魏盤妹 朱靖 陳天文

【摘要】 目的：研究長(zhǎng)鏈非編碼RNA-HOTAIR在曲妥珠單抗耐藥細(xì)胞株與曲妥珠單抗敏感細(xì)胞株中的表達(dá)差異。方法：選取乳腺癌細(xì)胞系SK-BR-3-TS，通過間歇大劑量沖擊和逐步增加劑量相結(jié)合的方法，誘導(dǎo)建立曲妥珠單抗耐藥細(xì)胞系SK-BR-3-TR。qRT-PCR檢測(cè)SK-BR-3-TS和SK-BR-3-TR細(xì)胞HOTAIR的表達(dá)情況。結(jié)果：在成功誘導(dǎo)及穩(wěn)定培養(yǎng)乳腺癌曲妥珠單抗耐藥細(xì)胞系SK-BR-3-TR中，HOTAIR RNA表達(dá)水平（2.216±0.332），明顯高于曲妥珠單抗敏感細(xì)胞株SK-BR-3-TS的（0.326±0.050），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.000 6）。結(jié)論：曲妥珠單抗耐藥細(xì)胞株SK-BR-3-TR中HOTAIR表達(dá)明顯上調(diào)。

【關(guān)鍵詞】 乳腺癌 HOTAIR 曲妥珠單抗 耐藥 長(zhǎng)鏈非編碼RNA

doi：10.14033/j.cnki.cfmr.2020.12.001 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1674-6805（2020）12-000-03

Study on the Expression Changes of Long Non-coding RNA-HOTAIR in Trastuzumab Resistant Cell Lines/WEI Panmei， ZHU Jing， CHEN Tianwen. //Chinese and Foreign Medical Research， 2020， 18（12）： -3

[Abstract] Objective： To study the expression difference of long non-coding RNA-HOTAIR in trastuzumab resistant cell lines and trastuzumab sensitive cell lines. Method： The breast cancer cell line SK-BR-3-TS was selected and the trastuzumab resistant cell line SK-BR-3-TR was induced by the combination of intermittent large dose shock and gradually increasing dose. HOTAIR expression was detected in the SK-BR-3-TS and SK-BR-3-TR cell lines by qRT-PCR. Result： In the successful induction and stable culture of trastuzumab resistant breast cancer cell line SK-BR-3-TR， the expression level of HOTAIR RNA （2.216±0.332） was significantly higher than （0.326±0.050） of trastuzumab sensitive cell line SK-BR-3-TS， and the difference was statistically significant

（P=0.000 6）. Conclusion： The expression of HOTAIR is significantly up-regulated in trastuzumab resistant breast cancer cell lines SK-BR-3-TR.

[Key words] Breast cancer HOTAIR Trastuzumab Drug resistance Long non-coding RNA

First-authors address： Huazhong University of Science & Technology Union Shenzhen Hospital， Shenzhen 518000， China

HER2陽(yáng)性分子亞型乳腺癌占所有乳腺癌的20%～25%，此亞型乳腺癌因具有高增殖能力、富侵襲性、易遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等生物學(xué)特征，患者預(yù)后較差[1]。曲妥珠單抗耐藥是HER2陽(yáng)性乳腺癌治療失敗的重要因素之一，深入研究曲妥珠單抗耐藥機(jī)制，尋找潛在治療靶點(diǎn)，克服其耐藥是改善HER2陽(yáng)性乳腺癌患者生存的重要途徑[2]。近年來，長(zhǎng)鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）與惡性腫瘤的關(guān)系研究已成為腫瘤研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)之一，與惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展及藥物抵抗有關(guān)[3]。同源異形盒轉(zhuǎn)錄反義RNA（HOX transcript antisense RNA，HOTAIR）是一種包含2 158個(gè)核苷酸的基因間長(zhǎng)鏈非編碼RNA。研究表明，HOTAIR與乳腺癌的發(fā)生發(fā)展、腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移及患者預(yù)后相關(guān)[4-5]。近些年來，有多項(xiàng)體外研究及回顧性臨床研究結(jié)果提示，HOTAIR與肺癌、宮頸癌、卵巢癌鉑類化療耐藥相關(guān)[6-8]。在乳腺癌中，一項(xiàng)研究提示，HOTAIR在多個(gè)ER陽(yáng)性、他莫昔芬耐藥乳腺癌細(xì)胞系及乳腺癌他莫昔芬治療失敗的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移組織標(biāo)本中均高表達(dá)[9]，進(jìn)一步體外研究揭示，HOTAIR在雌激素剝奪的乳腺癌他莫昔芬耐藥細(xì)胞株中仍然高表達(dá)，通過上調(diào)耐藥細(xì)胞ER受體表達(dá)參與他莫昔芬耐藥。然而，HOTAIR與乳腺癌曲妥珠單抗耐藥的相關(guān)研究目前未見報(bào)道，本研究旨在檢測(cè)曲妥珠單抗耐藥細(xì)胞株中HOTAIR的表達(dá)情況，從而為進(jìn)一步研究HOTAIR與乳腺癌曲妥珠單抗耐藥的相關(guān)性機(jī)制提供初步理論基礎(chǔ)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

