放置平整等方面尋找影響檢測結果準確性的原因。值得關注的是，商品化的質控珠雖然在精液分析時采集的圖像背景更加清晰，能被CASA更精準的識別。但是質控珠缺乏真實精液中的非精子成分，質控珠的靶值范圍較自制精液質控品的偏大。在精液分析過程中，質控珠主要是通過模擬精子頭部的灰度從而被CASA識別，而自制精液質控品需要通過實驗人員對圖像進行修以正提高分析結果的準確性。考慮到目前商品化質控珠的價格，對于普通男科實驗室依照WHO第5版手冊制備精液質控品是更加經濟和易于獲得的選擇。要注意的是，自制質控品需要添加防腐試劑以幫助精子抗凝集和長時間保存，在分裝和使用時需要充分振蕩混勻，避免反復凍融使用。

參與本實驗的技術人員均在同一家國家衛(wèi)生部人類精子庫技術培訓基地接受男科實驗室技術的崗位培訓，這有助減少因不同技術標準和規(guī)范帶來的差異。本研究結果顯示，兩名實驗員精子濃度、精子活力分析結果比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05），驗證了不同操作人員使用同一CASA得到檢測結果的一致性良好。值得探討的是，技術人員對CASA獲得的初始結果進行人工校正后能夠提高分析結果的準確性和一致性。在濃度分析方面主要是減少了非精子細胞對結果的干擾，讓精子濃度結果更加接近實際值。在進行精子活力分析時，當精液標本的濃度超過50×106/mL，應對標本進行稀釋。因為精子濃度過高通常會增加精子碰撞的頻率，并可能由此產生錯誤的精子活力評估結果[14]。由于CASA配備了高分辨的攝像頭和信息化圖像處理系統(tǒng)，在精子活力分級和識別上具有明顯的優(yōu)勢。同時，CASA增設了：VCL（曲線速度，單位：μm/s）、VSL（直線速度，單位：μm/s）、VAP（平均路徑速度，單位：μm/s）、ALH（精子頭側擺幅度，單位：μm）、LIN（直線性，曲線軌跡的直線性，即VSL/VCL）、WOB（擺動性，精子頭沿其實際軌跡的空間平均路徑擺動的尺度，即VAP/VCL）、STR（前向性，空間平均路徑的直線性，即VSL/VAP）、BCF（鞭打頻率，單位：Hz）、MAD（平均移動角度，單位：度）等9項精子運動軌跡指標，能夠提供更詳細的精子運動的信息，為臨床的不孕不育治療提供依據[3]。

CASA系統(tǒng)是一個由多個部件組成的綜合性分析平臺，在日常男科精液分析中需要將質量保障應貫穿整個CASA使用過程中。分析前要調整好相差顯微鏡的光線強弱和載物臺，確保精子呈現合適的對比度和優(yōu)秀的圖像質量，這有助于CASA對精子的準確識別。分析時確保待檢的精液標本必須完全液化，按照精子計數板檢測要求的樣本體積使用微量移液器準確加住充分混勻的精液，避免產生氣泡或吸入為液化的顆粒組織防止精子計數板因蓋板不平造成的樣本偏差[15]。CASA分析捕獲至少200條精子，精子濃度低的標本至少捕獲6個視野。精液標本分析過程中，顯微鏡應按“之”字形進行隨機的圖像采集，避免重疊和重復采集。有研究發(fā)現，精子計數板的計數池的深度直接影響CASA精液分析的結果準確性[15]，男科實驗室應請第三方檢測機構對實驗室中使用的分析天平、微量移液器、精子計數板和相差顯微鏡等設備進行年度校正。一旦儀器設備與相關配件耗材出現異常應及時進行維修與更換[3]。

精液常規(guī)檢驗是男科實驗室的主要檢查項目之一，其結果對患者治療結果的重要性不言而喻。隨著生殖醫(yī)學的高速發(fā)展，日常男科工作中僅僅參照第5版WHO手冊對各項精液參數進行常規(guī)的Xbar和S圖的月均值分析，主要反映的是實驗室技術人員自身和技術人員之間的差異[3，16]。儀器的損耗和異常、質控品的質量等問題并不能全面的體現，Bland-Altman法對男科實驗室質量控制中使用的不同方法和測量結果的一致性有很好的應用價值。但不應忽視Bland-Altman法在實際應用中需要具備的條件：（1）數據點呈水平帶狀分布，即差值和均值之間不存在任何線性或非線性關系，使用前需要通過差值與均值的回歸分析進行判定。（2）數據點分散在分布于等寬的水平區(qū)域內，即滿足差值的方差齊同。（3）差值的分布呈正態(tài)分布，通過直方圖和正態(tài)性檢驗判定[17]。合理選用適合的統(tǒng)計學方法才能對提高男科實驗室的質量控制水平提供幫助。