選取乳腺癌細(xì)胞系SK-BR-3-TS，通過間歇大劑量沖擊和逐步增加劑量相結(jié)合的方法，誘導(dǎo)建立曲妥珠單抗耐藥細(xì)胞系SK-BR-3-TR。qRT-PCR檢測(cè)SK-BR-3-TS和SK-BR-3-TR細(xì)胞HOTAIR的表達(dá)，MTT法檢測(cè)兩種細(xì)胞模型腫瘤細(xì)胞的增殖活性，具體如下。

1.1 SK-BR-3-TR細(xì)胞的制備及穩(wěn)定培養(yǎng)

SK-BR-3細(xì)胞系來自美國(guó)ATCC公司，曲妥珠單抗（Trastazumab）來自中國(guó)上海羅氏制藥有限公司。采用間隙大劑量沖擊和逐步增加劑量相結(jié)合的方法，誘導(dǎo)建立曲妥珠單抗耐藥SK-BR-3-TR細(xì)胞模型，具體如下：（1）取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期SK-BR-3-TS細(xì)胞，在完全培養(yǎng)基中加入0.5 μg/ml（約10倍的50%抑制濃度）曲妥珠單抗，直至細(xì)胞能在0.5 μg/ml曲妥珠單抗條件下穩(wěn)定生長(zhǎng);（2）之后逐步增加藥物濃度，使細(xì)胞依次在0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0 μg/ml曲妥珠單抗環(huán)境下穩(wěn)定生長(zhǎng)和傳代;（3）誘導(dǎo)細(xì)胞在8 μg/ml曲妥珠單抗環(huán)境下穩(wěn)定生長(zhǎng)和傳代1個(gè)月后，獲得SK-BR-3-TR細(xì)胞;（4）之后將SK-BR-3-TR細(xì)胞在含4.0 μg/ml完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)。整個(gè)耐藥誘導(dǎo)時(shí)間約7個(gè)月。

1.2 SK-BR-3-TR細(xì)胞的鑒定

MTT法檢測(cè)不同濃度曲妥珠單抗干預(yù)下SK-BR-3-TS和SK-BR-3-TR細(xì)胞增殖能力。（1）種板：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期SK-BR-3-TS和SK-BR-3-TR細(xì)胞，胰酶消化，血清終止反應(yīng)，離心去上清，完全培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，血球計(jì)數(shù)板計(jì)算細(xì)胞數(shù)，以

3 000個(gè)/孔接種于96孔板;（2）加藥：培養(yǎng)24 h、細(xì)胞貼壁后去上清，加入含有曲妥珠單抗?jié)舛人幬锏耐耆囵B(yǎng)基，200 μl/孔，其中藥物終濃度分別為0、2、4、6 μg/ml和8 μg/ml，其中0 μg/ml為對(duì)照組，不含細(xì)胞的完全培養(yǎng)基為調(diào)零孔，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔;（3）加入MTT：培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h后，加入MTT工作液，20 μl/孔，其終濃度為5 μg/ml，培養(yǎng)箱內(nèi)避光孵育4 h;（4）溶解：取出培養(yǎng)板，避光去上清，每孔加入150 μl DMSO，避光振蕩溶解5 min;（5）檢測(cè)：酶標(biāo)儀中，490 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)吸光值;（6）分析：取每組吸光值平均值，繪制細(xì)胞活性曲線。細(xì)胞增殖率按照以下公式計(jì)算：增殖率（或者細(xì)胞活性）=（試驗(yàn)組OD值-調(diào)零孔OD值）/（對(duì)照組OD值-調(diào)零孔OD值）。

按照Trizol Reagent說明書進(jìn)行細(xì)胞總RNA的提取，對(duì)比RNA的變化。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

本研究數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析和處理，計(jì)量資料以（x±s）表示，采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，采用字2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 曲妥珠單抗耐藥細(xì)胞SK-BR-3-TR的成功誘導(dǎo)和穩(wěn)定培養(yǎng)

在間歇大劑量沖擊過程中，首先誘導(dǎo)出能夠在較低濃度曲妥珠單抗下繁殖、穩(wěn)定生長(zhǎng)傳代的耐藥克隆;之后逐步增加曲妥珠單抗劑量，細(xì)胞再次經(jīng)歷凋亡、耐藥克隆形成并生長(zhǎng)過程，直至篩選出能在8 μg/ml曲妥珠單抗環(huán)境下穩(wěn)定生長(zhǎng)的細(xì)胞克隆，見圖1。

2.2 不同濃度曲妥珠單抗干預(yù)下SK-BR-3-TS和SK-BR-3-TR細(xì)胞活性檢測(cè)

MTT法檢測(cè)結(jié)果表明，不同濃度曲妥珠單抗作用24 h后，SK-BR-3-TS細(xì)胞增殖能力隨藥物濃度升高而逐漸降低，而SK-BR-3-TR細(xì)胞增殖活性隨藥物濃度升高未發(fā)生明顯變化。與對(duì)照組相比，4 μg/ml作用24 h后，SK-BR-3-TS活性降低接近40%（0.63±0.03），而SK-BR-3-TR細(xì)胞未發(fā)生顯著變化（0.94±0.05）;進(jìn)一步升高度曲妥珠單抗?jié)舛戎? μg/ml對(duì)SK-BR-3-TR細(xì)胞增殖活性仍無(wú)顯著影響（0.84±0.03），但SK-BR-3-TS活性進(jìn)一步被降低（0.19±0.01），見圖2。

2.3 SK-BR-3-TR中HOTAIR的RNA表達(dá)水平明顯上調(diào)

在本試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，HOTAIR的表達(dá)水平在曲妥珠單抗敏感細(xì)胞株SK-BR-3-TS中較低（0.326±0.050），而在曲妥珠單抗耐藥細(xì)胞株SK-BR-3-TR中其表達(dá)量明顯上調(diào)（2.216±0.332），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.000 6），見圖3。

3 討論

成功誘導(dǎo)及穩(wěn)定培養(yǎng)曲妥珠單抗耐藥乳腺癌細(xì)胞系，是開展耐藥相關(guān)研究的基礎(chǔ)。Nahta等[9]應(yīng)用大劑量（4 μg/ml和8 μg/ml，80倍和160倍的50%抑瘤濃度）持續(xù)沖擊誘導(dǎo)SK-BR-3-TS細(xì)胞3個(gè)月的方法，成功獲得曲妥珠單抗耐藥細(xì)胞模型。本試驗(yàn)在預(yù)試驗(yàn)期間，采用上述方法誘導(dǎo)細(xì)胞耐藥，耐藥克隆形成密度低，耐藥細(xì)胞集落少，后來改良采用間歇大劑量沖擊聯(lián)合逐步增加劑量（初始劑量0.5 μg/ml，10倍的50%抑瘤濃度，階梯式增加2倍濃度直至8 μg/ml）的方法，同時(shí)誘導(dǎo)過程中根據(jù)細(xì)胞克隆形成情況，間歇地往細(xì)胞培養(yǎng)液中補(bǔ)充一定量的親代細(xì)胞，整個(gè)誘導(dǎo)時(shí)間6個(gè)月，于含4 μg/ml曲妥珠單抗培養(yǎng)液中穩(wěn)定培養(yǎng)1個(gè)月，成功獲得及穩(wěn)定培養(yǎng)曲妥珠單抗獲得性耐藥細(xì)胞系SK-BR-3-TR，此結(jié)果證實(shí)，間歇大劑量沖擊和逐步增加劑量相結(jié)合的方法可成功誘導(dǎo)SK-BR-3-TS對(duì)曲妥珠單抗耐藥。這為下一步研究奠定了基礎(chǔ)。