標準化的男科實驗室精液分析技術與穩(wěn)定的質量控制體系是我國男科實驗室持續(xù)改進的重點內容和方向。需要廣大的男科實驗室積極投入力量摸索適合自身實驗室條件的合理方案。本中心男科實驗室日常嚴格執(zhí)行WHO第5版的質量控制指南，完成各項檢驗項目的儀器和人員質量控制[18-19]。同時，參加了由廣東省人類精子庫牽頭舉辦的輔助生殖男科實驗室外部質量控制項目[20]。通過內外結合的方法不斷提高本中心男科實驗室的技術能力和水平，為人民群眾的生殖健康提供技術服務和保障。

綜上所述，CASA需要適當的質控方案保證其分析結果的準確性，本研究中無論是自制的精液質控品還是商品化質控珠，均能在CASA的精液濃度質控中起到良好的效果。在精子活力分析質控方面，CASA比傳統(tǒng)的人工分析方法能夠更加準確捕捉精子運動軌跡并提供更多精子運動信息。最后，男科實驗室的CASA質量控制不僅需要嚴格執(zhí)行室內質控，還需要通過室間質評進一步保證儀器檢測結果的準確性。

參考文獻

[1] Joffe M，甄威，鄭芹珠，等.精液質量分析與正常生育力的概念[J].國際生殖健康/計劃生育雜志，2010，29（3）：195-198.

[2] Jequier A M.Is quality assurance in semen analysis still really necessary？ A clinicians viewpoint[J].Hum Reprod，2005，20（8）：2039-2042.

[3]國家人口和計劃生育委員會科學技術研究所譯.世界衛(wèi)生組織人類精液檢查與處理實驗室手冊[M].5版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2011：2-192.

[4]陳振文，谷龍杰.精液分析標準化和精液質量評估-WHO《人類精液檢查與處理實驗室手冊》（第5版）出版[J].中國計劃生育學雜志，2012，20（1）：58-62.

[5]陸金春，黃宇烽，呂年青.《世界衛(wèi)生組織人類精液分析實驗室技術手冊》與我國男科實驗室現狀[J].中華男科學雜志，2010，16（10）：867-871.

[6]蔣召志，郭路生.計算機輔助精子分析的質量控制措施[J].吉林醫(yī)藥學院學報，2014，35（3）：211-213.

[7]高選，劉曉丹，趙麗娟，等.精液分析中精子濃度室內質量控制方法的研究[J].中華男科學雜志，2012，18（3）：235-238.

[8]陸金春.精液分析標準化與質量控制所面臨的問題和解決措施[J].臨床檢驗雜志，2016，34（9）：641-645.

[9]黃宇烽，陸金春.精子質量參數分析的標準化與質量控制的研究進展[J].中華男科學雜志，2007，13（11）：963-968.

[10]劉永杰，劉麗麗，金銳，等.計算機輔助精液分析的內部質量控制[J].寧夏醫(yī)學雜志，2008，30（7）：609-610.

[11]劉竟，劉睿智.男科實驗室檢查技術的質量控制[J].中國男科學雜志，2009，23（7）：67-69，72.

[12] Lu J C，Zhang H Y，Hu Y A，et al.A survey on the status of semen analysis in 118 laboratories in China[J].Asian J Androl，2010，12（1）：104-110.

[13] Pacey A A.Quality assurance and quality control in the laboratory andrology[J].Asian J Androl，2010，12（1）：21-25.

[14] Keel B A.How reliable are results from the semen analysis？[J].Fertil Steril，2004，82（1）：41-44.

[15]范久波，孫莉，劉海菊，等.不同計數板對計算機輔助精子分析系統(tǒng)檢測影響探討[J].現代檢驗醫(yī)學雜志，2014，29（4）：116-118.

[16]舒金輝，馮貴雪，甘賢優(yōu)，等.Xbar質控規(guī)則在每月精液分析室內質量保證中的應用[J].中國男科學雜志，2014，28（8）：35-38，42.

[17]薩建，劉桂芬.定量測量結果的一致性評價及Bland-Altman法的應用[J].中國衛(wèi)生統(tǒng)計，2011，28（4）：409-411，413.

[18] Mallidis C，Cooper T G，Hellenkemper B，et al.Ten years experience with an external quality control program for semen analysis[J].Fertil Steril，2012，98（3）：611-616.e4.

[19]王奇玲，唐運革，鄧順美，等.精液分析區(qū)域性外部質量控制研究[J].生殖與避孕，2015，35（12）：888-892.

[20]張欣宗，王奇玲，羅璐璐，等.廣東地區(qū)男科實驗室的現狀分析[J].廣東醫(yī)學，2018，39（S2）：213-216.

（收稿日期：2020-02-03） （本文編輯：董悅）