長(zhǎng)鏈非編碼RNA是指一類長(zhǎng)度超過200個(gè)核苷酸，無(wú)蛋白質(zhì)編碼功能但具有表觀遺傳調(diào)控等多個(gè)生物學(xué)功能的RNA分子，與惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展及藥物抵抗有關(guān)[3，10-11]。HOTAIR是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)具有反式轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用的長(zhǎng)鏈非編碼RNA，長(zhǎng)約2 158 nt，位于哺乳動(dòng)物基因組12q上HOXC位點(diǎn)[12]。Rinn等[13]首次發(fā)現(xiàn)HOTAIR通過表觀遺傳學(xué)調(diào)控基因的表達(dá)，作用方式類似于腳手架。一方面，HOTAIR 5端結(jié)合染色質(zhì)多梳蛋白抑制復(fù)合體（polycomb repressive complex 2，PRC2）。PRC2主要由甲基轉(zhuǎn)移酶EZH2、SUZ12和EED3個(gè)亞基組成，可介導(dǎo)H3K27的三甲基化進(jìn)而沉默特定基因的轉(zhuǎn)錄。另一方面，HOTAIR3端可結(jié)合組蛋白去甲基化酶1（lysinespecific demethylase 1， LSD1）復(fù)合體（LSDl/CoREST/REST），介導(dǎo)H3K4me2的去甲基化，調(diào)節(jié)靶基因的轉(zhuǎn)錄激活。乳腺癌體外研究及全基因組學(xué)研究結(jié)果提示，HOTAIR通過募集PRC2和LSD1復(fù)合體到乳腺癌細(xì)胞靶基因啟動(dòng)子區(qū)，導(dǎo)致包括TGF-β、JAK/STAT、PI3K/AKT、PTEN等信號(hào)通路相關(guān)基因在內(nèi)的850多個(gè)基因表達(dá)發(fā)生變化，促進(jìn)了乳腺癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移[4]。另有研究提示，HOTAIR還參與了乳腺癌上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化進(jìn)程，且與乳腺癌細(xì)胞干性維持有關(guān)[14-17]。Li等[18]在人喉鱗狀細(xì)胞癌模型中研究發(fā)現(xiàn)，HOTAIR能引起PTEN甲基化，下調(diào)PTEN蛋白表達(dá)，從而導(dǎo)致PI3K/AKT通路活性增強(qiáng)，促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移。

本課題應(yīng)用HER2陽(yáng)性、曲妥珠單抗敏感的乳腺癌細(xì)胞系SK-BR-3成功誘導(dǎo)及穩(wěn)定培養(yǎng)曲妥珠單抗獲得性耐藥細(xì)胞SK-BR-3-TR，通過檢測(cè)發(fā)現(xiàn)耐藥細(xì)胞較親代細(xì)胞HOTAIR表達(dá)明顯上調(diào)，這提示HOTAIR可能在SK-BR-3-TR細(xì)胞曲妥珠單抗耐藥中發(fā)揮作用。這一結(jié)果為進(jìn)一步探討HOTAIR與乳腺癌曲妥珠單抗耐藥的關(guān)系及分子機(jī)制提供了初步的理論依據(jù)。

參考文獻(xiàn)

[1] Slamon D J，Clark G M，Wong S G，et al.Human breast cancer：correlation of relapse and survival with amplification of the HER-2/neu oncogene[J].Science，1987，235（4785）：177-182.

[2] de Melo Gagliato D，Jardim D L，Marchesi M S，et al.Mechanisms of resistance and sensitivity to anti-HER2 therapies in HER2+breast cancer[J].Onctotarget，2016，7（39）：64431-64446.

[3] Zhou X L，Chen J，Tang W R.The molecular mechanism of HOTAIR in tumorigenesis，metastasis，and drug resistance[J].Acta Biochim Biophys Sin，2014（12）：12.

[4] Gupta R A，Shah N，Wang K C，et al.Long non-coding RNA HOTAIR reprograms chromatin state to promote cancer metastasis[J].Nature，2010，464（7291）：1071-1076.

[5] De Leeneer K，Claes K.Non Coding RNA Molecules as Potential Biomarkers in Breast Cancer[J].Advances in Experimental Medicine and Biology，2015（867）：263-275.

[6] Liu Z L，Sun M，Lu K H，et al.The long noncoding RNA HOTAIR contributes to cisplatin resistance of human lung adenocarcinoma cells via downregualtion of p21（WAF1/CIP1） expression[J].PLoS ONE，2017，8（10）：e77293.

[7] Li J，Wang Y，Dong R F，et al.HOTAIR enhanced aggressive biological behaviors and induced radio-resistance via inhibiting p21 in cervical cancer[J].Tumour biology：the Journal of the International Society for Oncodevelopmental Biology and Medicine，2015，36（5）：3611-3619.

[8] Teschendorff A E，Lee S H，Jones A，et al.HOTAIR and its surrogate DNA methylation signature indicate carboplatin resistance in ovarian cancer[J].Genome Medicine，2015，7（1）：108.

[9] Nahta R.P27（kip1） down-regulation is associated with trastuzumab resistance in breast cancer cells[J].Cancer Research，2004，64（11）：3981-3986.

[10] Jiang C，Yang Y，Yang Y，et al.Long Noncoding RNA （lncRNA） HOTAIR Affects Tumorigenesis and Metastasis of Non-Small Cell Lung Cancer by Upregulating miR-613[J].Oncology Research Featuring Preclinical & Clinical Cancer Therapeutics，2018，26（5）：725-734.

[11] Prensner J R，Chinnaiyan A M.The Emergence of lncRNAs in Cancer Biology[J].Cancer Discovery，2011，1（5）：391.

[12] Cai B.HOTAIR：a cancer-related long non-coding RNA[J].Neoplasma，2014，61（4）：379-391.

[13] Rinn J L，Kertesz M，Wang J K，et al.Functional Demarcation of Active and Silent Chromatin Domains in Human HOX Loci by Noncoding RNAs[J].Cell，2007，129（7）：1311-1323.

[14] Pádua A C，F(xiàn)onseca A S，Muys B R，et al.Brief report：The lincRNA Hotair is required for epithelial-to-mesenchymal transition and stemness maintenance of cancer cell lines[J].Stem Cells （Dayton，Ohio），2013，31（12）：2827-2832.

[15] Zhao Z J，Li S，Song E W，et al.The roles of ncRNAs and histone-modifiers in regulating breast cancer stem cells[J].Protein & Cell，2016，7（2）：89-99.

[16]楊韜，李俊堂，王麗娟，等.干涉lncRNAs HOTAIR對(duì)人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231的影響[J].細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志，2012，28（1）：97-98.

[17] Zhang H Y，Cai K，Wang J，et al.MiR‐7，Inhibited Indirectly by LincRNA HOTAIR， Directly Inhibits SETDB1 and Reverses the EMT of Breast Cancer Stem Cells by Downregulating the STAT3 Pathway[J].Stem Cells，2014，32（11）：2858-2868.

[18] Li D D，F(xiàn)eng J P，Wu T Y，et al.Long intergenic noncoding RNA HOTAIR is overexpressed and regulates PTEN methylation in laryngeal squamous cell carcinoma[J].The American Journal of Pathology，2013，182（1）：64-70.

（收稿日期：2019-12-17） （本文編輯：桑茹南）